彭 雯，秦 琴，王 巧，譚詩生

大腸癌（colorectal cancers, CRC）的發(fā)病率及死亡率在我國呈逐年升高趨勢，嚴重危害人類健康[1]。由于大腸癌早期的臨床癥狀不典型，早篩的普及性較差，大部分患者就診時已經(jīng)是中晚期，喪失了手術機會，所以化療仍然是大腸癌的主要治療手段之一。目前針對大腸癌的標準化療方案是以氟尿嘧啶為基礎的聯(lián)合方案[2]，但由于錯配修復基因缺失（deficient mismatch repair, dMMR），導致腸癌患者天然對氟尿嘧啶藥物不敏感[3-4]，以致患者不能從治療中獲益。以往研究顯示中藥土家蜚蠊對大腸癌具有抗腫瘤作用[5]。本研究將蜚蠊與氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)合作用于dMMR 腸癌細胞，探究蜚蠊聯(lián)合氟尿嘧啶對dMMR 大腸癌細胞的增效作用，并應用脂質(zhì)組學技術挖掘相關通路及機制，以期為臨床提高dMMR 大腸癌患者的療效提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人源大腸癌HCT116、DLD1 細胞株購自美國ATCC 細胞庫，由四川大學生物治療實驗室凍存保管，前期研究證實HCT116 為MLH1 基因缺失細胞，DLD1 為MSH6 基因缺失細胞，均為dMMR大腸癌細胞[6]。

1.1.2 藥物蜚蠊脫脂精粉（生產(chǎn)批號：202040328-02）購于彌渡縣云峰美蠊養(yǎng)殖基地。蜚蠊含藥血清制備：1）SPF 級SD 大鼠，隨機分為2組，空白對照組（NC）和蜚蠊含藥血清組（FL），蜚蠊組按成人臨床等效劑量（15 g/60 kg）的10 倍來配制蜚蠊混懸液，藥物濃度為0.25 g/mL，按10 mL/kg 灌胃給藥，空白對照組以等劑量生理鹽水灌胃，1 次/d，連續(xù)飼養(yǎng)7 d。2）大鼠末次灌胃1 h 后，采集腹主動脈血，留取血清，分裝保存至-20 ℃冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT 法檢測蜚蠊對HCT116、DLD1 腸癌細胞增殖的抑制作用 將100 μL 配制好的蜚蠊加入96孔板中，每孔按總體積的1.5%、3%、6%、12%、24%比例加入5-FU，配置成0.6、1.25、2.5、5、10 μmol/L不同劑量，加入96 孔板中，F(xiàn)L+5-FU 根據(jù)上述劑量聯(lián)合作用于細胞，每組劑量重復3 次，作用24 h、48 h 和72 h 后進行MTT 測定，抑制率=[1－(實驗孔OD值－空白組OD 值]/(對照孔OD 值－空白組OD 值)×100%。

1.2.2 通過Calcusyn2.0 計算兩藥聯(lián)合治療指數(shù)（CI值） 藥物聯(lián)合治療目的是達到協(xié)同增效。聯(lián)合治療指數(shù)CI 是量化協(xié)同作用簡單的方法。本研究依據(jù)Calcusyn 軟件的Chou and Talalay[7]方法，分析用不同濃度蜚蠊和5-FU 藥物組合聯(lián)合共同處理48 h結直腸癌細胞的細胞毒性。CI＜0.75 為協(xié)同作用，0.75～1.25 為疊加作用，CI＞1.25 為拮抗作用。

1.2.3 基因本體論(gene ontology, GO)功能富集分析 GO 分析的主要作用是對差異表達的基因進行基因功能注釋分析，通過OmicShare 云平臺進入GO 數(shù)據(jù)庫，上傳二代測序獲得蜚蠊聯(lián)合5-FU 與5-FU 單藥間差異基因，用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對差異基因的功能進行注釋分析，尋找兩組之間的差異通路。

1.2.4 高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀（LC/MS）進行脂質(zhì)檢測 藥物作用72 h 后對細胞進行脂相提取，Acquity UPLC 系統(tǒng)進樣分析[8]，利用Q-TOF 質(zhì)譜(waters, manchester, U.K.) 進行全脂質(zhì)組學的測定。在 數(shù) 據(jù) 庫 Lipid Maps Database 和 Human Metabolome Database 中，利用m/z 鑒定代謝物，最后將數(shù)據(jù)導入Progenesis QI（newcastle, UK1）進行校準。對代謝物進行非成對模式t 檢驗，篩選出有統(tǒng)計學差異的代謝物（P＜0.05）。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 和Graphpad prism 7.0 軟件進行分析及作圖，組間率的比較采取ANOVA 方法進行檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蜚蠊含藥血清對大腸癌細胞增殖的抑制作用MTT 實驗結果顯示，不同蜚蠊?jié)舛葘CT116 和DLD1 細胞均顯示出抑制作用，但抑制率不隨濃度加大而升高，統(tǒng)計學無意義。蜚蠊?jié)舛葹?%時對HCT116 和DLD1 細胞抑制作用較為明顯。蜚蠊與5-FU 聯(lián)合作用HCT116 和DLD1 細胞后顯示出較好的抑制作用，且隨5-FU 濃度增加抑制率越好，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1～4）。

表1 FL 在不同濃度及時間對HCT116 細胞的抑制率

表2 FL+5-FU 在不同濃度及時間對HCT116 細胞的抑制率

表3 FL 在不同濃度及時間對DLD1 細胞的抑制率

表4 FL+5-FU 在不同濃度及時間對DLD1 細胞的抑制率

2.2 蜚蠊聯(lián)合5-FU 對結直腸癌細胞的聯(lián)合治療指數(shù)（CI）值檢測 給予上述同劑量的蜚蠊與不同劑量5-FU 聯(lián)合作用HCT116 和DLD1 細胞后，在HCT116 細胞中，蜚蠊?jié)舛仍?%時與5-FU 10 μmol/L 組合的CI 指數(shù)為0.24。在DLD1 細胞中，相同劑量組合兩藥CI 指數(shù)為0.35，CI 指數(shù)明顯低于0.75，表明當蜚蠊?jié)舛仍?%時與5-FU 10 μmol/L結合時，協(xié)同抗增殖作用最強，見圖1。所以本研究選擇HCT116 細胞進行后續(xù)實驗研究。

圖1 蜚蠊與5-FU 聯(lián)合用藥后在HCT116、DLD1 大腸癌細胞中CI 值

2.3 基因測序檢測兩藥聯(lián)合后差異基因及KEGG富集分析 基因測序發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合與5-FU 單藥之間有3276 個基因發(fā)生顯著變化（FC＞1.5，F(xiàn)DR＜0.05），通過京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 分析顯示，最重要的富集通路在脂質(zhì)代謝、自噬、黏附物連接和PI3K-AKT-mTOR 等通路（圖2）。

圖2 蜚蠊與5-FU 聯(lián)合用藥后在HCT116 細胞中差異基因及通路變化

2.4 GO 功能分析 GO 功能分析發(fā)現(xiàn)主要生物過程包括脂肪酸代謝、血管內(nèi)皮改變、自噬調(diào)控、凋亡發(fā)生及細胞黏附等生物學過程發(fā)生主要改變（圖3）。對通路中顯著差異變化基因進行挖掘，脂肪酸代謝發(fā)現(xiàn)脂滴（LD）、去飽和酶1（SCD1）、Acyl-CoA 合成酶1（ACSL1）、Acyl-CoA 合成酶（ACSL4）、ELOVL6、ACAT1 基因發(fā)生顯著改變。凋亡通路中CDKN1A、CDKN2A 和FASLG 基因變化顯著（圖3）。

圖3 GO 功能分析HCT116 細胞中蜚蠊聯(lián)合5-FU用藥組與5-FU 單藥組主要生物學改變中基因情況

2.5 脂質(zhì)組學檢測 蜚蠊聯(lián)合5-FU 處理HCT116細胞后，對脂質(zhì)組學檢測出的差異代謝物進行鑒定，鑒定出153 個脂質(zhì)分子，包括脂肪類（62 個分子）、鞘脂代謝物（11 個分子）、磷脂代謝物（47 個分子）和甘油酯（33 個分子），見表5。

表5 脂質(zhì)種類和數(shù)量表達情況

3 討論

雖然已有越來越多的治療方法應用于大腸癌患者，但由于大腸癌屬于“冷腫瘤”，免疫治療效果欠佳，靶向藥物需要與化療藥物聯(lián)合應用才能發(fā)揮較大的抗腫瘤作用，所以化療仍然是大腸癌患者的主要治療手段之一。5-FU 為結直腸癌患者化療的基本用藥，應用于術后輔助治療及晚期患者多線治療。但dMMR 腸癌患者對5-FU“天然耐藥”或抵抗不能獲益，影響了患者預后，因此，如何提高5-FU 在dMMR 腸癌患者的療效是亟待解決的重要問題。有研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物對食管癌、胃癌細胞均有抑制作用[9]，并且可以逆轉(zhuǎn)人肝癌細胞的多藥耐藥性[10-12]。本研究應用中西醫(yī)結合治療理念，應用土家藥蜚蠊與5-FU 聯(lián)合用于dMMR 大腸癌細胞，探討中藥蜚蠊改善5-FU 在dMMR 腸癌細胞中療效的相關性，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝、自噬和凋亡等生物信號發(fā)生主要改變，兩藥聯(lián)合可能通過脂質(zhì)代謝途徑逆轉(zhuǎn)耐藥，從而達到協(xié)同增效作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝在兩藥協(xié)同增效上發(fā)揮重要作用，應用LC/MS 技術進行脂質(zhì)組學檢測到磷脂和甘油酯代謝異常。膜磷脂（包括PC、PE、PI、PA和Cer）是調(diào)節(jié)細胞增殖和耐藥的重要信號分子，磷脂的代謝改變有助于腫瘤的進展和耐藥[13]。其中ACSL 是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關鍵酶，包括脂肪酸伸長、氧化分解、磷脂生成和蛋白質(zhì)?；?，與轉(zhuǎn)移和不良生存預后相關[14]，脂滴（LD）由脂質(zhì)核心（甘油酯和甾醇酯）組成, 研究證實抑制LD 的積累可以改善5-FU 的療效[15-16]。SCD1 是生成復合脂質(zhì)如磷脂、甘油三酯和膽固醇酯的關鍵基質(zhì)。敲除SCD1 可以抑制腫瘤細胞的侵襲性，使腫瘤患者對各種治療更敏感[17-18]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)凋亡通路發(fā)生顯著改變，F(xiàn)ASLG 基因是腫瘤壞死因子家族成員，CDKN1A、CDKN2A 在凋亡執(zhí)行過程中發(fā)揮重要作用。磷脂代謝異常引起脂肪酸及神經(jīng)酰胺代謝異常誘導凋亡的發(fā)生（圖4）。因此，蜚蠊改善5-FU 療效可能是通過脂質(zhì)代謝改變誘導細胞凋亡達到協(xié)同增效作用。

圖4 脂質(zhì)代謝通路示意圖

綜上所述，中藥蜚蠊作用于dMMR 腸癌細胞可以改善5-FU 的敏感性，可能與腫瘤細胞脂質(zhì)代謝改變誘導凋亡發(fā)生有關。本研究利用現(xiàn)代醫(yī)學研究手段為中藥蜚蠊的抗腫瘤作用及聯(lián)合西藥抗腫瘤研究提供了一定的理論基礎。但仍然需要從更深層次的分子及基因水平探究其作用機制，將中西醫(yī)結合更好地應用于臨床。