吳長(zhǎng)靜，鄒雨芳，黃新偉

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650033）

I 型單 純皰疹病毒（herpes simplex virus 1，HSV1）是一種分布廣泛的雙鏈DNA 病毒，屬于皰疹病毒科[1]，編碼80 多個(gè)基因，具有高度嗜神經(jīng)特性，感染一般發(fā)生在兒童時(shí)期，初始感染部位是黏膜上皮細(xì)胞，病毒在其內(nèi)復(fù)制增殖，引起唇皰疹。同時(shí)HSV1 感染能夠引發(fā)一系列不同程度的臨床病理表現(xiàn)，從輕微的口腔和唇皰疹、角膜感染再到危及生命的病毒性腦炎[1]。

1 HSV1 生物學(xué)特性及感染疾病

與HIV 和乙肝病毒一樣，HSV1 可以在人體內(nèi)建立終身潛伏感染，病毒雙鏈DNA 持續(xù)存在于受感染細(xì)胞的細(xì)胞核中。其中HIV 是一種整合病毒，而皰疹病毒和肝炎病毒不能將自身的雙鏈DNA 整合于宿主細(xì)胞基因組上，只能以宿主細(xì)胞染色體外游離的方式存在[2]。

HSV1 的感染一般發(fā)生在兒童時(shí)期，初始感染部位是黏膜上皮細(xì)胞，病毒在其內(nèi)復(fù)制增殖，引起唇皰疹；隨后病毒沿神經(jīng)軸突逆行至三叉神經(jīng)節(jié)（trigeminal ganglia，TG）或進(jìn)入感覺神經(jīng)元的神經(jīng)末梢。在三叉神經(jīng)節(jié)，病毒雖有短暫復(fù)制，但大多數(shù)病毒最終進(jìn)入潛伏狀態(tài)。潛伏期間，病毒DNA 復(fù)制在很大程度上受到抑制，病毒蛋白也處于極低水平表達(dá)，從而逃避宿主免疫監(jiān)視。HSV1 感染能夠引發(fā)一系列不同程度的臨床病理表現(xiàn)，從輕微的口腔和唇皰疹、角膜感染再到危及生命的病毒性腦炎[1]。在免疫功能正常的個(gè)體中，HSV1 的原發(fā)和復(fù)發(fā)性感染通常是有限的，病毒能被機(jī)體免疫系統(tǒng)及時(shí)清除；但在免疫功能低下的個(gè)體中，更高的復(fù)發(fā)率往往導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病表現(xiàn)。流行病學(xué)研究顯示，HSV1 病毒已是發(fā)達(dá)國(guó)家感染性失明和急性病毒性腦炎的主要原因[3]。

2 HSV1 病毒感染機(jī)制

2.1 HSV1 的裂解感染

裂解感染期，病毒基因組的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控：首先是即早期（immediate early，IE）基因的轉(zhuǎn)錄。病毒與靶細(xì)胞膜融合后，包括病毒反式激活蛋白VP16 在內(nèi)的一些包膜蛋白會(huì)獨(dú)立于衣殼進(jìn)入細(xì)胞核，VP16 與細(xì)胞八聚體DNA 結(jié)合蛋白Oct-1 反式作用，結(jié)合到IE 基因啟動(dòng)子，誘導(dǎo)RNA 聚合酶II 依賴的IE 基因轉(zhuǎn)錄[4]。IE 基因產(chǎn)物在病毒感染后的2～4 h 表達(dá)，包括ICP0，ICP4，ICP22，ICP27，ICP47[5]，它們參與調(diào)控E 基因的轉(zhuǎn)錄。E 基因參與病毒基因組的復(fù)制，編碼DNA復(fù)制所需要的蛋白質(zhì)，包括7 個(gè)直接參與病毒DNA 復(fù)制的蛋白質(zhì)和許多與核酸有關(guān)的蛋白質(zhì)。E 基因表達(dá)后，病毒基因組才開始復(fù)制[2]。L 基因的轉(zhuǎn)錄只有在病毒基因組復(fù)制后才被激活，一旦有足夠的病毒基因拷貝產(chǎn)生，L 基因的產(chǎn)物就會(huì)促進(jìn)DNA 的衣殼化[6]。激活L 基因的表達(dá)需要合成至少3 種病毒蛋白：ICP4、ICP27 和ICP8[5]。

2.2 HSV1 潛伏感染

HSV1 在神經(jīng)元潛伏時(shí)，裂解相關(guān)基因被沉默，病毒基因組的轉(zhuǎn)錄僅局限于一個(gè)非編碼RNA家族，即潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本LATs[7?8]。初始LAT 轉(zhuǎn)錄本為1 個(gè)8.3 Kb 的聚腺苷化RNA[9]，通過進(jìn)一步剪接生成一個(gè)2.0 Kb 的穩(wěn)定內(nèi)含子，在神經(jīng)元中大量積累。此外，在某些神經(jīng)元中，該2.0 Kb內(nèi)含子經(jīng)選擇性剪接產(chǎn)生1.5 Kb 的內(nèi)含子[10]。

目前，LATs 轉(zhuǎn)錄本的功能尚不清楚，多個(gè)研究顯示其可能通過抑制病毒裂解相關(guān)基因表達(dá)及抑制宿主細(xì)胞凋亡以維持病毒潛伏狀態(tài)。例如LATs 編碼的miR-H2-3p 和miR-H6 分別靶向病毒ICP0 和ICP4，協(xié)同神經(jīng)元特異miR-138 抑制關(guān)鍵病毒基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)病毒潛伏或維持其潛伏狀態(tài)[11?13]，LAT 相關(guān)miR-H2 突變能通過上調(diào)ICP0 增強(qiáng)病毒神經(jīng)毒力和重激活水平[14]，并且，體外轉(zhuǎn)染LAT 表達(dá)質(zhì)粒及LAT 突變株動(dòng)物模型顯示LATs 能夠抑制Caspase 凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制pAKT 去磷酸化水平促進(jìn)感染細(xì)胞存活[15]。然而，一些研究也顯示，LAT 缺失的重組病毒仍可以在三叉神經(jīng)節(jié)有效建立潛伏感染[16-17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，人皮膚組織異種移植SCID 小鼠模型中，相比于野生型毒株，LAT 突變株（17ΔN/H）并不能在皮膚組織中有效復(fù)制并產(chǎn)生皮損表型[18]，該研究表明，HSV1 LAT 有助于病毒體內(nèi)的復(fù)制，其作用機(jī)制可能依賴于其潛在的表觀遺傳調(diào)控功能。

3 HSV1 感染中的表觀遺傳調(diào)控

3.1 表觀遺傳調(diào)控

表觀遺傳調(diào)控是指非DNA 編碼依賴的基因表達(dá)調(diào)控方式，如RNA/DNA 甲基化或染色質(zhì)修飾[2]。DNA 甲基化是由一系列DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化的，將一個(gè)甲基從s-腺苷蛋氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移到胞嘧啶殘基的第5個(gè)碳上，形成5mC[19]。而組蛋白修飾通常發(fā)生于組蛋白氨基末端，一般包含甲基化、乙酰化和磷酸化，不同修飾的組蛋白通過結(jié)合染色質(zhì)重塑復(fù)合物，參與基因組染色質(zhì)構(gòu)象調(diào)控，最終影響基因表達(dá)。例如，組蛋白乙?；ǔ０l(fā)生于轉(zhuǎn)錄活性基因上，其主要在啟動(dòng)子和編碼區(qū)的5’ 端的特定位點(diǎn)富集[20]。

3.2 HSV1 裂解感染過程中的表觀遺傳調(diào)控

早期對(duì)HSV1 表觀遺傳修飾的研究發(fā)現(xiàn)，衣殼包裹的病毒基因組DNA 在微球核酸酶（microsphere nuclease，MCN）作用下未產(chǎn)生類似宿主細(xì)胞的典型核小體條帶，這表明病毒DNA 未結(jié)合組蛋白形成染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[21]，而且，在裂解感染的細(xì)胞中，HSV1DNA 在MCN 酶解下也未能形成核小體條帶；相反，潛伏感染的三叉神經(jīng)節(jié)中病毒DNA卻呈現(xiàn)出高度濃縮的異染色質(zhì)化[21?23]。然而隨著染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的證據(jù)表明HSV1 裂解感染中也存在著廣泛的染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)修飾。Huang 和Kent 研究[24?25]發(fā)現(xiàn)，裂解感染細(xì)胞中，病毒DNA 能夠與組蛋白H3 共沉淀，并且病毒ICP0，TK 及VP16 基因啟動(dòng)子上的H3K9Ac 及K3K14c 修飾水平與其基因轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，這充分表明病毒裂解感染受到顯著的染色質(zhì)表觀遺傳調(diào)控。

事實(shí)上，初始感染中HSV1 雙鏈DNA 分子輸入宿主細(xì)胞核之后，會(huì)即刻進(jìn)行非DNA 復(fù)制依賴的核小體組裝。Paulus 等[26]研究表明，這種快速的外源DNA 染色質(zhì)形成可能是一種由細(xì)胞的ND10（Nuclear domain 10）介導(dǎo)的固有抗病毒防御機(jī)制，促進(jìn)宿主細(xì)胞對(duì)外來DNA 的沉默。Lee 等[27]使用原代人包皮成纖維細(xì)胞裂解感染模型的ChIP 分析也顯示，HSV1 感染的1～2 h 內(nèi)會(huì)迅速進(jìn)行核小體組裝，而抑制性異染色質(zhì)修飾H3K9me3 和H3K27me3 會(huì)迅速增加，其后隨感染進(jìn)程逐漸降低。此外，HSV1 裂解感染中，轉(zhuǎn)錄開放性染色質(zhì)修飾如H3K27Ac 等隨病毒復(fù)制進(jìn)程逐漸增加[28]，且藥物抑制H3K27Ac 能夠顯著抑制病毒復(fù)制[29]。

但HSV1 也進(jìn)化出抵抗宿主表觀遺傳沉默的機(jī)制，主要表現(xiàn)在病毒基因組上異染色質(zhì)修飾逐漸去除和常染色質(zhì)修飾增加[30]。而與病毒DNA一同進(jìn)入宿主細(xì)胞核的被膜蛋白VP16 和VP22 被證實(shí)參與抵抗宿主細(xì)胞組蛋白介導(dǎo)的表觀遺傳沉默。如上所述，VP16 隨病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞核后，除參與招募RNA 聚合酶外，VP16 也能夠招募染色質(zhì)修飾共激活因子如CBP 與p300，以及染色質(zhì)重塑復(fù)合物BRG1 與BRM 到病毒IE 基因啟動(dòng)子上，從而參與病毒復(fù)制早期的表觀遺傳調(diào)控[5]，見圖1。VP16 蛋白在裂解性感染期間降低IE 基因上的總?cè)旧|(zhì)水平，并促進(jìn)與HSV 裂解性基因相關(guān)的組蛋白常染色質(zhì)修飾[5]。此外，病毒即早期基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，如ICP0 與ICP4 也被證明可以減少病毒裂解基因啟動(dòng)子上的異染色質(zhì)并且增加組蛋白乙?；揎?。ICP0 作為E3 泛素連接酶，能夠降解著絲粒相關(guān)抑制性組蛋白變體如CENP-A，CENP-B 等。同時(shí)ICP0 也能夠通過與組蛋白去乙酰酶HDAC1/2 相互作用，干擾REST/CoREST轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物組成，從而促進(jìn)病毒染色質(zhì)上組蛋白乙?；揎梉31]。ICP4 作為病毒DNA 結(jié)合蛋白也能夠通過結(jié)合或干擾宿主細(xì)胞染色質(zhì)重塑因子NuRD 與INO80，調(diào)控病毒基因組表觀修飾[32]。VP16[33]或ICP0[34]缺陷的病毒突變體會(huì)造成病毒裂解相關(guān)基因啟動(dòng)子的異染色質(zhì)增加，表明病毒的被膜蛋白和IE 蛋白的表達(dá)會(huì)在裂解感染過程中促進(jìn)組蛋白的常染色質(zhì)修飾從而促進(jìn)裂解基因的表達(dá)。由此可見，HSV1 裂解感染中，預(yù)先存在的病毒被膜蛋白及早期轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)宿主的表觀遺傳調(diào)控是維持感染進(jìn)程的關(guān)鍵因素。

圖1 HSV1 基因的級(jí)聯(lián)表達(dá)和表觀修飾Fig.1 Cascade expression and epigenetic modification of HSV1 gene

3.3 潛伏感染中的表觀遺傳調(diào)控

3.3.1 潛伏基因組上組蛋白修飾在潛伏期，HSV1 的顯著特點(diǎn)是裂解基因表達(dá)沉默和潛伏期相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（LATs）的持續(xù)表達(dá)[35]。這種將基因組劃分為轉(zhuǎn)錄活性區(qū)和非轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的方式，表明HSV1 在潛伏期存在表觀遺傳控制[36]。先前Nicole J.Kubat[29]通過研究潛伏期小鼠背根神經(jīng)節(jié)分離的DNA，發(fā)現(xiàn)在任何區(qū)域都沒有明顯的DNA 甲基化，包括轉(zhuǎn)錄豐富的LAT 啟動(dòng)子和裂解基因ICP4，表明病毒的轉(zhuǎn)錄不受DNA 甲基化的調(diào)節(jié)，可能受到翻譯后組蛋白修飾的調(diào)節(jié)。

早在1989 年，Deshmane 和Fraser 發(fā)現(xiàn)潛伏感染的神經(jīng)元中病毒基因組與核小體結(jié)合，形成類似于宿主基因組相似的染色質(zhì)樣結(jié)構(gòu)[22,37]。隨后Bloom，Neumann 和Hill 小組通過使用染色質(zhì)免疫沉淀進(jìn)一步確認(rèn)了潛伏基因組上的染色質(zhì)化[29,37?39]。進(jìn)一步研究表明，LAT 區(qū)域是HSV1潛伏基因組中唯一富含轉(zhuǎn)錄允許性標(biāo)記的區(qū)域，其含有大量的H3K4Me2，H3K4Ac 和H3K14Ac等組蛋白修飾[40]。相比而言，潛伏期裂解基因上存在著大量的異染色質(zhì)，其通常與轉(zhuǎn)錄不活躍的基因有關(guān)，包含2 種形式：一種是結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，被認(rèn)為是不可逆的，如結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)標(biāo)記H3K9me2大量存在于潛伏期裂解基因上[41]；另一種為兼性異染色質(zhì)，是一種可逆抑制，其標(biāo)記H3K27Me3和macroH2A 也在潛伏期在裂解基因上富集[40]，見圖1。

3.3.2 潛伏期LAT 的表觀調(diào)控目前研究認(rèn)為，HSV1 基因組上廣泛分布的絕緣子序列元件是維持轉(zhuǎn)錄活性區(qū)與非轉(zhuǎn)錄活性區(qū)空間分隔的主要因素；其主要通過與特定結(jié)合蛋白如CTCF 與Suz12等，形成特定的基因組三維結(jié)構(gòu)，將LAT 常染色質(zhì)活性保持在一個(gè)邊界內(nèi)，而將異染色質(zhì)活性保持在另一邊界外[42]。Amelio 等[42]通過軟件預(yù)測(cè)HSV1 基因組存在7 個(gè)獨(dú)立的CTCF 結(jié)合位點(diǎn)，包括CTRL1，CTRL2，CTa’ m，CTRS1，CTRS2，CTRS3 與CTUS1，其中大部分位點(diǎn)位于基因組重復(fù)區(qū)內(nèi)的ICP0，ICP4 和LAT 等關(guān)鍵基因附近，見圖2。而Lang 等[43]應(yīng)用CTCF 靶向的ChIPseq 鑒定出HSV1 裂解感染中病毒基因組至少存在25 個(gè)CTCF 結(jié)合位點(diǎn)，且上述預(yù)測(cè)位點(diǎn)如CTRL2 與CTRS3 并未結(jié)合CTCF 蛋白。這充分表明，HSV1裂解與潛伏感染中，病毒基因組上的絕緣子元件與CTCF 的結(jié)合存在著動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，此外，研究顯示，AAV 介導(dǎo)的小鼠三叉神經(jīng)節(jié)CTCF 敲低促進(jìn)了潛伏病毒ICP0 轉(zhuǎn)錄，而ICP0 恰位于CTRL2 與CTa’ m 絕緣子之間[44]，并且，敲除HSV1 CTRL2絕緣子的突變株表現(xiàn)出增強(qiáng)的毒性，并且更難維持潛伏狀態(tài)[44]。三叉神經(jīng)節(jié)潛伏的突變株病毒出現(xiàn)明顯的ICP0 和ICP27 表達(dá)，以及病毒IE 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄抑制性組蛋白修飾H3K27Me3 顯著減少[45]，這表明，病毒自身的絕緣子元件的組裝參與調(diào)控裂解-潛伏感染中的病毒基因組結(jié)構(gòu)改變及表觀遺傳修飾調(diào)控。

圖2 LAT 上CTCF 結(jié)合位點(diǎn)和LAT 的表觀調(diào)控Fig.2 CTCF binding sites and epigenetic regulation of LAT on LAT

除絕緣子外，LAT 啟動(dòng)子區(qū)的不同調(diào)控元件也可能參與病毒潛伏-重激活過程中的表觀遺傳調(diào)控。LAT 5’ 外顯子增強(qiáng)子元件可通過募集組蛋白修飾酶，組成轉(zhuǎn)錄許可的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[39]。此外，LAT 啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)也存在甲狀腺激素響應(yīng)元件TRE。在體外感染的神母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，甲狀腺激素受體TR 能夠直接結(jié)合TRE 元件，促進(jìn)CTCF 蛋白與高乙酰化組蛋白H4 在LAT 區(qū)富集，進(jìn)而激活LAT 轉(zhuǎn)錄并抑制ICP0 表達(dá)[46]。

另一方面，病毒潛伏期LAT 轉(zhuǎn)錄本自身是否直接參與基因組表觀遺傳修飾仍存在較大爭(zhēng)議。Bloom 等[40]使用17 syn+株的LAT 啟動(dòng)子缺失病毒17△Pst（未影響絕緣子序列）發(fā)現(xiàn)，LAT 的缺失會(huì)導(dǎo)致潛伏病毒基因組H3K27me3 水平增加。相比之下，Knipe 等[7]使用KOS 株LAT 啟動(dòng)子缺失病毒KOS△Pst 觀察到潛伏基因組上H3K27me3水平降低。此外，運(yùn)用體外神經(jīng)元潛伏-重激活的模型研究也顯示，對(duì)比2 種HSV1 野生型菌株及其各自的LAT 啟動(dòng)子缺失病毒，LAT 以一種菌株特異性的方式影響染色質(zhì)標(biāo)記水平、病毒轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白產(chǎn)生[47]。

4 小結(jié)

HSV1 因其可以建立潛伏期并具有從潛伏期重激活的能力，成為一種在人體內(nèi)建立終身潛伏感染的病毒。目前對(duì)于HSV1 的治療主要是采用小分子抑制劑抑制裂解期病毒的復(fù)制。但不可否認(rèn)，目前治療藥物并不能靶向潛伏感染中病毒；而低免疫人群中HSV1 的反復(fù)發(fā)作也可能促進(jìn)病毒耐藥性突變的積累，從而成為HSV1 徹底根除的一大障礙?？紤]到表觀遺傳調(diào)控其在HSV1 裂解和潛伏感染維持中扮演的關(guān)鍵作用，可以推測(cè)表觀修飾相關(guān)小分子藥物如DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，組蛋白乙酰化/甲基化酶抑制劑等有希望成為全新的HSV1 抗病毒藥物，同時(shí)靶向裂解/潛伏中的病毒。

目前對(duì)裂解/潛伏中的HSV1 病毒基因組完整的染色質(zhì)組成及組蛋白修飾類型的理解尚不充分。隨著新型高通量表觀組學(xué)測(cè)序與空間組學(xué)技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用，有望解析HSV1 感染中基因組結(jié)構(gòu)組成的全貌及動(dòng)態(tài)調(diào)控。此外，除組蛋白修飾外，其他表觀遺傳修飾如RNAm6A 以及DNA 水平的5mC 修飾是否參與調(diào)控HSV1 感染進(jìn)程等問題仍待進(jìn)一步研究。