覃國新，王海軍，何潔，陳泳锨，周其峰，李慧玲，勞水兵，羅麗紅，莫仁甫，唐莉，陸瑋璠，韋宇寧

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所，南寧 530007）

玉米赤霉烯酮(ZEN)又稱為F-2毒素，主要是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的一種非甾體霉菌毒素，不僅具有致癌性、雌激素樣效應(yīng)[1]，而且對(duì)神經(jīng)、心臟、腎臟等產(chǎn)生毒害[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全球范圍內(nèi)真菌毒素每年污染約25%的糧食作物及其制品，尤其以大米、花生、黃豆、玉米等食品和食品原料的污染最為嚴(yán)重[3]，且霉變的玉米、高粱、大麥、小麥等谷類作物易發(fā)生ZEN 污染[4-5]。若污染了ZEN 的食品進(jìn)入人體，將危害人們的健康，所以糧食中ZEN 等真菌毒素污染物的早期快速篩查、確證檢測尤為重要。

為了控制ZEN污染食品帶來的危害，許多國家規(guī)定了食品中ZEN的限量值，如意大利規(guī)定在谷物和谷類產(chǎn)品中ZEN 的最大含量不能超過100 mg/kg；澳大利亞規(guī)定ZEN 在谷物中的最大限量值不能超過50 mg/kg[6]；我國國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定，谷物及其制品中ZEN 的最大限量值為60 mg/kg。

目前，糧谷類食品中玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]等，其中以高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛。在GB 5009.209—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》中，糧谷類食品檢測ZEN的樣品處理采用免疫親和柱凈化。該方法特異性高，富集能力強(qiáng)，凈化效果好，但上樣、淋洗、洗脫等較繁瑣，難以滿足大批量樣品的高通量檢測需求。

多功能針式過濾器凈化是基于QuEChERS 原則[13]，將凈化材料(PSA、C18、GCB 等)填充于帶有濾膜的一次性注射針管中，樣品提取溶液以一定速度通過該針管，凈化和過濾一步完成。與免疫親和柱凈化相比，該方法簡單、快速，適合大批量樣品的檢測分析。近年來，多功能針式過濾器凈化技術(shù)用于食品中有毒有害物質(zhì)檢測的樣品處理已有報(bào)道[14-15]，筆者曾采用多功能針式過濾器凈化處理樣品，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中克百威和涕滅威殘留[16]，該方法可以有效縮短樣品凈化時(shí)間，從而提高檢測效率，具有操作簡單、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。目前多功能針式過濾器凈化技術(shù)用于大米和花生中ZEN 的檢測未見報(bào)道。筆者基于多功能針式過濾器凈化技術(shù)，采用乙腈提取，經(jīng)多功能針式過濾器通過式凈化，建立了超高效液相色譜法檢測大米和花生中ZEN的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLC H-Class型，美國沃特世公司。

電子天平：BP211D 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

旋渦振蕩器：3340025型，德國IKA公司。

低速臺(tái)式離心機(jī)：TDZ5-WS 型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

多功能針式過濾器：內(nèi)含150 mg 硫酸鎂(MgSO4)、50 mg 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、50 mg十八烷基鍵合相硅膠(C18)，天津阿爾塔科技有限公司。

玉米赤霉烯酮對(duì)照品：100 μg/mL，批號(hào)為STD#4012-1，青島普瑞邦生物工程有限公司。

乙腈：色譜純，賽默飛世爾(中國)科技有限公司。

氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司。

大米、花生樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm ×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；流動(dòng)相：甲醇-乙 腈-水(體 積 比 為8∶46∶46)，流 量 為0.3 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測器：熒光檢測器；檢測波長：激發(fā)波長為274 nm，發(fā)射波長為440 nm；進(jìn)樣體積：2.0 μL。

1.3 樣品處理

提?。喝〈竺?、花生樣品，粉碎并混勻，準(zhǔn)確稱取2.00 g，加入約2 mL 水浸濕，加入20.0 mL 乙腈，渦旋提取1 min，再加入3 g 氯化鈉，繼續(xù)渦旋提取1 min，以4 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清液，待凈化。

凈化：取上述上清液2 mL 以2 滴/s 的速度通過多功能針式過濾器于進(jìn)樣瓶中，作為樣品溶液。

1.4 溶液配制

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確移取玉米赤霉烯酮對(duì)照品溶液，用乙腈配成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

基質(zhì)匹配玉米赤霉烯酮系列校準(zhǔn)溶液：取未檢出玉米赤霉烯酮的空白大米、花生樣品，按照1.3方法處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液，用此基質(zhì)提取凈化液逐級(jí)稀釋玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的基質(zhì)匹配系列校準(zhǔn)溶液。

1.5 測定方法

取基質(zhì)匹配玉米赤霉烯酮系列校準(zhǔn)溶液及樣品溶液，按照1.2儀器工作條件分析，繪制色譜峰面積—玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度校準(zhǔn)曲線，利用校準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑選擇

真菌毒素檢測時(shí)，樣品處理通常選用的提取液有甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水等[17]。根據(jù)目標(biāo)毒素的溶解性，分別考察甲醇、乙腈、甲醇-水(體積比為9∶1)和乙腈-水(體積比為9∶1)作為提取溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果，結(jié)果見表1。由表1可知，4種提取溶劑的提取回收率均大于78.0%，而使用乙腈作為提取溶劑時(shí)，玉米赤霉烯酮的回收率最高(93.5%以上)，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑時(shí)玉米赤霉烯酮的回收率Tab.1 Recovery rate of zearalenone by different extraction solvents

2.2 凈化方式選擇

樣品提取和凈化作為液相色譜檢測方法的關(guān)鍵步驟，直接影響分析方法的靈敏度及準(zhǔn)確度，因此選擇合適的樣品凈化方式尤為重要。傳統(tǒng)的真菌毒素檢測時(shí)樣品凈化方式主要是基于免疫親和柱的凈化方法，該方法操作較繁瑣，耗材成本較高[18]。多功能針式過濾器凈化主要是基于QuEChERS原則，將凈化材料(PSA、C18等)填充于帶有有機(jī)濾膜的一次性注射針管內(nèi)，以簡化樣品提取溶液的凈化過程，具有簡單、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)，適合大批量樣品的檢測分析。筆者采用乙腈渦旋提取1 min 后，加入適量氯化鈉，再繼續(xù)渦旋提取1 min，離心后，上清液直接經(jīng)多功能針式過濾器凈化吸附蛋白質(zhì)、磷脂等干擾物質(zhì)。與免疫親和柱凈化方式相比，該方法不涉及洗脫和濃縮程序，將凈化和過濾一步完成，不僅提高了檢測效率，而且方法回收率和精密度均滿足檢測要求。

2.3 色譜條件選擇

分別對(duì)比了甲醇、乙腈和甲醇-乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相的分析效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用甲醇-乙腈為有機(jī)流動(dòng)相時(shí)，得到的色譜峰形比較理想，且響應(yīng)值較高，因此選擇甲醇-乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，并優(yōu)化了流動(dòng)相比例，最終以甲醇-乙腈-水(體積比為8∶46∶46)為流動(dòng)相，可獲得較好的靈敏度和重現(xiàn)性。在優(yōu)化的色譜條件下，基質(zhì)匹配玉米赤霉烯酮校準(zhǔn)溶液、空白樣品溶液及加標(biāo)樣品溶液色譜圖如圖1～圖6所示。結(jié)果表明，玉米赤霉烯酮色譜保留時(shí)間約為3.2 min，色譜峰形理想?？瞻讟悠啡芤杭凹訕?biāo)樣品溶液均無干擾，滿足檢驗(yàn)要求。表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 大米基質(zhì)匹配玉米赤霉烯酮校準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of calibration solution of zearalenone in matrix of rice

圖2 空白大米樣品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank rice sample solution

圖3 加標(biāo)大米樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of spiked rice sample solution

圖4 花生基質(zhì)匹配玉米赤霉烯酮校準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.4 Chromatogram of calibration solution of zearalenone in matrix of peanut

圖5 空白花生樣品溶液色譜圖Fig.5 Chromatogram of blank rice sample solution

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)

在1.2儀器工作條件下，分別進(jìn)樣測定基質(zhì)匹配系列校準(zhǔn)溶液，以玉米赤霉烯酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線。通過基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，用來評(píng)價(jià)大米和花生基質(zhì)對(duì)玉米赤霉烯酮的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)越接近1，表示對(duì)測定結(jié)果的影響越小，測定結(jié)果見表2。由表2 可知，玉米赤霉烯酮在花生基質(zhì)中存在較大的基質(zhì)效應(yīng)，而在大米基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)較小，綜合考慮，選擇以空白樣品提取凈化液配制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

表2 大米和花生中玉米赤霉烯酮的基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Matrix effects of zearalenone in matrix of rice and peanut

2.5 線性范圍、檢出限與定量限

由表2可知，在大米和花生基質(zhì)中，玉米赤霉烯酮的質(zhì)量濃度在2.5～500 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5。

在空白樣品中加入適量的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在1.2 儀器工作條件下測定，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限。計(jì)算得玉米赤霉烯酮在大米和花生基質(zhì)中的檢出限分別為15.0、30.0 μg/kg，定量限分別為50.0、100.0 μg/kg。在大米和花生基質(zhì)中，該方法的檢出限均比GB/T 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定的值低，滿足日常檢測需求。

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取未檢出玉米赤霉烯酮的大米和花生樣品為空白，進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算玉米赤霉烯酮的回收率及測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。稱取粉碎的大米和花生樣品各2 g，玉米赤霉烯酮加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為500、2 500、5 000 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6 次，結(jié)果列于表3。由表3 可知，玉米赤霉烯酮在大米和花生中的平均加標(biāo)回收率為77.11%～93.65%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49%～4.95%。表明該方法的準(zhǔn)確度及精密度良好，而且操作簡便，耗時(shí)短，適合大批量樣品的分析檢測。

表3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of spiked recovery and precision test

3 結(jié)語

基于通過式固相萃取原理，建立了多功能過濾器凈化-超高效液相色譜檢測大米和花生中玉米赤霉烯酮含量的分析方法。采用多功能針式過濾器一步式凈化，不但能除去提取溶液中磷脂等干擾雜質(zhì)，而且對(duì)玉米赤霉烯酮能保持較高的回收率，解決了傳統(tǒng)固相萃取柱凈化繁瑣復(fù)雜的問題，提高了檢測效率。該方法具有操作簡便，穩(wěn)定可靠和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，適合糧谷類食品中玉米赤霉烯酮含量的快速檢測。