于呂健,陽(yáng) 瑾,丁 宇,李曉曼,劉峰娟,范盈盈,梁紅玉,焦子偉,王 成

(1.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院,新疆伊寧 835000,2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部荒漠綠洲生態(tài)區(qū)特色農(nóng)產(chǎn)品功能營(yíng)養(yǎng)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(部省共建)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(烏魯木齊)/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830091,3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】石榴(PunicagranatumL),屬落葉喬木或灌木[1]。石榴果實(shí)味道甜美、含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及多酚、植物色素等生物活性化合物[2-3]。新疆喀什地區(qū)氣候條件有利于石榴果實(shí)水分、糖分和色素的積累,衍生出許多優(yōu)質(zhì)的石榴品種[4],已然形成了地區(qū)性特色。微生物病害是影響石榴品質(zhì)的重要因素,其中在果實(shí)生長(zhǎng)過(guò)程中附著于表面的真菌是病原菌主要來(lái)源之一。除機(jī)械損傷等外力因素導(dǎo)致的直接侵染外,自然情況下石榴果實(shí)的果萼部位也是病原菌附著的主要部位[5]。【前人研究進(jìn)展】Karen等[5]統(tǒng)計(jì)了有關(guān)石榴微生物病害的報(bào)道,其中鏈格孢(Alternariaalternata)、石榴墊殼孢(Coniellagranati)、黑曲霉(Aspergillusniger)、糾錯(cuò)青霉(Penicilliumimplicatum)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)是石榴果實(shí)的主要致病真菌;自病害石榴果實(shí)中分離出的主要致病真菌包含青霉屬(Penicilliumsp.)及其有性世代籃狀菌屬(Talaromyesgenus)、曲霉屬(Aspergillusspp.)、石榴墊殼孢(Coniellagranati)和灰葡萄孢(Botrytiscinerea)[6],與Karen等[5]統(tǒng)計(jì)的主要致病真菌組成基本吻合。石榴果實(shí)致病真菌還有石榴痂圓孢菌(Sphacelomapunicae)、石榴擬莖點(diǎn)霉(Phomopsispunicae)、石榴鮮殼孢(Zythiaversoniana)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)[7]等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆南疆氣候干燥,晝夜溫差大且紫外線(xiàn)強(qiáng)度高,與其他石榴適生地的生態(tài)環(huán)境具有較大區(qū)別,其生長(zhǎng)環(huán)境下果實(shí)表面的真菌群落組成也具有一定差異[1]。新疆喀什石榴生態(tài)系統(tǒng)中真菌的種類(lèi)及分布,以及其對(duì)石榴果實(shí)貯藏期間品質(zhì)的影響仍鮮有報(bào)道。需研究新疆喀什石榴果實(shí)表面真菌的種類(lèi)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】將分離和鑒定新疆喀什石榴果實(shí)表面的真菌群落,研究果實(shí)表面真菌體系的組成與分布,測(cè)試其對(duì)石榴果實(shí)的致病能力,為新疆喀什石榴果實(shí)病害的預(yù)防與治理提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 石 榴

供試石榴樣本主要來(lái)源于新疆喀什地區(qū)葉城縣和疏附縣石榴生產(chǎn)基地,于2021年10月在不同鄉(xiāng)村共采集20份石榴樣本,空運(yùn)至新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院。每份樣本中隨機(jī)選取5個(gè)大小適中、成熟度適宜、無(wú)傷口、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行表面真菌的分離鑒定,并挑選同一采樣地品相相近的石榴進(jìn)行致病性測(cè)試。

1.1.2 儀器與試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)(北京陸橋技術(shù)股份有限公司);無(wú)水乙醇(分析純)(天津市鑫鉑特化工有限公司);真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);PCR擴(kuò)增試劑盒(2×TaqPCR MasterMix)(天根生化科技(北京)有限公司);瓊脂糖(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)。

儀器:ESCO AC2-4S1型生物安全柜(益世科生物(中國(guó))有限公司);LDZF-50L型立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng));MJPS-250型霉菌培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Agilent SureCycler 8800型PCR儀(安捷倫科技(中國(guó))有限公司);Nikon E200型顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品預(yù)處理

隨機(jī)選取20個(gè)成熟且無(wú)損傷的石榴用無(wú)菌水擦洗表面泥土后晾干,將果萼尾部切除并保留3 mm,分別稱(chēng)重備用。

1.2.2 石榴表面真菌的分離純化

將處理好的石榴用其重量2倍的無(wú)菌水浸泡振蕩12 h后取出,獲得的菌懸液攪勻后進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋,每梯度取100 μL在PDA培養(yǎng)基上均勻涂布并設(shè)置3個(gè)平行,25℃培養(yǎng)5 d后觀(guān)察,根據(jù)菌落形態(tài)挑取分布較多的真菌菌落在PDA培養(yǎng)基上劃線(xiàn)進(jìn)行初步分離,再經(jīng)25℃培養(yǎng)5 d后觀(guān)察菌落形態(tài),直至獲得單一的原始菌落,三點(diǎn)法接種于PDA培養(yǎng)基備用。

1.2.3 石榴表面真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

取培養(yǎng)5 d的純化菌落刮取菌落表面適量菌絲體,用3 mL無(wú)菌水混合均勻后滴于載玻片上,光學(xué)顯微鏡400倍觀(guān)察,依照《真菌鑒定手冊(cè)》[8]和《半知菌屬圖解》[9]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.4 石榴表面真菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

1.2.4.1 rDNA-ITS的提取與測(cè)序

使用索萊寶真菌基因組提取試劑盒法提取總DNA,采用2×TaqPCR Mastermix和真菌ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×Taq25.0 μL,ITS1 4.0 μL,ITS4 4.0 μL,總DNA提取液2 μL,ddH2O 15μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min;94℃ 30 s,5℃ 30 s,72℃ 45 s,30次循環(huán);72℃ 10 min。反應(yīng)后產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行擴(kuò)增特異性檢測(cè),送至上海生工進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用NCBI中GenBank對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì),使用MEGA 11.0軟件中鄰位相連法(Neighbor-Joining)比對(duì)1 000次進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 石榴表面主要真菌的致病性測(cè)定

參照Mei Jun Guo等[10]的方法并做了適當(dāng)改進(jìn):取上述分離到的已培養(yǎng)7 d的真菌平板,用無(wú)菌水制得孢子懸浮液并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整孢子濃度為1×106CFU/mL備用。挑選成熟度和大小相近的新鮮石榴洗凈后用75%酒精表面消毒,待酒精完全揮發(fā)后用無(wú)菌接種鏟在每個(gè)果實(shí)的表面處理3個(gè)5 mm深、等距的傷口。每個(gè)傷口注射20 μL孢子懸浮液,以等體積無(wú)菌水作空白對(duì)照,每個(gè)處理3個(gè)平行。自接種后3 d起每隔2 d觀(guān)察一次果實(shí)傷口腐敗情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴表面真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

研究表明,經(jīng)10-1、10-2、10-3、10-4梯度分離純化后獲得17株菌株,鑒定為6個(gè)屬共7個(gè)真菌物種,菌株1菌落呈深褐色,邊緣呈白色,表面平整,孢子形態(tài)為卵形,較大且有橫隔膜,初步鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.);菌株3菌落呈白色,表面平整且具有絨毛狀氣生菌絲,孢子囊呈褐色,孢子形態(tài)為圓形,初步鑒定為曲霉屬(Aspergillussp.);菌株7菌落中心呈青色,邊緣生長(zhǎng)帶菌絲呈白色,背面呈橙黃色,菌落繩索狀,孢子為圓形,略粗糙,直徑約2μm,初步鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.);菌株8菌落呈青色,分泌大量紅色色素,表面平整,孢子為圓形,初步鑒定為籃狀菌屬(Talaromyessp.);菌株10菌落呈淡灰綠色,背面呈黃褐色,表面中心凸起,孢子為圓形,直徑約4 μm,初步鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.);菌株13菌落呈灰褐色,表面具有溝壑狀褶皺,分生孢子梗單生中部分枝,孢子為卵形,初步鑒定為芽枝霉屬(Cladosporiumsp.);菌株14菌落呈白色,表面平整,有白色絨毛,孢子為圓形,初步鑒定為絲狀真菌屬(Amorphothecasp.)。圖1

圖1 7種石榴表面分離真菌菌落及孢子形態(tài)

2.2 石榴表面真菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

研究表明,菌株1與鏈格孢屬(Alternariasp.)親緣較近,基因序列與水葫蘆鏈格孢(Alternariaeichhorniae)的相似度為100%,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為水葫蘆鏈格孢;菌株3與曲霉屬(Aspergillussp.)親緣較近,基因序列與琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)的相似度為92%且被歸為同一分支,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為琉球曲霉;菌株7和菌株10與青霉屬(Penicilliumsp.)親緣較近,其中菌株7的基因序列與阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)的相似度為100%,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為阿氏青霉,菌株10的基因序列與意大利青霉(Penicilliumitalicum)的相似度為97%且被歸為同一分支,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為意大利青霉;菌株8與籃狀菌屬(Talaromyesgenus)親緣較近,基因序列與紅色籃狀菌(Talaromyesrubrifaciens)的相似度為93%且被歸為同一分支,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為紅色藍(lán)狀菌;菌株13與芽枝霉屬(Cladosporiumsp.)親緣較近,基因序列與南極枝孢菌(Cladosporiumantarcticum)的相似度為81%,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為南極枝孢菌;菌株14與絲狀真菌(Amorphothecasp.)親緣較近,基因序列與煤油霉菌(Amorphothecaresinae)的相似度為100%,結(jié)合菌落和孢子形態(tài),該菌株為煤油霉菌。圖2

圖2 7株石榴表面分離真菌rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 石榴表面分離真菌對(duì)石榴損傷部位

研究表明,琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)與意大利青霉(Penicilliumitalicum)接種5 d時(shí)可見(jiàn)接種點(diǎn)處果皮腐爛跡象,7 d時(shí)果皮病斑明顯,且病斑處硬度均顯著下降:琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)接種9 d時(shí)病斑表面產(chǎn)生大量氣生菌絲,接種點(diǎn)有菌絲凸出并且果實(shí)內(nèi)部伴有大量孢子產(chǎn)生,縱向腐壞較深,臨近籽粒結(jié)構(gòu)已完全腐壞;意大利青霉(Penicilliumitalicum)接種7 d時(shí)接種點(diǎn)有菌體凸出并伴有孢子產(chǎn)生,9 d時(shí)果實(shí)內(nèi)部籽粒結(jié)構(gòu)破壞,縱向腐壞較淺,但分生孢子較少。水葫蘆鏈格孢(Alternariaeichhorniae)與阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)對(duì)果皮致腐能力較弱,接種9 d時(shí)未見(jiàn)果皮表面產(chǎn)生明顯病斑,接種點(diǎn)硬度未明顯下降:水葫蘆鏈格孢(Alternariaeichhorniae)接種5 d時(shí)自接種點(diǎn)長(zhǎng)出絨毛狀菌絲,9 d時(shí)內(nèi)部相鄰籽粒果肉腐壞嚴(yán)重,縱向腐壞較深,但種皮結(jié)構(gòu)仍然保留;阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)接種點(diǎn)表面果皮腐爛不明顯,7 d時(shí)可見(jiàn)接種孔有少量分生孢子產(chǎn)生,9 d時(shí)縱切面可見(jiàn)果皮內(nèi)側(cè)輕度腐壞,內(nèi)部臨近籽粒腐壞分生孢子較多,內(nèi)部菌絲向外擴(kuò)散較小,縱向腐壞較淺。紅色籃狀菌(Talaromyesrubrifaciens)、南極枝孢菌(Cladosporiumantarcticum)和煤油霉菌(Amorphothecaresinae)觀(guān)察期間接種點(diǎn)表面變化與無(wú)菌水處理無(wú)較大區(qū)別,接種9 d時(shí)未見(jiàn)較大致腐能力,接種點(diǎn)表面無(wú)病斑產(chǎn)生,未見(jiàn)硬度明顯下降,9 d縱切面僅紅色籃狀菌(Talaromyesrubrifaciens)接種點(diǎn)果皮與籽粒交界處有少量孢子產(chǎn)生,籽粒結(jié)構(gòu)保存相對(duì)正常,未見(jiàn)明顯菌絲侵染腐壞。圖3

3 討 論

3.1研究從新疆喀什石榴的果實(shí)表面分離純化了17株真菌菌株,結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)鑒定,初步鑒定為7個(gè)菌種,主要來(lái)自鏈格孢屬(Alternariasp.)、曲霉屬(Aspergillussp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)、籃狀菌屬(Talaromyesgenus)、芽枝霉屬(Cladosporiumsp.)和絲狀真菌(Amorphothecasp.)。新疆南疆氣候條件下石榴生態(tài)系統(tǒng)中真菌的種類(lèi)及分布仍有待進(jìn)一步探明。

在致病性測(cè)定部分,琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)和意大利青霉(Penicilliumitalicum)表現(xiàn)出對(duì)果實(shí)果皮較高的致腐滲透能力,受侵染部位內(nèi)部的籽粒結(jié)構(gòu)也遭到破壞,同屬青霉屬(Penicilliumsp.)的阿氏青霉(Penicilliumadametzioide)也同樣表現(xiàn)出對(duì)果皮的滲透,與相關(guān)曲霉屬(Aspergillussp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)導(dǎo)致的石榴果實(shí)病害研究成果吻合[11-13]。此外,研究中水葫蘆鏈格孢(Alternariaeichhorniae)在人為接種條件下對(duì)果實(shí)內(nèi)部籽粒也具有較高的致腐能力,但對(duì)果皮、種皮等植物防御結(jié)構(gòu)未表現(xiàn)較高的致腐分解能力,推測(cè)在自然條件下完整的石榴果皮將是阻礙其侵染的主要因素之一。研究還發(fā)現(xiàn)了紅色籃狀菌(Talaromyesrubrifaciens)、南極枝孢菌(Cladosporiumantarcticum)和煤油霉菌(Amorphothecaresinae)在石榴果實(shí)表面的分布,均未表現(xiàn)出對(duì)果皮或籽粒明顯的致腐能力,其在石榴生態(tài)系統(tǒng)中的功能和與石榴間的相互作用仍未可知。籃狀菌屬(Talaromyes)是近年來(lái)微生物色素研究的熱門(mén)菌屬,其屬內(nèi)的一些成員具有分泌體外色素的能力且不產(chǎn)生真菌毒素[14],相關(guān)研究中這些分泌色素的籃狀菌多分離自土壤和海洋等自然環(huán)境[15],自植物體表面分離仍鮮有報(bào)道,研究中分離的紅色籃狀菌(Talaromyesrubrifaciens)具有顯著分泌體外紅色素的能力,且肉眼觀(guān)察色素顏色與石榴籽粒色素相近,其作為色素生產(chǎn)菌株的潛力仍有待進(jìn)一步研究。

3.2采后貯藏期是石榴果實(shí)病害的高發(fā)時(shí)期[16]。孫勁等[17]對(duì)四川涼山地區(qū)貯藏石榴干腐、軟腐病的主要致病菌進(jìn)行了分離鑒定,得到的主要致病菌為石榴墊殼孢(Coniellagranati)、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和光孢青霉(Penicilliumglabrum),與暢引東等[18]鑒定的山西洪洞縣石榴主要致病菌組成相似;Mei Jun Guo等[9]從來(lái)自北京超市的石榴軟腐病斑中分離鑒定了3株塔賓曲霉(Aspergillustubingensis),其對(duì)石榴果實(shí)的致病性遠(yuǎn)高于黑曲霉(Aspergillusniger);付娟妮等[19]鑒定了葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)是西安凈皮甜石榴采后干腐病的主要致病菌。新疆地區(qū)石榴采后貯藏致病菌相關(guān)的報(bào)道也發(fā)現(xiàn)了紫變青霉(Penicilliumpurpurogenum)是新疆喀什甜石榴貯藏期褐腐病的主要致病菌[20],曲霉屬(Aspergillussp.)和青霉屬(Penicilliumsp.)可能是新疆石榴采后貯藏的主要致病微生物。

4 結(jié) 論

研究分離自新疆喀什石榴表面的7株真菌中,青霉屬(Penicilliumsp.)占比較多,琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)與意大利青霉(Penicilliumitalicum)對(duì)石榴果實(shí)的致病性較高。石榴墊殼孢(Coniellagranati)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)等國(guó)內(nèi)其他地區(qū)石榴采后主要致病菌在研究中并未發(fā)現(xiàn),新疆南疆生態(tài)條件下石榴果實(shí)主要致病菌較國(guó)內(nèi)其他適生地存在一定區(qū)別。