潘 虹,陸天炆,王曉軍,洪一楠

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

0 引 言

生物酶是一類具有催化效率高、專一性強(qiáng)的生物催化劑[1],其本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。因此,生物酶通常需在常溫常壓等溫和條件下才能表現(xiàn)出其高催化性能,當(dāng)離開(kāi)特定環(huán)境就會(huì)出現(xiàn)酶活性和穩(wěn)定性迅速降低的缺點(diǎn)[2]?；钚蕴靠梢晕秸崽敲高M(jìn)行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶較好的催化活性[3]。由此,固定化酶的思想被首次提出。隨后,研究人員開(kāi)始通過(guò)一系列酶固定化技術(shù)來(lái)改善游離酶存在的缺點(diǎn)。

酶固定化技術(shù)就是指將游離酶通過(guò)一定的技術(shù)手段固定在某些不溶性載體上,進(jìn)而使其在敏感環(huán)境下仍然表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和酶活性[4]。經(jīng)固定化后的酶,可以借助載體的保護(hù)作用或者與載體之間相互作用,保護(hù)了酶蛋白的空間構(gòu)象[5],進(jìn)而提高了對(duì)pH、溫度、重金屬離子等影響因素的耐受性。同時(shí),固定化酶可以通過(guò)簡(jiǎn)單的離心過(guò)濾等手段從反應(yīng)體系中分離出來(lái),促進(jìn)漆酶的回收和重復(fù)使用[6]。

目前,固定化酶技術(shù)已經(jīng)在食品加工[7]、生物傳感器[8]、紡織印染廢水處理[9-10]、生物漂白[11]等諸多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,其固定化技術(shù)也表現(xiàn)出愈發(fā)成熟的發(fā)展。本文綜述了近五年酶固定化技術(shù)的發(fā)展,重點(diǎn)表現(xiàn)在固定化方法和固定化載體上,以及酶固定化技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 酶固定化方法

酶固定化方法可分為傳統(tǒng)固定化方法和新型固定化方法。表1列出來(lái)近五年的一些酶固定化技術(shù)所用的方法。

表 1 固定化酶所用固定化方法

1.1 傳統(tǒng)固定化方法

1.1.1 吸附法

吸附法即物理吸附,物理吸附是一種簡(jiǎn)單易行的方法,通過(guò)氫鍵、疏水作用和范德華力等相互作用使酶吸附到不溶于水的載體表面,該方法操作步驟簡(jiǎn)潔且不需要額外添加化學(xué)試劑,但其固定效果較差且容易受外界條件影響[29]。WANG等采用吸附法將漆酶固定在堿改性生物炭(A-MB)上實(shí)現(xiàn)對(duì)孔雀石綠(MG)的吸附降解,結(jié)果表明,A-MB對(duì)MG表現(xiàn)出最大吸附量757.58 mg/g,固定化漆酶A/lac@A-MB對(duì)MG的去除率可達(dá)97.70%,10次循環(huán)后仍然表現(xiàn)出超過(guò)75%的去除率[12]。ACET等以沸石顆粒(PPA)為原料,通過(guò)簡(jiǎn)單方法制備了Cu2+-APPaC包埋型復(fù)合晶凝膠(Cu2+-APPaC)用于α-淀粉酶吸附固定,結(jié)果表明,α-淀粉酶最大吸附量可達(dá)858.7 mg/g,同時(shí)相較于游離酶,其操作穩(wěn)定性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)[13]。

1.1.2 結(jié)合法

結(jié)合法是利用酶的側(cè)鏈基團(tuán)與載體表面的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)形成共價(jià)鍵,利用共價(jià)鍵將酶固定在載體上[30]。GHASEMI等將MIL-53(Fe)通過(guò)表面官能化對(duì)2種脂肪酶進(jìn)行共價(jià)固定,結(jié)果顯示脂肪酶固定化體系雖然沒(méi)有實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的高負(fù)載,但仍然表現(xiàn)出更廣泛的溫度和pH值穩(wěn)定性,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了酶的可重復(fù)使用能力和穩(wěn)定性的顯著改善[14]。此外,共價(jià)結(jié)合法由于化學(xué)鍵的形成,容易使酶的蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,從而降低酶活性[31]。FAN等采用戊二醛多點(diǎn)共價(jià)結(jié)合法和吸附-交聯(lián)法,以球形二氧化硅為載體,固定化皺紋假絲酵母脂肪酶(CRL),結(jié)果表明,多點(diǎn)共價(jià)處理后脂肪酶二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使酶的殘余活力下降[15]。但相比之下,共價(jià)結(jié)合法制備的酶體系具有更好的重復(fù)使用性和穩(wěn)定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潛力。

1.1.3 化學(xué)交聯(lián)法

交聯(lián)法是通過(guò)一些雙功能試劑將酶和載體進(jìn)行連接[31],主要用到的交聯(lián)劑有戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、二醛淀粉和二醛纖維素[30,32-33]等。CHEN等以戊二醛作為交聯(lián)劑制備了一種具有超順磁性的固定化漆酶Fe3O4@SiO2-NH2-Lac,該固定化體系表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性,對(duì)有機(jī)溶劑、金屬離子有顯著的耐受性和良好的循環(huán)使用性,同時(shí)在對(duì)酚類化合物的去除降解方面也表現(xiàn)出巨大的潛力[16]。QIU等以二醛淀粉為交聯(lián)劑,采用共價(jià)固定法將漆酶在離子液體改性的磁性納米載體上進(jìn)行固定,較于其他固定化漆酶,在處理含酚廢水中表現(xiàn)出更大優(yōu)勢(shì)[17]。然而常見(jiàn)的交聯(lián)劑在固定化過(guò)程往往會(huì)表現(xiàn)出一定的負(fù)面影響[34],為此研究人員著手發(fā)掘綠色安全的新型交聯(lián)劑來(lái)避免這種負(fù)面影響。例如,OUYANG等提出了一種新的綠色高效固定化酶的方法——京尼平苷酶解物作為交聯(lián)劑固定化漆酶[18]。與直接使用京尼平或戊二醛作為交聯(lián)劑,該方法綠色、安全,可應(yīng)用于需要嚴(yán)格控制毒性的食品和醫(yī)藥行業(yè)。DANIELLI等研究了一種雙功能交聯(lián)劑2,5-二甲?；秽?(DFF) 將葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸樹(shù)脂上[19]。使用海洋細(xì)菌費(fèi)氏弧菌進(jìn)行了生態(tài)毒性測(cè)定,相比于戊二醛,DFF表現(xiàn)出更低的生物毒性。

1.1.4 包埋法

包埋法是將酶固定在聚合物材料的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空隙載體中[35]。這種方法可以提供更好的保護(hù)和穩(wěn)定性,限制了酶的擴(kuò)散。但同時(shí)也存在孔隙的擴(kuò)散阻礙,使得該方法的循環(huán)使用效率下降。例如,LATIF等采用包埋法將漆酶固定化在海藻酸銅微球上進(jìn)行雙酚A的降解[20]。相比于游離酶,固定化漆酶表現(xiàn)出更高的pH、溫度穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性,但在循環(huán)使用5次后剩余酶活降到了21.5%。

1.2新型固定化方法

1.2.1 傳統(tǒng)固定化方法的改進(jìn)

傳統(tǒng)的單一固定化方法進(jìn)行酶固定往往存在各自的缺點(diǎn),因此出現(xiàn)了將單一方法進(jìn)行兩兩結(jié)合來(lái)固定化酶的改進(jìn)方法。常見(jiàn)的包括吸附-交聯(lián)法[21-22]、吸附-包埋法[23-24]、交聯(lián)-包埋法[25]等。例如,FATHALI等以介孔二氧化硅為載體,采用交聯(lián)-包埋相結(jié)合的固定化方法制備了包埋交聯(lián)漆酶聚集體(E-CLEA)[25]。相對(duì)于游離漆酶,條件優(yōu)化后的固定化漆酶顯示出較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。此外E-CLEA存儲(chǔ)21 d仍然具有較高的相對(duì)活性,在重復(fù)使用20次后,其活性保持率可達(dá)初始活性的79%。對(duì)污染廢水中苯酚的去除率可達(dá)73%[25]。

1.2.2 共固定化酶法

共固定化酶是指將多種酶同時(shí)固定化在同一載體上的一種方法。ARANA-PEA等實(shí)現(xiàn)了將5種酶進(jìn)行逐層固定化的策略,使得整個(gè)固定化酶體系的活性明顯增強(qiáng)[26]。與單一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的優(yōu)勢(shì)。在保證了固定化后酶穩(wěn)定性提高的同時(shí),不同酶在共固定后,由于處于同一載體上,酶之間可以發(fā)揮協(xié)同作用,且反應(yīng)底物可以連續(xù)在酶之間傳遞,從而簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟。GAO等制備了一種化學(xué)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系(GA&GOx@Au-SiO2),實(shí)現(xiàn)葡萄糖淀粉酶(GA)和葡萄糖氧化酶(GOx)共固定化[27]。借助于雙酶和載體之間的級(jí)聯(lián)效應(yīng),實(shí)現(xiàn)了從可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸。在保證了固定化雙酶穩(wěn)定性的同時(shí),Au的加入可以使中間產(chǎn)物H2O2快速脫除,顯著提高固定化體系的重復(fù)利用率。類似地,LIU等制備了一種具有可逆熱響應(yīng)釋放的雙酶固定化體系共固定GOx和辣根過(guò)氧化物酶(HRP),在葡萄糖濃度檢測(cè)過(guò)程中表現(xiàn)出優(yōu)于單酶檢測(cè)試劑盒的良好性能[28]。

此外,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于如漆酶這種綠色催化劑,較低的氧化還原電位大大限制了其在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。但發(fā)現(xiàn)在固定化體系中引入具有高氧化還原電位的介體可以彌補(bǔ)漆酶的這一不足[36]。LOU等基于MOFs膜實(shí)現(xiàn)了漆酶和介體ABTS的共固定化,結(jié)果顯示,固定化漆酶的底物親和力要高于游離漆酶[37]。

2 酶固定化載體

用于酶固定化的載體主要包括天然載體、人工合成載體和納米載體,見(jiàn)表2。在選擇固定化載體時(shí)要充分考慮具體的應(yīng)用領(lǐng)域和需求等。

表 2 固定化酶所用載體材料

2.1 天然載體材料

天然載體最大的優(yōu)點(diǎn)就是來(lái)源廣泛、低成本和低生物毒性。常用的天然載體有纖維素[38]、瓊脂糖[39]、殼聚糖[40]和藻酸鹽[41-42]等。同時(shí),將天然載體雜化后用于酶固定化可以表現(xiàn)出更優(yōu)良的固定化能力。MEHANDIA[43]等利用天然載體制備了殼聚糖-黏土復(fù)合微球(CCB-L),采用包埋法對(duì)漆酶和介體進(jìn)行共固定。微球在洗滌和儲(chǔ)存期間均未觀察到酶泄漏。同時(shí)固定化漆酶-介體體系通過(guò)填充床反應(yīng)器系統(tǒng)(PBRS),對(duì)紡織廢水的脫色率可達(dá)78%,COD、BOD以及毒性水平均下降。類似地,BAI等將海藻酸鈉和殼聚糖交聯(lián)形成復(fù)合凝膠球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]。固定化酶在較寬的pH(5～8)和溫度(30～80 ℃)范圍表現(xiàn)出高于游離酶的相對(duì)活性,循環(huán)使用性和存儲(chǔ)穩(wěn)定性也保持在良好水平。

2.2 人工合成載體材料

2.2.1 無(wú)機(jī)材料

無(wú)機(jī)材料來(lái)源廣泛、合成簡(jiǎn)單、機(jī)械強(qiáng)度高,可以直接用于酶的固定。常見(jiàn)的無(wú)機(jī)材料有二氧化硅[45]、二氧化鈦[48]、硅酸鹽[49-50]和氧化鋁[51]等。為了提高固定化效率,常常會(huì)先對(duì)無(wú)機(jī)材料進(jìn)行表面改性再用于固定化。ZHAI等使用聚乙烯亞胺(PEI)和多巴胺的共沉積對(duì)二氧化硅微球進(jìn)行改性,用于CO2酶促轉(zhuǎn)化甲酸鹽。優(yōu)化后PDA/PEI-SiO2載體使得甲酸鹽合成的初始反應(yīng)速率從13.4倍增加至27.2倍。再通過(guò)固定化碳酸酐酶(CA)后,甲酸鹽的合成速率增加到48.6倍[46]。隨后,LIU等同樣對(duì)SiO2微球進(jìn)行PEI的表面改性后用來(lái)固定化甲酸脫氫酶,同樣實(shí)現(xiàn)了CO2酶促轉(zhuǎn)化甲酸鹽的高效合成[47]。

2.2.2 高分子材料

人工合成的高分子材料具有良好的結(jié)構(gòu)剛性和其他優(yōu)良的力學(xué)性能。如聚酰胺、聚乙烯醇等具有良好的固定化能力。ZHAO等采用3種胺類試劑將聚酰胺-胺樹(shù)枝狀大分子(PAMAM)接枝到Fe3O4納米粒子上,利用戊二醛作為交聯(lián)劑得到了不同代數(shù)的Fe3O4@SiO2/PAMAM磁性納米載體[52]。固定化酶表現(xiàn)出相對(duì)游離酶更高的活性,而且改善了其在更寬的pH和溫度范圍內(nèi)的耐受性。ALAG?Z等先用聚乙烯醇水凝膠包裹烯還原酶(ER),再固定到氨基官能化的硅膠上。包埋后的ER比游離ER的熱穩(wěn)定性高34.4倍。在重復(fù)使用10次后,固定后的 ER仍保持其初始活性的85%[53]。

2.2.3 復(fù)合材料

針對(duì)有機(jī)、無(wú)機(jī)材料在實(shí)際應(yīng)用中存在的不足,不少文獻(xiàn)報(bào)道了將2類材料通過(guò)物理或化學(xué)手段進(jìn)行復(fù)合得到新型復(fù)合材料,可以得到性能更優(yōu)的固定化載體。例如,GIRELLI等將二氧化硅和殼聚糖雜化得到復(fù)合材料,相比單材料擁有更好的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性及生物相容性。存儲(chǔ)30 d后仍具有大于70%的相對(duì)活性。對(duì)漆酶進(jìn)行固定化后,固定化率達(dá)到92%,在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)固定化后漆酶表現(xiàn)出的穩(wěn)定性也要高于游離漆酶,重復(fù)循環(huán)利用15次剩余活性仍在61%以上[54]。

2.3 納米材料載體

納米材料憑借其小尺寸、高表面積和易改性等特點(diǎn),成為了酶固定化載體研究的焦點(diǎn)。各種改性后的納米材料也在酶固定化領(lǐng)域得到蓬勃發(fā)展。

2.3.1 磁性納米載體

磁性納米載體是一種可以通過(guò)外部磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)固定化酶快速分離的良好材料。憑借這種磁學(xué)性質(zhì)和低生物毒性[16],其在固定化載體的選擇上表現(xiàn)突出。Fe3O4是被廣泛使用的一種磁性材料。但由于純Fe3O4自身的表面惰性和高團(tuán)聚,往往需要對(duì)其進(jìn)行表面改性后再應(yīng)用于固定化。RAN等制備了一種殼核結(jié)構(gòu)的磁性納米載體Fe3O4@MoS2@PEI用于漆酶固定。在二硫化鉬(MoS2)和聚乙烯亞胺(PEI)的修飾下,磁性載體擁有較大的比表面積并減弱了自身團(tuán)聚效應(yīng),對(duì)漆酶的負(fù)載量可達(dá)120 mg/g,酶活回收率可達(dá)90%,同時(shí)對(duì)于水中持久性致癌有機(jī)污染物也表現(xiàn)出了良好的降解效率[55]。

2.3.2 介孔納米載體

介孔材料作為一種多孔材料,憑借多孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積,也是酶固定化的理想載體。金屬有機(jī)框架(MOFs)[56]憑借著可調(diào)控的孔徑和較大的比表面積在酶固定化方面得到廣泛應(yīng)用。LI等采用水熱法合成氨基官能化的MOF材料制備固定化漆酶,在最優(yōu)條件下實(shí)現(xiàn)了95%的剛果紅去除率,6次循環(huán)后降解率仍達(dá)到84.63%[56]。LU等以酵母為生物模板,將ZIF-8自組裝到酵母上得到雜合Y@ZIF-8,再用交聯(lián)劑固定過(guò)氧化物酶得到Y(jié)@ZIF-8@t-CAT。固定化酶的溫度、pH耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存儲(chǔ)45 d后活性仍保持在99%以上[57]。

除此以外,TANG等還制備了具有中空結(jié)構(gòu)的共價(jià)有機(jī)骨架微球(H-COF-OMe)[58]。這種孔缺陷的中空結(jié)構(gòu)有助于加快反應(yīng)物的擴(kuò)散,從而改善催化反應(yīng)過(guò)程,對(duì)四環(huán)素具有優(yōu)秀的降解效果。

2.3.3 金屬納米載體

金屬納米材料由于引入了金屬離子,可以提高載體的理化性質(zhì),在酶固定化過(guò)程中表現(xiàn)出重要作用。FU等將Fe3+/Fe2+固定到納米花形的共價(jià)有機(jī)框架(COF)中實(shí)現(xiàn)了固定化酶的磁分離[59]。LI等研究了以磁性Fe3O4為核,將單寧酸(TA)與不同類型金屬離子(Cu、Fe、Zn、Mn、Au)配位獲得了用于固定化的金屬酚醛網(wǎng)絡(luò)(MPN)涂層[60]。不同金屬離子的不同極化能力對(duì)MPN涂層的親水性和疏水性造成影響,從而給酶的固定化效率、催化活性和穩(wěn)定性帶來(lái)影響。對(duì)于漆酶而言,引入Cu2+對(duì)漆酶的活性中心具有正向的促進(jìn)作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物親和力[61]。

3 結(jié)論與展望

生物酶作為一種極具潛力的生物催化劑,通過(guò)固定化技術(shù)使其在污染物的降解、食品加工、生物傳感器等諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。酶固定化技術(shù)促使酶在較寬的pH值和溫度范圍下表現(xiàn)出更優(yōu)良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感環(huán)境下的穩(wěn)定性,實(shí)現(xiàn)了生物酶的可分離性及循環(huán)使用性。但目前看來(lái),酶固定化技術(shù)依然存在一些不足。

1) 酶在固定化后,由于載體的存在使得底物擴(kuò)散受阻,無(wú)法與酶充分接觸,導(dǎo)致酶活性降低?？梢酝ㄟ^(guò)基因工程技術(shù)從酶本身出發(fā),利用定點(diǎn)突變或基因重組改變酶結(jié)構(gòu)來(lái)提高酶活。同時(shí),通過(guò)摻雜合適的單一過(guò)渡金屬離子或多金屬離子協(xié)同作用激發(fā)酶活也值得深入研究。

2) 目前固定化酶技術(shù)在污染物降解等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用已經(jīng)頗為成熟,但對(duì)于更深層次的作用機(jī)制還停留在較為淺薄的層面。在未來(lái),隨著生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展,將固定化酶技術(shù)與計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)交叉,利用計(jì)算機(jī)軟件模擬分析更深層次的機(jī)制原理,可以更好地掌握酶固定化技術(shù)。

3) 酶固定化技術(shù)仍處在實(shí)驗(yàn)室研究階段,在實(shí)現(xiàn)更大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用仍然存在較大的挑戰(zhàn)。同時(shí),考慮到有些固定化載體制備的時(shí)間成本和資金成本,載體若僅用于一次固定化后就無(wú)法回收再利用就會(huì)造成過(guò)度浪費(fèi)。如何實(shí)現(xiàn)固定化酶失活后固定化載體與酶的高效分離,從而實(shí)現(xiàn)載體的循環(huán)使用是一個(gè)新的挑戰(zhàn)。因此,酶固定化技術(shù)仍然處在不斷發(fā)展進(jìn)步的階段,需要更多的科研者來(lái)完善研究。