汪 茜 龔 睿 龍剛宇 黃朝林 張定宇

膿毒癥是宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào),導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙綜合征,與高發(fā)生率和高死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年有近5000萬(wàn)病例,其中超過(guò)25%～30%的患者死亡[2]。盡管目前關(guān)于膿毒癥的抗生素治療、液體復(fù)蘇及器官支持技術(shù)不斷改進(jìn),但其治療前景仍不理想[3]。因此,挖掘影響預(yù)后的相關(guān)基因并探討其指導(dǎo)臨床診療的意義仍是膿毒癥研究的熱點(diǎn)。

生物信息學(xué)方法已廣泛用于挖掘人類(lèi)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵基因簇,對(duì)揭示疾病潛在的分子機(jī)制和臨床診治靶點(diǎn)具有重要意義[4]。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及炎性反應(yīng)、免疫失衡、凝血功能障礙等多個(gè)方面,既往的單基因研究并不能全面的揭示膿毒癥復(fù)雜的病理生理學(xué)過(guò)程。因此,筆者從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus,GEO)中獲得膿毒癥生存與死亡患者外周血基因表達(dá)數(shù)據(jù),通過(guò)WGCNA分析,預(yù)測(cè)與膿毒癥預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因,并進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析、轉(zhuǎn)錄因子富集分析、免疫浸潤(rùn)分析、生存分析等,旨在探索膿毒癥預(yù)后相關(guān)的潛在核心基因及分子生物學(xué)機(jī)制,為尋找潛在的預(yù)測(cè)標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1．?dāng)?shù)據(jù)來(lái)源:通過(guò)在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵詞“sepsis”,篩選符合本研究要求的膿毒癥患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE54514、GSE65682、GSE5772,其注釋平臺(tái)分別為GPL6947、GPL13667、GPL4274。數(shù)據(jù)集GSE54514共有163例患者血液標(biāo)本,其中納入分析127例,包含96例(75.6%)膿毒癥存活患者,31例(24.4%)死亡患者;數(shù)據(jù)集GSE65682中有膿毒癥患者血液樣本802例,符合納入標(biāo)準(zhǔn)479例,其中生存組365例(76.2%),死亡組114例(23.8%)。數(shù)據(jù)集GSE5772共有94個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),健康對(duì)照組23例(24.5%),膿毒癥組71例(75.5%),用于驗(yàn)證疾病中存在顯著差異的核心基因。

2．WGCNA 和篩選關(guān)鍵基因:利用WGCNA-R包構(gòu)建數(shù)據(jù)集GSE54514和GSE65682的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),先篩選出方差前5000的基因用于后續(xù)分析?；诮茻o(wú)標(biāo)度拓?fù)涞臉?biāo)準(zhǔn),應(yīng)用函數(shù)“sftMYMpowerEstimate”選擇合適的軟閾值,詳細(xì)流程為:(1)計(jì)算基因之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。(2)通過(guò)α=|cor|β構(gòu)建加權(quán)基因鄰接矩陣,其中α表示兩個(gè)基因之間的鄰近系數(shù),cor表示兩個(gè)基因之間的Pearson相關(guān)系數(shù),β為可設(shè)定的軟閾值。然后將加權(quán)鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣(topological overlap matrix,TOM)來(lái)估計(jì)網(wǎng)絡(luò)連接度,運(yùn)用層次聚類(lèi)的方法構(gòu)建TOM的聚類(lèi)樹(shù)結(jié)構(gòu),獲得不同的基因模塊。結(jié)合標(biāo)本的臨床數(shù)據(jù)通過(guò)計(jì)算基因顯著性(gene significance, GS)與模塊成員(module membership, MM)識(shí)別與膿毒癥預(yù)后相關(guān)的模塊和基因。本研究選取數(shù)據(jù)集GSE54514與GSE65682中與預(yù)后相關(guān)性最高的兩個(gè)模塊的交集基因作為關(guān)鍵基因。

圖1 數(shù)據(jù)集GSE54514、GSE65682的WGCNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

3．基因功能富集分析:使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO功能注釋和 KEGG通路富集分析。最小基因重疊數(shù)(min overlap)≥3 及P<0.01即視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路。

4．轉(zhuǎn)錄因子富集分析:使用R軟件中RcisTarget包構(gòu)建分析,通過(guò)基因基序排名和轉(zhuǎn)錄因子的基序注釋,來(lái)識(shí)別富集的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)結(jié)合基序(binding motifs)和候選的TF,歸一化富集分?jǐn)?shù)(normalized enrichment score, NES)≥3.0的基序被保留并被注釋到相應(yīng)的 TF進(jìn)行分析。

5．免疫浸潤(rùn)分析:使用CIBERSORT算法對(duì)不同組患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,評(píng)估22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相對(duì)比例。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Kaplan-Meier法構(gòu)建生存曲線,采用Spearman相關(guān)性分析評(píng)價(jià)基因?qū)γ庖呓?rùn)的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．構(gòu)建WGCNA與篩選關(guān)鍵基因:通過(guò)R語(yǔ)言WGCNA包分析數(shù)據(jù)集GSE54514、GSE65682,基于無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)準(zhǔn),本研究分別選取β=5和β=12作為數(shù)據(jù)集GSE54514與GSE65682的軟閾值。然后通過(guò)動(dòng)態(tài)樹(shù)切割算法在GSE54514和GSE65682中分別檢測(cè)到9個(gè)和12個(gè)基因模塊,其中GSE54514中的綠色模塊(cor= 0.61,P<0.01)和GSE65682中的棕色模塊(cor= 0.18,P<0.01)與膿毒癥的預(yù)后相關(guān)性最高(圖1中A、C)。將兩個(gè)模塊與膿毒癥的生存表型相關(guān)聯(lián)后,使用模塊成員(module members,MM)相對(duì)于膿毒癥生存特征的基因顯著性(gene significance,GS)做散點(diǎn)圖,可見(jiàn)GSE54514中的綠色模塊(cor= 0.42,P<0.01)與GSE65682中的棕色模塊(cor= 0.37,P<0.01)內(nèi)GS和MM之間存在相關(guān)性(圖1中B、D),表明兩個(gè)模塊中的基因與膿毒癥預(yù)后相關(guān)。通過(guò)維恩圖繪制GSE54514的綠色模塊基因和GSE65682的棕色模塊基因的交集,篩選出20個(gè)關(guān)鍵基因(圖2)。

圖2 維恩圖

2.基因功能富集分析:對(duì)篩選得到的關(guān)鍵基因進(jìn)行富集分析,設(shè)置條件為min overlap≥3及P<0.01,結(jié)果顯示,基因主要富集于細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、單核細(xì)胞遷移等通路(圖3)。

圖3 關(guān)鍵基因的功能富集分析

3.轉(zhuǎn)錄因子富集分析:共表達(dá)基因受轉(zhuǎn)錄因子等機(jī)制的共同調(diào)節(jié)。因此對(duì)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行富集分析,包括利用累計(jì)恢復(fù)曲線進(jìn)行基序富集分析、motif-TF注釋以及重要基因的選擇。分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄因子ZNF148是基因集中的主要調(diào)控因子之一(NES=4.49),motif注釋為cisbp_M6552,其中LST1、CHD8等6個(gè)基因在此基序中富集。筆者對(duì)基因集中前10位的富集基序和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了展示(表1),使用RcisTarget包繪制了富集基序和相應(yīng)基因的互作網(wǎng)絡(luò)(圖4)。

表1 前10位富集基序和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子

圖4 關(guān)鍵基因與富集基序的互作網(wǎng)絡(luò)

4.篩選核心基因:為了進(jìn)一步篩選核心基因,選取數(shù)據(jù)集GSE5772對(duì)20個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)差異分析。結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組比較,基因FGD3、MBP、MSN、RNF130、SETD1B在膿毒癥患者中的表達(dá)顯著下調(diào)(圖5),這5個(gè)基因?yàn)榕c膿毒癥預(yù)后相關(guān)的潛在核心基因。

圖5 數(shù)據(jù)集GSE5772中關(guān)鍵基因的表達(dá)差異分析

根據(jù)NES值的大小,前10個(gè)基序在表1進(jìn)行展示;/.該基序無(wú)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子

5.免疫浸潤(rùn)分析:首先對(duì)數(shù)據(jù)集GSE54514和GSE65682的數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,然后通過(guò)CIBERSORT算法評(píng)估膿毒癥生存組和死亡組中22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的差異。結(jié)果顯示,與生存組比較,死亡組中漿細(xì)胞、靜止記憶CD4+T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞顯著升高;幼稚CD4+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)、靜止樹(shù)突狀細(xì)胞顯著降低(圖6A,P<0.05)。通過(guò)分析核心基因與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)5個(gè)核心基因與免疫細(xì)胞含量均有較強(qiáng)的相關(guān)性(圖6B)。

圖6 免疫浸潤(rùn)分析

6.生存分析:為評(píng)估篩選出的5個(gè)核心基因與膿毒癥患者生存率的關(guān)系,使用Kaplan-Meier法對(duì)數(shù)據(jù)集GSE65682中基因差異表達(dá)的患者進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示,膿毒癥患者中基因FGD3、MSN、RNF130高表達(dá)組的生存率高于低表達(dá)組(P<0.05),而MBP、SETD1B的表達(dá)水平與膿毒癥患者的生存率無(wú)關(guān)(圖7)。

圖7 5個(gè)核心基因的生存曲線

討 論

膿毒癥是一種危及生命的嚴(yán)重感染性疾病,是危重病患者中最常見(jiàn)的直接死因[5]。因此,若能早期識(shí)別膿毒癥可能的預(yù)后結(jié)局并采取更為精準(zhǔn)的干預(yù)治療,將可能顯著降低膿毒癥的病死率。

本研究采用兩個(gè)不同的膿毒癥數(shù)據(jù)集進(jìn)行WGCNA分析,從而獲得與膿毒癥預(yù)后相關(guān)性最高的“綠色”和“棕色”模塊。較單一的基因差異表達(dá)分析,WGCNA在很大程度上能更靈敏地識(shí)別具有生物意義的基因。隨后對(duì)兩個(gè)模塊的基因取交集進(jìn)行維恩分析,篩選到20個(gè)關(guān)鍵基因。經(jīng)GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),這20個(gè)關(guān)鍵基因主要富集在細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、單核細(xì)胞遷移等通路。

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子富集分析表明,轉(zhuǎn)錄因子ZNF148可能是關(guān)鍵基因的主要調(diào)節(jié)因子之一。有研究證實(shí),富集在此基序上的6個(gè)基因中LST1、EFHD2和ARID3A可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖、凋亡和分化。其中主要調(diào)節(jié)因子ZNF148已被證明是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子,并且ZNF148可通過(guò)靶向特定基因在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有重要作用[6,7]。Essien等[8]研究發(fā)現(xiàn),ZNF148fl/fl小鼠較野生型小鼠感染風(fēng)險(xiǎn)更高且表現(xiàn)出更低的生存率。目前認(rèn)為免疫細(xì)胞的凋亡是膿毒癥免疫抑制的主要原因,并與繼發(fā)感染風(fēng)險(xiǎn)和不良結(jié)果相關(guān)[9]。但膿毒癥疾病變化過(guò)程中的淋巴細(xì)胞是否與ZNF148呈相關(guān)性還有待于進(jìn)一步探索。

膿毒癥是由于機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的一種異質(zhì)性綜合征,個(gè)體之間具有不同的免疫狀態(tài)和生物過(guò)程,其中以炎癥過(guò)度激活和免疫抑制為特征的免疫失衡被認(rèn)為是膿毒癥發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。研究表明,膿毒癥免疫功能紊亂與免疫細(xì)胞在不同階段的反應(yīng)特征密切相關(guān)[11]。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)集GSE5772對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)差異分析并識(shí)別到與膿毒癥預(yù)后顯著相關(guān)的5個(gè)潛在核心基因。免疫浸潤(rùn)分析表明,這5個(gè)核心基因均與免疫細(xì)胞含量有較強(qiáng)的相關(guān)性,其中生存分析顯示,FGD3、MSN和RNF130可作為膿毒癥患者預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo),而且這些基因高表達(dá)的患者預(yù)后較好。

FGD3編碼的蛋白主要參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和抑制細(xì)胞遷移等作用。根據(jù)基因圖譜中的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)FGD3在T細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫反應(yīng)細(xì)胞中高表達(dá)[12]。目前關(guān)于FGD3與膿毒癥的相關(guān)報(bào)道較少,但已發(fā)現(xiàn)FGD3可預(yù)測(cè)乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥的良好預(yù)后[13]。Moesin是MSN編碼的一種細(xì)胞骨架蛋白,在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞激活和遷移及非特異性免疫等方面起到重要作用[14]。有研究表明,抑制moesin的表達(dá)可抑制脂多糖誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子釋放[15]。這與本研究中發(fā)現(xiàn)MSN在膿毒癥中明顯下調(diào)并與患者生存率顯著相關(guān)的結(jié)果一致。RNF130編碼的蛋白是一種E3泛素連接酶,屬于PA-TM-RING 家族,主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自身免疫[16]。Qin等[17]研究發(fā)現(xiàn),RNF130在宮頸癌中低表達(dá)并可作為疾病預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,可能與鐵死亡和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。然而目前針對(duì)其與膿毒癥的國(guó)內(nèi)外研究較為少見(jiàn)。

本研究基于生物信息學(xué)分析,篩選出5個(gè)與膿毒癥預(yù)后相關(guān)的潛在核心基因,這5個(gè)核心基因與免疫細(xì)胞密切相關(guān)。其中FGD3、MSN和RNF130具有作為膿毒癥預(yù)后指標(biāo)的潛力,可進(jìn)一步為臨床診療和藥物開(kāi)發(fā)等醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化方面提供新舉措。