康玲玲, 李桂芳, 宋先亮, 何 靜, 雷建都

(北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

近幾十年來(lái),生物醫(yī)學(xué)微納米機(jī)器人在靶向給藥、減少副作用、提高治療特異性方面具有廣闊的市場(chǎng)[1-3]。其中,自驅(qū)動(dòng)微納米機(jī)器人因其能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動(dòng)能在生物流體中進(jìn)行自驅(qū)動(dòng),而受到越來(lái)越多的關(guān)注。在這種開(kāi)創(chuàng)性機(jī)制的啟發(fā)下,開(kāi)發(fā)出了各種性能優(yōu)越的多功能材料,并顯示出巨大的潛力。自驅(qū)動(dòng)大致可以分為2類(lèi):一類(lèi)是化學(xué)驅(qū)動(dòng)[4-5],通常需要各種化學(xué)燃料;另一類(lèi)是酶驅(qū)動(dòng)[6-8],由生物燃料底物上的酶催化而成。酶是一種高效、環(huán)保、高選擇性的天然催化劑,能夠高效地轉(zhuǎn)化底物從而為生物機(jī)制提供動(dòng)力。然而,酶的天然脆弱特性使其具有很多的限制,如穩(wěn)定性差、回收和重復(fù)利用效率低,阻礙了其應(yīng)用。而將酶固定在載體上,如介孔二氧化硅[9-11]、碳納米管[12]和多孔有機(jī)框架材料[13],在復(fù)雜環(huán)境的條件下可以一定程度上保持酶的催化活性。但也存在一定的缺陷,例如酶與載體的結(jié)合力弱導(dǎo)致酶容易泄露;驅(qū)動(dòng)力不足,造成驅(qū)動(dòng)方向的不確定性。因此,開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便溫和的策略,制備生物相容性好且方向可控的藥物遞送系統(tǒng)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。生物聚合物材料因具有生物相容性好、生物可降解性、無(wú)毒、成本低、溶脹能力強(qiáng)等特性,受到了廣泛關(guān)注。其中海藻酸鈉(SA)和果膠(PET)均為來(lái)源廣泛的天然多糖,因凝膠原理相似,SA和PET在Ca2+體系中具有協(xié)同生成凝膠的特性[14]。SA和PET多糖與二價(jià)陽(yáng)離子交聯(lián),可生成高分散性的PET/SA復(fù)合微球,該復(fù)合微球成為結(jié)腸藥物靶向的優(yōu)秀候選[15-16]。通過(guò)酶催化反應(yīng)將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動(dòng)能來(lái)實(shí)現(xiàn)微/納米機(jī)器人的自我驅(qū)動(dòng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而,酶驅(qū)動(dòng)微納米機(jī)器人存在成本高、驅(qū)動(dòng)力弱、驅(qū)動(dòng)方向難以控制的缺點(diǎn)。本研究通過(guò)注滴法[17]將雙酶級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)的載藥磷酸鋅雜合顆粒及磁性顆粒包封在PET/SA復(fù)合微球中,保護(hù)酶和藥物免受胃腸道環(huán)境的影響,磁性材料又可對(duì)運(yùn)動(dòng)方向進(jìn)行遠(yuǎn)程的磁性控制;觀察了磁性顆粒對(duì)復(fù)合微球形貌、粒徑及藥物包封率的影響,以鹽酸伊立替康為模型藥物,分析了不同復(fù)配比時(shí)PET/SA復(fù)合微球在模擬胃腸液環(huán)境中的藥物釋放動(dòng)力學(xué),以期為藥物遞送系統(tǒng)的未來(lái)發(fā)展提供參考和思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

高酯果膠(PET),湖南康麓生物科技有限公司;過(guò)氧化氫酶(CAT)、葡萄糖氧化酶(GOD),美國(guó)Sigma-Aldrich公司;海藻酸鈉(SA)、FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、KH2PO4、二水合乙酸鋅(C4H6O4Zn·2H2O),上海阿拉丁公司;乳酸鈣,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;H3PO4、磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH值7.4)、辛烷磺酸鈉(C8H17NaO3S·H2O)、二甲基亞砜(C2H6OS),上海麥克林公司;模擬胃液(SGF)、模擬腸液(SIF),北京酷來(lái)搏科技有限公司;鹽酸伊立替康(CPT-11),上海源葉生物科技有限公司。

Rigaku Ultima IV型X射線衍射(XRD)儀,日本理學(xué)株式會(huì)社;N5000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),上海佑科公司;HZQ-X100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱,日本Shimadzu公司;Thermo Scientific Nicolet iS20型紅外光譜(FT-IR)儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司;LakeShore7404型振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM),美國(guó)LakeShore公司;LW300-28LT型光學(xué)顯微鏡,上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司;ZEISS Gemini 300型掃描電子顯微鏡(SEM),德國(guó)蔡司集團(tuán);JEM 100型透射電子顯微鏡(TEM),日本電子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Fe3O4納米粒子的制備 在三口燒瓶中,將4.44 g FeCl3·6H2O和1.732 g FeCl2·4H2O溶于80 mL水中,在氮?dú)獗Ｗo(hù)的回流條件下,保持機(jī)械攪拌1 000 r/min,溫度緩慢升高至70 ℃,恒溫反應(yīng)0.5 h。然后,迅速加入20 mL氨水,繼續(xù)反應(yīng)0.5 h。而后加入4 mL 0.5 g/mL的檸檬酸,將反應(yīng)溫度升高到90 ℃,連續(xù)攪拌60 min。將反應(yīng)混合物冷卻到室溫即可得到黑色沉淀物,用去離子水清洗幾次。由于生成的反應(yīng)產(chǎn)物中含有過(guò)量的檸檬酸,因此將納米顆粒分散體以10 000 r/min離心5 min使納米顆粒沉淀,然后用蒸餾水洗滌數(shù)次,最后冷凍干燥,即得Fe3O4磁性納米粒子(Mag)。

1.2.2雙酶驅(qū)動(dòng)載藥磷酸鋅雜合顆粒的制備 將1.5 mg過(guò)氧化氫酶(CAT)和1.5 mg葡萄糖氧化酶(GOD)加入到5 mL PBS緩沖液中,攪拌溶解,混合均勻后,在600 r/min的高速攪拌下,再緩慢滴加60 μL 0.15 mol/L的C4H6O4Zn·2H2O水溶液,攪拌2～3 min后,降低攪拌速度,再輕緩攪拌2 h。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)離心除去上清液,用少量水洗滌除去多余的磷酸鹽,得到雙酶驅(qū)動(dòng)的磷酸鋅雜合顆粒(CAT/GOD-Zn3(PO4)2)。再將CAT/GOD-Zn3(PO4)2在5 mL 0.1 g/L的CPT-11水溶液中以120 r/min的速度連續(xù)攪拌1 h,最后得到載藥后的雙酶驅(qū)動(dòng)磷酸鋅雜合顆粒(CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2)溶液。

1.2.3負(fù)載雙酶驅(qū)動(dòng)載藥復(fù)合微球的制備 分別配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的不同復(fù)配比的PET/SA復(fù)合微球。PET與SA的加入量如下:187.5 mg和187.5 mg、 125 mg和250 mg、 93.75 mg和281.25 mg,即m(PET)∶m(SA)分別為1∶1、 1∶2和1∶3。將兩者在超純水中溶脹,磁力攪拌8 h制備成PET/SA復(fù)配溶液。將5 mL的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2溶液均勻混合在復(fù)配溶液中,用5 mL的注射針頭將上述混合溶液滴入以300 r/min攪拌的5%乳酸鈣溶液中,攪拌10 min使微球固化,制成負(fù)載雙酶驅(qū)動(dòng)載藥磷酸鋅雜合顆粒的果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球(CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@PET-SA)溶液。

1.2.4磁響應(yīng)的負(fù)載雙酶驅(qū)動(dòng)載藥復(fù)合微球的制備 按1.2.3節(jié)方法制備3種不同復(fù)配比的PET/SA復(fù)配溶液,然后將20 mg的Mag加入3 mL的PET/SA復(fù)配溶液中,并超聲波處理15 min使Fe3O4在復(fù)配溶液中分散均勻,再將5 mL的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2溶液均勻混合在復(fù)配溶液中,用5 mL的注射針頭將上述混合溶液滴入以300 r/min攪拌的5%乳酸鈣溶液中,攪拌10 min使PET/SA微球固化,最終得到磁響應(yīng)的負(fù)載雙酶驅(qū)動(dòng)載藥磷酸鋅雜合顆粒的果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球(CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA)溶液,經(jīng)過(guò)濾后得到的固體微球用于后續(xù)測(cè)試與表征。

1.3 分析測(cè)試方法

1.3.1微球粒徑的測(cè)定 從每批樣品中隨機(jī)選擇50個(gè)微球,通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡連接的相機(jī)觀察PET/SA復(fù)合微球的外觀形貌,并測(cè)量50個(gè)微球的粒徑,得到微球的粒徑分布及平均粒徑。

1.3.2SEM分析 在鋁箔紙上添加一滴20 μL含有樣品的懸浮液,并在室溫下干燥后得到測(cè)試樣品。在0.02～30 kV加速電壓下使用SEM進(jìn)行觀察。

1.3.3TEM分析 利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察樣品的形貌,配制適量濃度的樣品溶液滴加在銅網(wǎng)上,室溫干燥后在TEM下進(jìn)行觀察。

1.3.4XRD分析 使用X射線衍射儀進(jìn)行XRD分析,在40 kV和40 mA條件下,Cu Kα(λ=0.154 18 nm)輻射,在環(huán)境溫度下收集PXRD圖案,掃描速度為2 s/步,步長(zhǎng)為0.02(°)/s,2θ為10°～90°。

1.3.5FT-IR分析 取1～2 mg冷凍干燥后的樣品,在紅外燈干燥的條件下與KBr研磨均勻,壓片制樣后在傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行分析,掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.6微球藥物包封率的測(cè)定 將制備微球的乳酸鈣溶液收集起來(lái),利用紫外-可見(jiàn)吸收(UV-vis)光譜法測(cè)定藥物的吸光度。首先用UV-vis光譜對(duì)CPT-11進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,測(cè)得特定波長(zhǎng)為254 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法:精密稱取CPT-11標(biāo)準(zhǔn)品0.012 5 g,在小燒杯中加超純水溶解后,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容至刻度線制成1.25 g/L儲(chǔ)備液A;精密量取1 mL儲(chǔ)備液A,置于25 mL容量瓶中,加超純水稀釋定容至刻度線,即制得50 mg/L儲(chǔ)備液B。分別量取0.6、 1.2、 1.6、 2.0、 3.0和4.0 mL儲(chǔ)備液B,置于10 mL容量瓶中,并稀釋定容至刻度線,即得到3、 6、 8、 10、 15、 20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。利用UV-vis光譜測(cè)得不同質(zhì)量濃度的CPT-11標(biāo)準(zhǔn)溶液在254 nm處的吸光度。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定3次,取平均值。最終得到質(zhì)量濃度(c)與吸光度(A)的回歸方程:A=0.052c+0.009 5,R2=0.999 3(質(zhì)量濃度范圍3～20 mg/L)。使用建立的藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線去計(jì)算包封的藥物量,包封率的計(jì)算公式如下:包封率=(投入藥物總量-上清液中的藥物量)/投入藥物總量×100%。

1.3.7VSM測(cè)試 在200 K下,以振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)測(cè)定樣品的磁滯回線,測(cè)試條件為常溫±2 ℃。

1.4 藥物釋放行為研究

為了模擬胃液和腸液中的藥物釋放情況,將3種不同復(fù)配比的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA放置于30 mL的SGF緩沖液(pH值1.2)中,置于37 ℃的搖床中,振蕩速率為150 r/min,每30 min取樣1 mL,同時(shí)再添加等體積新鮮的SGF緩沖液;2 h之后,將過(guò)濾的復(fù)合微球迅速轉(zhuǎn)移到30 mL的SIF緩沖液(pH值6.8)中,每30 min取樣1 mL,同時(shí)再添加等體積新鮮的SIF緩沖液。利用UV-vis光譜法測(cè)定溶液中CPT-11的量,測(cè)定CPT-11釋放量隨時(shí)間的變化,最終繪制完整的藥物釋放曲線。

1.5 微球驅(qū)動(dòng)軌跡記錄

將適量CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA加入到20 mL的30 mmol/L葡萄糖溶液中,使用相機(jī)來(lái)記錄下運(yùn)動(dòng)微球的驅(qū)動(dòng)軌跡。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4納米粒子的分析與表征

Fe3O4納米粒子的紅外光譜圖見(jiàn)圖1(a)。由圖可見(jiàn)584 cm-1處有強(qiáng)烈吸收峰,對(duì)應(yīng)于Fe3O4的Fe—O特征伸縮吸收峰。通過(guò)圖1(b)的XRD圖譜確認(rèn)了納米顆粒為單相尖晶石結(jié)構(gòu),納米顆粒在30.1°、 35.3°、 42.9°、 53.6°、 57.1°和62.8°的特征衍射峰分別對(duì)應(yīng)于[200]、[311]、[400]、[422]、[511]和[440]晶面,與ASTM XRD標(biāo)準(zhǔn)卡中的磁鐵礦圖譜相匹配,強(qiáng)烈尖峰證實(shí)了高結(jié)晶納米顆粒的形成,進(jìn)一步證明了Fe3O4的成功制備,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 Fe3O4納米粒子的紅外光譜(a)和XRD(b)

通過(guò)Fe3O4納米粒子的TEM圖(圖2)可以發(fā)現(xiàn),納米粒子呈簇狀顆粒,且粒徑相對(duì)較為均一,Fe3O4納米粒子的平均粒徑在10 nm左右。

圖2 Fe3O4納米粒子的TEM

2.2 果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球的分析與表征

2.2.1表面形貌分析 通過(guò)SEM觀察添加磁性顆粒前后復(fù)合微球的表面形貌(圖3)。

圖3 添加磁性顆粒前(a)和后(b)微球的SEM(m(PET)∶m(SA)=1∶2)

圖3(a)顯示添加磁性顆粒前復(fù)合微球呈現(xiàn)清晰平整的表面,然而加入磁性顆粒后(圖3(b)),復(fù)合微球表面出現(xiàn)大量褶皺,表面變得粗糙,這可能對(duì)復(fù)合微球的藥物包封率和釋藥性能產(chǎn)生一定影響。

2.2.2外觀分析 探究了果膠與海藻酸鈉復(fù)配比以及加入磁性微球后對(duì)微球形態(tài)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出,CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@PET-SA顯示透明的性質(zhì)和球形的幾何形狀,當(dāng)m(PET)∶m(SA)=1∶2時(shí),微球的形狀更趨于球形。雖然磁性顆粒的引入幾乎沒(méi)有影響微球的幾何形狀,但是微球的顏色明顯變深,CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA顯示出嵌入磁性顆粒的深色特征。

a.CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@PET-SA; b.CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA

2.3 復(fù)合微球的粒徑和藥物包封率測(cè)定

3種復(fù)配比條件下制得的添加磁性顆粒前后微球的粒徑分布、平均粒徑和包封率結(jié)果見(jiàn)圖5和表1。

表1 不同復(fù)配比條件下微球的平均粒徑和包封率

CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@PET-SA: a.m(PET)∶m(SA)=1∶1; b.m(PET)∶m(SA)=1∶2; c.m(PET)∶m(SA)=1∶3

由圖5(a)～圖5(c)和表1可知,不同復(fù)配比的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@PET-SA的粒徑大致呈現(xiàn)正態(tài)分布。未加磁時(shí),果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球中平均粒徑最大的是復(fù)配比1∶1微球,達(dá)到了1.938 mm,隨著海藻酸鈉用量的增加,復(fù)合微球的粒徑逐漸減小。而不同復(fù)配比條件下制備的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@PET-SA藥物包封率的變化不大,維持在58.0%～63.1%之間。

由圖5(d)～圖5(f)和表1可知,不同復(fù)配比的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA的粒徑大致呈現(xiàn)正態(tài)分布。加磁時(shí),果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球中平均粒徑最大的是復(fù)配比1∶3復(fù)合微球,達(dá)到了1.885 mm,與未加磁相反,隨著海藻酸鈉用量的增加,復(fù)合微球的粒徑逐漸增大。同時(shí)加入磁性顆粒后,藥物包封率維持在42.1%～47.7%之間,相比于未加磁性顆粒時(shí)有明顯下降,可能原因是加磁后的復(fù)合微球表面粗糙,結(jié)構(gòu)松散,導(dǎo)致了藥物的流失。

2.4 VSM分析

利用VSM技術(shù)研究了m(PET)∶m(SA)=1∶2時(shí),CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA在±1.6 MA/m范圍內(nèi)的磁滯回線。如圖6(a)所示,飽和磁化強(qiáng)度(Ms)為18.29 A·m2/kg?？梢钥闯?在復(fù)合微球中沒(méi)有觀察到磁矯頑力,這證明了所制備的復(fù)合微球具有超順磁性和高磁化強(qiáng)度,這樣的飽和磁化強(qiáng)度足以響應(yīng)外加磁場(chǎng)。上述分析表明,磁響應(yīng)的負(fù)載雙酶體系載藥機(jī)器人果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球是一種合適的磁響應(yīng)的藥物遞送系統(tǒng)。

圖6 CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA的VSM曲線(a)和藥物釋放曲線(b)

2.5 藥物釋放曲線

3種不同復(fù)配比的CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA在模擬胃液(SGF,pH值1.2)和模擬腸液(SIF,pH值6.8)中的藥物釋放曲線見(jiàn)圖6(b)。由圖可知,在0～120 min時(shí),CPT-11在模擬胃液中釋放速率較為緩慢;在120～240 min時(shí),CPT-11在模擬腸液中繼續(xù)快速釋放。從釋放曲線可以看出,CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA在模擬胃腸液的釋藥量由小到大依次為1∶1、 1∶2、 1∶3,即隨著復(fù)配微球中海藻酸鈉用量的增加,藥物釋放量增加。

2.6 微球的驅(qū)動(dòng)軌跡分析

如圖7驅(qū)動(dòng)軌跡所示,可以觀察到復(fù)合微球在30 mmol/L的葡萄糖溶液中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始緩慢地產(chǎn)生氣泡,并推動(dòng)微球的運(yùn)動(dòng)。由此可見(jiàn),CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA可以通過(guò)過(guò)氧化氫酶/葡萄糖氧化酶的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)在葡萄糖底物下進(jìn)行自驅(qū)動(dòng)。這是因?yàn)槠咸烟茄趸改茏园l(fā)地將葡萄糖氧化成葡萄糖酸,同時(shí)產(chǎn)生H2O2;再由過(guò)氧化氫酶對(duì)H2O2的轉(zhuǎn)換來(lái)提供動(dòng)力(2H2O2→2H2O+O2),反應(yīng)產(chǎn)物氧氣產(chǎn)生推力從而推動(dòng)復(fù)合微球的運(yùn)動(dòng)。

圖7 CPT-11/CAT/GOD-Zn3(PO4)2@Mag/PET-SA(m(PET)∶m(SA)=1∶2)的運(yùn)動(dòng)記錄

3 結(jié) 論

本研究嘗試采用果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球中包載Fe3O4納米顆粒及過(guò)氧化氫酶/葡萄糖氧化酶級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)的磷酸鋅雜合顆粒來(lái)構(gòu)建一種新的磁酶雙驅(qū)動(dòng)果膠基藥物遞送系統(tǒng)。對(duì)該遞送系統(tǒng)的表征結(jié)果表明:過(guò)氧化氫酶和葡萄糖氧化酶級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)的載藥磷酸鋅雜合顆?？稍谄咸烟堑孜锵逻M(jìn)行驅(qū)動(dòng),但由于酶的脆弱性質(zhì),容易在復(fù)雜介質(zhì)中失去活性,而在果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球的保護(hù)下,可在一定程度上保護(hù)酶的活性并減少酶的泄露。Fe3O4磁性顆粒的加入,可以使藥物遞送系統(tǒng)通過(guò)外加磁場(chǎng)遠(yuǎn)程控制運(yùn)動(dòng)的方向。該酶/磁雙驅(qū)動(dòng)的果膠/海藻酸鈉復(fù)合微球在藥物遞送領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。