劉 戀，王 新，高子馨，鮑 佳

（沈陽(yáng)工業(yè)大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110870）

由于溫室氣體的大量排放，全球變暖已成為地球面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。二氧化碳（CO2）的不節(jié)制排放是導(dǎo)致全球變暖的主要原因。減少CO2排放、開發(fā)低耗高效的CO2資源化利用新技術(shù)已成為當(dāng)務(wù)之急［1］?；谠贑O2轉(zhuǎn)化中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，生物酶技術(shù)逐漸引起了人們的關(guān)注。在已發(fā)現(xiàn)的自然界6條天然固碳途徑中，大部分是由核心固碳酶催化完成固碳。但這些核心固碳酶催化速率慢，反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜，且難以對(duì)其進(jìn)行改造和優(yōu)化。構(gòu)建新型生物固碳酶，克服傳統(tǒng)固碳酶的不足，提升其催化活性，已成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要課題［2］。另外，在CO2的循環(huán)利用領(lǐng)域，生物酶催化因其高效、高選擇性、條件溫和等優(yōu)勢(shì)而備受青睞。碳酸酐酶（CA）和甲酸脫氫酶（FDH）是催化過(guò)程中關(guān)鍵的兩種酶，前者能極大地促進(jìn)CO2的水合，后者能將CO2還原為甲酸，二者協(xié)同能提高CO2的還原速率。但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于溫度、pH等原因，酶易失去活性［3］，故需對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究。通過(guò)對(duì)生物酶進(jìn)行固定化，可提高其穩(wěn)定性。

本文介紹了天然及人工固碳途徑中核心固碳酶的改造與設(shè)計(jì)，總結(jié)了CA和FDH的固定化及其在CO2資源化轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為其工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 生物酶在固碳途徑中的改造與設(shè)計(jì)

1.1 天然固碳途徑中固碳酶的改造與表達(dá)

卡爾文循環(huán)是最主要的天然固碳途徑，其核心是核酮糖-1，5-雙磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）。近年來(lái)，大量研究對(duì)卡爾文循環(huán)進(jìn)行了改造優(yōu)化，其中的大多數(shù)集中在對(duì)Rubisco的改造優(yōu)化上。CAI等［4］開發(fā)了一種基于大腸桿菌的活性導(dǎo)向選擇系統(tǒng)，該系統(tǒng)將宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)僅與其中的Rubisco的活性相關(guān)聯(lián)，通過(guò)一輪進(jìn)化得到的PCC7002 Rubisco突變體，其比羧化活性提高了85%，對(duì)CO2的催化效率提高了45%。GLEIZER等［5］設(shè)計(jì)并進(jìn)化了大腸桿菌，可將CO2轉(zhuǎn)化為所有生物質(zhì)碳，利用Rubisco和磷酸核酮糖激酶與FDH共表達(dá)，通過(guò)卡爾文循環(huán)實(shí)現(xiàn)了CO2的固定和還原。

乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和丙酰輔酶羧化酶（PCC）是3-羥基丙酸雙循環(huán)的核心固碳酶，可通過(guò)進(jìn)化改造提高其固碳性能。LIU等［6］在重組大腸桿菌中表達(dá)了7種來(lái)自不同微生物的PCCB基因編碼CT亞基，來(lái)自枯草芽孢桿菌的PCCB表現(xiàn)出最高的體外活性，通過(guò)定向進(jìn)化進(jìn)一步提升其活性，得到的新型PCC的總催化效率提高了94倍。

二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)的核心固碳酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）活性高且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，故相關(guān)研究主要是以PEPC為核心固碳酶設(shè)計(jì)人工固碳途徑。BAR-EVEN等［7］使用PEPC，構(gòu)建了新型替代碳固定途徑—丙二酰輔酶A-草酰乙酸-乙醛酸（MOG）途徑，與卡爾文循環(huán)相比，MOG途徑的通路特異性活性高出2～3倍。BOUZON等［8］利用PEPC將CO2轉(zhuǎn)化為甲醛，然后將其轉(zhuǎn)移至四氫葉酸中，進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。YU等［9］利用PEPC設(shè)計(jì)了蘋果酰輔酶A-甘油酸途徑（MCG），以補(bǔ)充卡爾文循環(huán)的不足，從而有效合成乙酰輔酶A，該途徑在光合生物聚球藻中實(shí)施后，使碳酸氫鹽同化速率提高了約2倍。

1.2 利用高效固碳酶的人工生物固碳

除了天然固碳途徑中的固碳酶外，自然界中仍有許多活性很高的固碳酶。以這些固碳酶為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)全新固碳途徑以實(shí)現(xiàn)人工生物固碳，是提高固碳效率的有效途徑。

XIAO等［10］利用丙酮酸合酶設(shè)計(jì)了僅包含4個(gè)反應(yīng)的最小化人工固碳循環(huán)—POAP循環(huán)。該P(yáng)OAP循環(huán)可在每個(gè)步驟中將兩分子CO2轉(zhuǎn)化為一分子草酸鹽，代價(jià)是兩分子ATP（三磷酸腺苷）和一還原當(dāng)量（NAD（P）H（還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ）形式）。該P(yáng)OAP循環(huán)可在50 ℃的厭氧條件下運(yùn)行，固碳速率達(dá)到8.0 nmol/（min·mg）（以固碳酶計(jì)）。SIEGEL等［11］通過(guò)計(jì)算設(shè)計(jì)獲得了一種甲醛酶（FLS），F(xiàn)LS催化碳化反應(yīng)可直接將一碳單元固定成三碳單元。利用FLS設(shè)計(jì)了一種新的固碳途徑，即甲醛酶途徑，該途徑比任何天然單碳同化途徑利用碳更有效，并且具有更少的反向通量。SCHWANDER等［12］設(shè)計(jì)了一種在體外連續(xù)固定CO2的人工循環(huán)—巴豆酰輔酶A/乙基丙二酰輔酶A/羥基丁酰輔酶A（CETCH）循環(huán)。CETCH循環(huán)是一個(gè)由17種酶組成的反應(yīng)體系，以5 nmol/（min·mg）（以核心固碳酶計(jì)）的速率將CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)分子，比自然生物系統(tǒng)的效率更高，為6種天然固碳途徑增加了人工替代途徑。2021年，人工生物固碳領(lǐng)域又迎來(lái)了重大突破。CAI等［13］報(bào)道了一種在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中由CO2和H2合成淀粉的化學(xué)-生物化學(xué)混合途徑—人工淀粉合成代謝途徑（ASAP）。該途徑由11個(gè)核心反應(yīng)組成，在時(shí)空隔離的化學(xué)酶系統(tǒng)中，在氫氣驅(qū)動(dòng)下，以22.0 nmol/（min·mg）（以總催化劑計(jì)）的速率將CO2轉(zhuǎn)化為淀粉，較玉米中淀粉合成速率高約8.5倍。該途徑為未來(lái)利用CO2合成生化雜交淀粉提供了思路。

1.3 小結(jié)

目前，對(duì)CO2固定途徑的研究逐漸從天然固碳途徑的改造與優(yōu)化，過(guò)渡為人工固碳途徑的全新設(shè)計(jì)、構(gòu)建與應(yīng)用。研究人員通過(guò)強(qiáng)化CO2羧化途徑、優(yōu)化CO2固定能量供給來(lái)提高CO2固定效率，通過(guò)重構(gòu)CO2固定途徑、開發(fā)設(shè)計(jì)全新的人工固碳途徑來(lái)更好地實(shí)現(xiàn)CO2的資源化利用［14］。全新人工固碳途徑與傳統(tǒng)卡爾文循環(huán)的比較見表1。

表1 全新人工固碳途徑與傳統(tǒng)卡爾文循環(huán)的比較

2 CA催化CO2吸收

CA是一種鋅基金屬酶，通常存在于自然界的哺乳動(dòng)物、植物、藻類、古生菌、脊椎動(dòng)物和細(xì)菌中。它調(diào)節(jié)著人類和其他生物體的生物過(guò)程，其最主要的功能是催化CO2的可逆水合反應(yīng)。單純的CO2水合過(guò)程十分緩慢，一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)僅為5×10-2s-1，但CA將CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽的速率非?？?，CA周轉(zhuǎn)率為每分子CA每秒104～106分子CO2，是捕獲封存CO2的最優(yōu)酶［15］。

但CA酶對(duì)工作條件要求較高，且難以回收與再循環(huán)，這限制了其大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。此外，使用游離酶會(huì)使酶總成本變得很高，酶變性會(huì)導(dǎo)致酶水化活性隨著時(shí)間推移而逐漸喪失。酶固定化可以解決這些問(wèn)題，使反應(yīng)器設(shè)計(jì)更加靈活，同時(shí)提高了酶的回收率、穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，降低了酶的總成本。

2.1 CA固定化載體材料

為了有效地重復(fù)使用酶，并降低封存過(guò)程成本，研究人員嘗試在各種材料上固定CA。載體材料對(duì)生物催化體系的性能有重要影響，選擇時(shí)應(yīng)考慮成本、功能基團(tuán)可用性、機(jī)械穩(wěn)定性、生物降解性等特性［16］。

在酶的固定化方面，二氧化硅（SiO2）是應(yīng)用最廣泛的無(wú)機(jī)載體材料之一。硅基材料的使用形式多樣，如溶膠-凝膠SiO2、SiO2納米顆粒等［17］，其大比表面積和多孔結(jié)構(gòu)可以很好地結(jié)合酶。SHAO等［18］采用化學(xué)成分相同但物理結(jié)構(gòu)不同的SiO2基介孔分子篩KIT-6、SBA-15和MCM-41作為CA的固定化載體。與游離酶相比，CA/KIT-6、CA/SBA-15和CA/MCM-41的半衰期分別延長(zhǎng)了3.0、2.8和2.0倍。SBA-15因其二維結(jié)構(gòu)和大孔徑而表現(xiàn)出更高的CA負(fù)載量，在40 ℃下6 d后仍保持96%的初始活性，使CA/SBA-15較CA/MCM-41和CA/KIT-6更適合于CO2捕獲。

當(dāng)使用固定化酶時(shí)，催化過(guò)程完成后分離生物催化劑是新的挑戰(zhàn)。將酶分子附著在磁顆粒上是解決方案之一。金屬氧化物納米顆粒具有大比表面積、高生物相容性以及與胺/羧基的配位能力，被廣泛用于CA的固定化研究。VINOBA等［19］利用戊二醛作為間隔劑，探索了將牛的CA固定在包膜磁性納米顆粒基質(zhì)上的方法，在Fe3O4納米顆粒上涂覆SiO2和OAPS（八氨基苯基倍半硅氧烷）。固定化CA在30次循環(huán)后表現(xiàn)出良好的可重復(fù)使用性，30 d后仍保持82%的初始活性，表明其具有CO2封存應(yīng)用的潛力。

使用合成聚合物作為載體材料，其優(yōu)勢(shì)是可以選擇不同的聚合單體來(lái)滿足酶和固定化過(guò)程的需要。聚合物結(jié)構(gòu)中可以觀察到非常廣泛的化學(xué)官能團(tuán)，如羰基、羧基、強(qiáng)疏水的烷基等。這些基團(tuán)有助于聚合物表面的功能化以及與酶的高效結(jié)合。對(duì)于酶的固定化，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)將CA附著在聚氨酯泡沫上，可提高CA的熱穩(wěn)定性，在低于50 ℃時(shí)可保持98%以上的活性［20］。

含有大量附著位點(diǎn)的多孔高吸水性水凝膠亦是理想的固定化載體。WEN等［21］將合成的CA雙金屬雜化納米花（CANF）包埋于聚乙烯醇（PVA）-殼聚糖（CS）水凝膠網(wǎng)絡(luò)中，制備了PVA/CS@CANF水凝膠膜，其在熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、可重復(fù)使用性、CO2捕獲能力等方面均優(yōu)于游離CA和CANF。JUN等［22］以酶沉淀涂層（EPC）的形式將CA固定在電紡聚合物納米纖維上，室溫下在水溶液中以200 r/min振蕩培養(yǎng)868 d后，固定化CA仍保持65.3%的初始活性。

金屬有機(jī)骨架（MOFs）是由金屬離子和有機(jī)配體排列組裝而成的獨(dú)特的大比表面積多孔晶體材料。MOFs在固定化后的酶活性保留方面具有潛在優(yōu)勢(shì)。LIANG等［23］提出了在MOFs中原位嵌入蛋白質(zhì)的想法。ASADI等［24］以微孔咪唑沸石骨架ZIF-8固定CA。對(duì)于Ni基MOFs，由于Ni-BTC的特殊結(jié)合能力，重組的人碳酸酐酶Ⅱ（hCA Ⅱ）可以很輕松地固定在Ni-BTC納米棒上，在最佳條件下，來(lái)自細(xì)胞裂解物的組氨酸標(biāo)記的hCA Ⅱ（His-hCAⅡ）可獲得99%的活性回收率；儲(chǔ)存10 d后，固定化His-hCA Ⅱ保留了40%的活性，而游離酶失去了91%的活性［25］。

2.2 固定化CA催化CO2捕獲技術(shù)

氣液填充床柱是研究較多的CO2捕獲技術(shù)，填料提供大的表面積，以確保氣液相之間的良好接觸。在酶促CO2捕獲情況下，填料可用作固定化支撐。BLAIS等［26］提出了一種將CA共價(jià)固定在填料表面的逆流填料塔生物反應(yīng)器。ILIUTA等［27］開發(fā)了一種逆流填充床柱反應(yīng)器，將hCA Ⅱ固定在第四代高性能散堆填料上，提高了傳質(zhì)性能。傳統(tǒng)的填充床柱將CA固定在填料表面，雖然提高了CO2的轉(zhuǎn)化率，但其傳質(zhì)系數(shù)不夠高，無(wú)法充分利用CA的高轉(zhuǎn)化率。RASOULI等［28］提出了一種新型混合酶工藝，在填料表面和液相懸浮磁性納米顆粒上固定hCA Ⅱ，可去除71%的CO2。

選擇性膜用于去除氣體混合物中的CO2。膜滲透器具有表面積大、不受重力限制等優(yōu)點(diǎn)。但與傳統(tǒng)化學(xué)吸收柱相比，效率較低、通過(guò)膜纖維的壓差大是其主要缺點(diǎn)。COWAN等［29］開發(fā)了一種以CA為啟動(dòng)劑的含液膜（CLM）CO2捕集系統(tǒng)，通過(guò)在兩層聚丙烯（PP）膜之間引入含磷酸鹽的CA緩沖溶液，構(gòu)建了CLM體系，在CA的催化下將煙氣中的CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽。在支撐液膜系統(tǒng)中，固定化液體可作為微孔膜的支撐物。FU等［30］構(gòu)建了一種具有酶活性的超薄仿生膜，在環(huán)境壓力和溫度條件下實(shí)現(xiàn)CO2的捕獲和分離。在含有超薄液層的納米孔中固定CA，使CA濃度比溶液中可達(dá)到的濃度高出10倍。

在所有的CO2捕獲技術(shù)中，膜接觸器是最吸引人的替代技術(shù)之一，它具有接觸面積大、操作靈活、液體和氣體可獨(dú)立控制、易于規(guī)?；湍K化等優(yōu)點(diǎn)。RASOULI等［31］提出了一種酶促CO2捕獲的新方法，在平板或中空纖維膜接觸器中的膜表面和膜孔內(nèi)固定CA。該生物催化膜接觸器突出了固定化CA的催化效率，且在數(shù)小時(shí)內(nèi)吸收率保持穩(wěn)定，證實(shí)了其在工業(yè)應(yīng)用中的潛力。

3 FDH催化CO2資源化

FDH在自然界中廣泛存在，如厭氧和需氧細(xì)菌以及一些酵母和植物中均存在FDH。FDH可自然催化HCOO-轉(zhuǎn)化為CO2（HCOO-? CO2+H+2e-）。酶促反應(yīng)使用各種天然輔助因子作為電子受體，特別是NAD+（輔酶Ⅰ）和NADP+。在溫和條件下FDH也很容易催化反向反應(yīng)，即從CO2到HCOO-，使用NADH（或NADPH）作為電子供體。這種反向F DH催化反應(yīng)的實(shí)際底物是溶解的CO2還是水合的HCO3-目前尚不清楚，但最近的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，CO2是反向FDH催化的底物。FDH分為兩種類型：1）活性位點(diǎn)含有鉬（Mo）或鎢（W）的金屬依賴酶；2）不依賴金屬驅(qū)動(dòng)氧化還原催化作用的非金屬依賴酶。總體而言，金屬依賴型FDH相對(duì)于非金屬依賴型FDH更有利于催化CO2的反向還原反應(yīng)。

3.1 固定化FDH還原CO2合成甲酸

早在1984年，PARKINSON等［32］就將半導(dǎo)體光電極（p型磷化銦，p-InP）與生物催化劑FDH相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)CO2還原為甲酸。其后，研究人員針對(duì)此過(guò)程展開了多方面的研究，如通過(guò)固定化酶來(lái)提升酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率、通過(guò)改變催化條件來(lái)提高甲酸收率等。LU等［33］將FDH封裝在新型海藻酸鹽-二氧化硅（ALG-SiO2）雜化凝膠中，固定化FDH催化的甲酸最高產(chǎn)率可達(dá)95.6%，僅略低于游離形式的酶促反應(yīng)（98.8%）；10次循環(huán)后，固定化FDH的相對(duì)活性仍可保持在69%的較高水平。REDA等［34］報(bào)道了吸附到電極表面的含鎢FDH高效催化CO2電化學(xué)還原為甲酸鹽，無(wú)論是作為均相催化劑還是在電極上，F(xiàn)DH催化CO2還原的速率均比用于相同反應(yīng)的其他已知催化劑快兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上。

表2展示了不同載體固定化FDH還原CO2合成甲酸的性能。

表2 不同載體固定化FDH的性能比較

MOFs材料因自身高的孔隙率和好的化學(xué)穩(wěn)定性成為固定化酶的熱門載體之一。XING等［37］采用具有預(yù)裝Rh配合物的Zr基雙配體MOFs用于NADH原位再生和FDH固定化，光敏配體四（4-羧基苯基）卟吩（TCPP）的引入增加了催化活性位點(diǎn)；電子介體Rh配合物錨定在Zr基雙配體MOFs上，提高了電子轉(zhuǎn)移效率。與UiO-66-NH2相比，Rh-H2TCPP-Ui-O-66-NH2具有優(yōu)化的價(jià)帶結(jié)構(gòu)，顯著提高了光催化還原NAD+的活性，使CO2合成甲酸的產(chǎn)量從150 μg/mL（以催化劑計(jì)）升至254 μg/mL。

在選擇適宜FDH固定化載體的基礎(chǔ)上，合理利用電化學(xué)技術(shù)可促進(jìn)固定化FDH催化CO2轉(zhuǎn)化為甲酸。ARENA等［39］構(gòu)建了一個(gè)生物電化學(xué)系統(tǒng)（BES）用于CO2還原制甲酸，采用具有大比表面積和多級(jí)孔徑分布的新型納米結(jié)構(gòu)TiN載體來(lái)固定FDH。構(gòu)建的BES系統(tǒng)表現(xiàn)出顯著的CO2還原性能和良好的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了高達(dá)76%的甲酸鹽法拉第效率，最大甲酸鹽產(chǎn)量為44.1 μmol/（h·mg）（以FDH計(jì)）。YAN等［41］將微孔UiO-66-NH2轉(zhuǎn)化為同時(shí)包含微孔和介孔的多級(jí)孔結(jié)構(gòu)材料（HP-UiO-66-NH2），通過(guò)優(yōu)化孔結(jié)構(gòu)同時(shí)增強(qiáng)CO2的富集和FDH的固定化，提出了酶電催化CO2還原的機(jī)理，優(yōu)化后的催化體系可在3 h內(nèi)獲得1.826 mmol/L的甲酸鹽產(chǎn)量（是游離酶體系的5.57倍），生成速率為6 086.7 μmol/（h·g）（以催化劑計(jì)）。

為了提升FDH的性能與穩(wěn)定性，研究人員嘗試通過(guò)合理設(shè)計(jì)定點(diǎn)或隨機(jī)位點(diǎn)誘變不同來(lái)源的FDH。TüLEK等［42］通過(guò)分子模擬在碳酸氫鹽和甲酸鹽存在下研究了Asp188突變對(duì)NAD+依賴型FDH的亞基界面附近潛在變構(gòu)位點(diǎn)的影響，并將Asp188Arg突變型和野生型FDH固定在新合成的MWCNT（多壁碳納米管）-Ni-O-Si載體上。整合突變和固定化使碳酸鹽活性的催化效率提高了約25倍，兩種固定化酶的熱穩(wěn)定性分別比50 ℃下的游離對(duì)應(yīng)物提高了約11倍和18倍。在相同的條件下，突變酶及其固定化對(duì)應(yīng)物產(chǎn)生的甲酸產(chǎn)量較野生型及其固定化對(duì)應(yīng)物提高了約2倍。

3.2 以FDH為基礎(chǔ)的多酶體系轉(zhuǎn)化CO2

以FDH為基礎(chǔ)構(gòu)建的多酶體系轉(zhuǎn)化CO2越來(lái)越受到關(guān)注。ILIUTA等［43］提出了在固定床微反應(yīng)器（FBMR）中，利用共固定化耐氧FDH和葡萄糖脫氫酶，通過(guò)酶介導(dǎo)的CO2還原過(guò)程將大氣中的CO2轉(zhuǎn)化為甲酸鹽，同時(shí)原位再生NADH。由于該系統(tǒng)增強(qiáng)了相間傳質(zhì)和氣液界面面積，CO2轉(zhuǎn)化率明顯提高。因此，具有固定化FDH和葡萄糖脫氫酶的FBMR在CO2綠色轉(zhuǎn)化方面有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

FDH、甲醛脫氫酶（FADH）和甲醇脫氫酶（MDH）構(gòu)成的多酶體系轉(zhuǎn)化CO2的研究較多。1999年，OBERT等［44］通過(guò)由3種脫氫酶催化的級(jí)聯(lián)反應(yīng)將CO2還原為甲醇，利用NADH充當(dāng)每個(gè)脫氫酶催化還原的末端電子供體，獲得了91.2%的甲醇收率。自此，甲醇一直是CO2催化轉(zhuǎn)化的重點(diǎn)研究方向。XU等［45］將FDH、FADH和乙醇脫氫酶（ADH）封裝于ALG-SiO2雜化凝膠中，甲醇收率可達(dá)98.1%，儲(chǔ)存60 d后收率仍可達(dá)76.2%，在10次循環(huán)后還可達(dá)78.5%。姜忠義等［46］以正硅酸乙酯為前驅(qū)體，用改進(jìn)的溶膠-凝膠法對(duì)3種酶進(jìn)行了包埋共固定化，在低溫低壓下將CO2轉(zhuǎn)化為甲醇，甲醇收率可達(dá)92.4%。SUN等［47］通過(guò)簡(jiǎn)單溫和的仿生礦化過(guò)程，將3種脫氫酶包裹在二氧化鈦顆粒中，建立了一個(gè)綠色高效的多酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)可有效地將CO2轉(zhuǎn)化為甲醇，在更寬的pH和溫度范圍內(nèi)獲得了更高的反應(yīng)收率。EL-ZAHAB等［48］把FDH、FADH和ADH共固定在聚苯乙烯微粒上，將CO2轉(zhuǎn)化為甲醇，固定多酶體系11次循環(huán)使用后產(chǎn)生了48%的累計(jì)甲醇收率。

COCUZZA等［49］研究了OBERT等提出的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步，使用與甘油脫氫酶（GlyDH）共固定的FDH將CO2生成甲酸。通過(guò)GlyDH將甘油氧化為二羥基丙酮，以還原形式再生煙酰胺輔因子。在以斜發(fā)沸石作為載體時(shí)，F(xiàn)DH的保留活性大幅增加，從18%升至89%。FDH和GlyDH的固定化產(chǎn)率約為100%。研究表明，該方法可能在酶固定化和生物催化方面得到進(jìn)一步發(fā)展。

4 CA與FDH的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系

從能量角度而言，甲酸是利用CO2的最經(jīng)濟(jì)的方法。以FDH為生物催化劑，NADH為輔因子，CO2可逆地轉(zhuǎn)化為甲酸。然而，該反應(yīng)在熱力學(xué)上是不利的，逆向反應(yīng)的速率常數(shù)遠(yuǎn)高于正向反應(yīng)，并且在環(huán)境壓力下，CO2在水相中的溶解度較低。為了促進(jìn)反應(yīng)，提高反應(yīng)溶液的CO2吸收是一種有效策略。CA能顯著加速CO2的水合，在CO2分離捕集方面具有重要的應(yīng)用前景。

JI等［50］通過(guò)將FDH、FADH、ADH和谷氨酸脫氫酶（GDH）4種酶和輔因子原位包埋在陽(yáng)離子聚電解質(zhì)摻雜的中空納米纖維腔內(nèi)，并通過(guò)在中空納米纖維的外表面上組裝CA加速CO2水合，CO2還原酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了103.2%的最高甲醇收率，在10次循環(huán)后，仍保留了約80%的初始活性，基于輔因子的累積甲醇產(chǎn)率達(dá)940.5%。WANG等［51］研究了CA對(duì)催化FDH中甲酸鹽合成的影響，優(yōu)化各種參數(shù)后反應(yīng)速率提高了4.2倍。SATO等［52］利用FDH和CA構(gòu)建了雙酶系統(tǒng)，證明碳捕集、利用與封存（CCUS）系統(tǒng)中使用CA將CO2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽和使用FDH將CO2還原為甲酸鹽是協(xié)調(diào)的。ZHANG等［53］通過(guò)微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（MTG）的“交聯(lián)介質(zhì)”作用將CA和FDH連接在一起，以獲得不同比例的“一對(duì)一”和“一對(duì)多”的交聯(lián)酶聚集體，交聯(lián)后CA的保留酶活性超過(guò)93%，F(xiàn)DH的保留酶活性超過(guò)84%；與游離酶相比，交聯(lián)酶的總催化效率提高了5.8倍，并且FDH在不同溫度下的熱穩(wěn)定性得到改善。

在級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系中引入固體吸附劑是加強(qiáng)CO2轉(zhuǎn)化的策略之一，其中具有高胺基密度的聚乙烯亞胺（PEI）作為聚合物改性劑起著至關(guān)重要的作用。將CA和FDH共固定在PEI上優(yōu)勢(shì)明顯，CA和PEI均可極大地促進(jìn)CO2的捕獲和HCO3-的形成，從而加速FDH催化轉(zhuǎn)化CO2為甲酸鹽。同時(shí)，酶在固體吸附劑上的表面附著使其易于分離和回收，并具有較高的穩(wěn)定性。ZHAI等［54］把CA固定在PEI和聚多巴胺（PDA）改性的SiO2微球（PDA/PEI-SiO2-CA）上，并將其加入到含有NADH和FDH的反應(yīng)溶液中，促進(jìn)CO2轉(zhuǎn)化為甲酸鹽，在PDA/PEI-SiO2-CA存在下，初始反應(yīng)速率是空白對(duì)照的48.6倍，甲酸鹽產(chǎn)量也高于空白對(duì)照。介孔二氧化硅（mSiO2）材料因其大比表面積、高濃度表面硅羥基以及出色的化學(xué)/熱穩(wěn)定性受到研究人員的關(guān)注。MAO等［55］制備了結(jié)構(gòu)可控的mSiO2納米顆粒并用PDA和PEI對(duì)其進(jìn)行改性，用于CO2捕獲和轉(zhuǎn)化為甲酸的集成過(guò)程。mSiO2本身就是一種強(qiáng)CO2吸附劑，與游離酶相比，添加0.01 g mSiO2（410）（粒徑410 nm）可使CO2轉(zhuǎn)化加速11.94倍。用0.05g PDA/PEI-mSiO2（340）和PDA/PEI-mSiO2（410）改性后，酶催化反應(yīng)較無(wú)顆粒系統(tǒng)加速了24.0倍和30.8倍，以PDA/PEI-mSiO2（410）為載體進(jìn)行FDH和CA的共固定化，在4 ℃下使用10次后仍可保持86.7%的活性，21 d后可保持55.2%的活性（游離酶僅保持29.6%的活性）。

沸石咪唑酯骨架材料ZIF-8的咪唑基團(tuán)能夠協(xié)同催化CO2的水合反應(yīng)。REN等［56］通過(guò)將CA、FDH、輔因子NADH和GDH同時(shí)封裝到ZIF-8中，構(gòu)建了納米級(jí)多酶反應(yīng)器。在多酶反應(yīng)器中，F(xiàn)DH的活性回收率達(dá)50%，CA和ZIF-8的組合顯著促進(jìn)了CO2在反應(yīng)溶液中的溶解。納米級(jí)多酶反應(yīng)器表現(xiàn)出優(yōu)異的CO2轉(zhuǎn)化為甲酸鹽的能力，與游離多酶體系相比甲酸鹽的產(chǎn)率提高了4.6倍，在8次循環(huán)后仍保持了50%的初始活性，具有良好的可重復(fù)使用性。WANG等［57］以ZIF-8為模板，制備了具有分級(jí)結(jié)構(gòu)和孔隙率的超薄PDA微膠囊，將CA、FDH和GDH封裝在PDA微膠囊中。微膠囊中FDH保留了94.7%的等效游離FDH的活性。與游離多酶相比，包埋在PDA微膠囊中的固定化多酶表現(xiàn)出4.5倍的甲酸鹽產(chǎn)量。CHAI等［58］合成了包埋兩種酶（CA和FDH）的ZIF-8薄膜，該ZIF-8生物催化膜在沸水中處理1 h后仍表現(xiàn)出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性；在氣液膜接觸器中催化4 h后甲酸產(chǎn)率為22%；催化活性較無(wú)ZIF-8時(shí)增加了1.6倍。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

生物酶技術(shù)固定和轉(zhuǎn)化CO2既可緩解溫室效應(yīng)帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題，又能以溫室氣體為碳源合成高附加值產(chǎn)品，變廢為寶，有望發(fā)展成一種可循環(huán)的CO2管理體系。然而，現(xiàn)階段生物酶技術(shù)固定并轉(zhuǎn)化CO2仍存在一些問(wèn)題：一方面，現(xiàn)有的生物固碳途徑反應(yīng)過(guò)程大都較長(zhǎng)，固碳酶尚存在缺陷；另一方面，在酶法催化CO2捕集轉(zhuǎn)化過(guò)程中，關(guān)鍵酶的核心驅(qū)動(dòng)力不足，限制了反應(yīng)速率，而其較差的穩(wěn)定性是應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的又一障礙。為了CO2捕集和利用的進(jìn)一步發(fā)展，未來(lái)的生物酶技術(shù)可從以下方面進(jìn)行研究：

a）研發(fā)更高效的核心固碳酶，強(qiáng)化CO2羧化途徑，優(yōu)化能量供給，構(gòu)建全新的人工固碳途徑；

b）探索開發(fā)廉價(jià)高效的固定支撐材料，研發(fā)創(chuàng)新和有效的固定化技術(shù)，以保持酶的活性和穩(wěn)定性；

c）剖析酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)限制因素，從級(jí)聯(lián)反應(yīng)的原理著手，提高反應(yīng)效率。