李 鵬 王 勛 韓翠敏 汪明瑯 王怡練 孫黎明

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)目前是我國居民病死率最高的疾病,作為一種常見的慢性心血管疾病,冠心病(coronary heart disease,CHD)是其中重要的疾病之一,近年來病死率也呈持續(xù)上升趨勢,特別在農(nóng)村地區(qū)尤為明顯[1]。冠心病的根本原因是動脈粥樣硬化,早期主要表現(xiàn)為內(nèi)皮功能受損,而后巨噬細(xì)胞堆積、炎癥及脂質(zhì)分子參與,導(dǎo)致粥樣斑塊形成及肌層纖維化,最終引起管腔狹窄、阻塞,導(dǎo)致心肌缺血、缺氧。臨床主要表現(xiàn)為心絞痛、心肌梗死甚至猝死等。血清長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類與 mRNA 結(jié)構(gòu)相近,但長度>200個核酸的 RNA 分子,由于其序列中開放閱讀框的缺乏而不參與蛋白質(zhì)編碼,是廣泛分布于各種生物中的多功能調(diào)節(jié)劑[2]。

近年來研究表明,多種lncRNAs參與動脈粥樣硬化的形成[3]。其中人類母系印記基因lncRNA H19是較早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一,曾被報道其多態(tài)性與中國人群的CVD風(fēng)險有關(guān)[4]。另外心肌肥大相關(guān)轉(zhuǎn)錄本lncRNA CHAST近年來亦被報道參與動脈粥樣硬化形成的過程[5]。但lncRNA H19在急性、慢性冠狀動脈綜合征中的表達(dá)差異及l(fā)ncRNA CHAST在冠心病中的具體表達(dá)情況未見有進(jìn)一步的研究。因此本研究通過測定入組患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST相對表達(dá)水平,探討lncRNA H19、lncRNA CHAST 在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用及其臨床價值。

材料與方法

1.研究對象:選取 2021年6月～2022 年5月在筆者醫(yī)院心血管內(nèi)科住院患者共 197 例,分為 3 組,即急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)組76 例、慢性冠狀動脈綜合征(chronic coronary syndrome,CCS)組59例和對照組(control組)62例。納入標(biāo)準(zhǔn):冠心病患者均經(jīng)冠狀動脈造影顯示至少1根主要心臟血管狹窄程度≥50%,ACS患者符合《急性冠狀動脈綜合征急診快速診療指南(2019)》[6],包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不穩(wěn)定性心絞痛,CCS組患者符合2019年歐洲心臟病學(xué)會慢性冠狀動脈綜合征的診斷和管理指南,包括慢性穩(wěn)定性勞力型心絞痛、缺血性心肌病及ACS之后穩(wěn)定的病情階段[7]。對照組均經(jīng)冠狀動脈造影排除冠心病。排除標(biāo)準(zhǔn):①心臟瓣膜病、先天性心臟病、心力衰竭、血管痙攣性心絞痛、惡性心律失常;②嚴(yán)重感染、肝腎功能或其他重要器官衰竭;③系統(tǒng)疾病如血液病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤患者;④年齡小于 18 歲的患者,孕婦及哺乳期女性;⑤不自愿入組者以及病史資料不全者。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:2022K005),所有入組患者均簽署知情同意書。

2.觀察指標(biāo):收集入組患者的一般臨床資料,包括性別、年齡、身高、體重、吸煙史、飲酒史等。實驗室指標(biāo):甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)以及l(fā)ncRNA H19、lncRNA CHAST的相對表達(dá)水平。

3.主要儀器與試劑:實時熒光定量PCR儀(type:StepOnePlus),RNA提取試劑盒(RNAliquid blood RNA kit, RN23)購自北京艾德萊生物有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fast King KT, KR116)、熒光定量試劑盒(FastFire qPCR preMix,FP207)試劑盒均購自天根生物科技有限公司,引物合成由通用生物科技有限公司完成。

4.標(biāo)本采集:所有入組患者均于次日取平臥位抽取空腹外周靜脈血4ml,放于EDTA抗凝管中,立即于溫控離心機(jī)下4℃ 3000r/min 離心15min,離心后取上層清液置于1.5ml RNase EP管,-80℃下保存待用。

5.RNA提取及實時熒光定量:按照試劑盒說明書取0.25μl血清樣本加入0.75μl裂解液混勻后按步驟提取總RNA,用Q9000分光光度儀測量其吸光度A值。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,各樣本取1μg RNA,去除gDNA后,于20μl體系下42℃孵育15min,95℃孵育3min后置于冰上反轉(zhuǎn)錄為cDNA。兩步法實時熒光(SYBR Green)定量分析,每個樣本設(shè)3個復(fù)孔,參數(shù)為95℃ 1min預(yù)變性,95℃ 5s變性,60℃ 15s退火 40個循環(huán)。U6為內(nèi)參基因,測量各個樣本中l(wèi)ncRNA H19、lncRNA CHAST平均Ct值,采用2-ΔΔCt法計算其相對表達(dá)量。引物序列詳見表1。

表1 各引物序列

結(jié) 果

1.各組患者一般資料及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平比較:各組患者年齡、BMI、糖尿病史、飲酒史、TG、TC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較,ACS組和CCS組性別、吸煙史、高血壓史、LDL、HDL、hs-CRP、TNF-α、IL-6及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平等指標(biāo)存在顯著性差異(P<0.05)。與CCS組比較,ACS組患者LDL、hs-CRP、TNF-α、IL-6及血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),HDL表達(dá)水平降低(P<0.05),詳見表2。

表2 各組資料比較

2.血清lncRNA H19和lncRNA CHAST表達(dá)水平診斷CHD的ROC曲線分析:血清lncRNA H19、lncRNA CHAST及聯(lián)合診斷CHD的ROC曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.9025(95%CI:0.8607～0.9443)、0.7749(95%CI:0.7116～0.8383)和0.9299(95%CI:0.8948～0.9649),最佳截斷值為1.29、1.56和0.98,特異性為75.6%、62.3%和73.3%,敏感度為88.7%、75.8%和93.5%,約登指數(shù)為0.643、0.477和0.668(圖1)。

圖1 lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平診斷CHD的ROC曲線

3.血清lncRNA H19 和lncRNA CHAST表達(dá)水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性:Pearson相關(guān)性分析表明CHD患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平與hs-CRP、IL-6、TNF-α、LDL呈正相關(guān),與HDL呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),詳見表3。

表3 CHD患者血清H19、CHAST表達(dá)水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

4.Logistic多因素回歸分析CHD患者的危險因素:結(jié)果表明lncRNA H19、lncRNA CHAST、LDL、hs-CRP、吸煙、高血壓均為CHD的獨(dú)立危險因素(P<0.05),詳見表4。

表4 Logistic多因素回歸分析CHD危險因素

討 論

近年來,冠心病的發(fā)生率呈逐年上升趨勢,且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化[1]。動脈粥樣硬化是冠心病的根本原因,其源于內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并最終由炎癥和免疫反應(yīng),脂質(zhì)代謝,血管平滑肌的增殖和凋亡等機(jī)制共同參與形成動脈硬化斑塊[8]。lncRNAs廣泛分布于細(xì)胞核及胞質(zhì)中,部分以外泌體等形式穩(wěn)定存在于血漿中[9]。lncRNAs可介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,以及翻譯程序和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控, lncRNA還可以與mRNA及蛋白質(zhì)相互作用,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾,這些作用大多是通過招募、信號、誘導(dǎo)、增強(qiáng)子及支架作用來實現(xiàn)的[10,11]。lncRNAs近年來被發(fā)現(xiàn)參與了冠心病形成的多個過程,如lncRNA Malat1可通過調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的功能及促炎介質(zhì)的表達(dá)進(jìn)而影響脈粥樣硬化[3,12]。

lncRNA H19位于人類染色體11p15.5上,曾有研究報道lncRNA H19水平升高與冠狀動脈疾病的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)[13]。Tang等[14]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA H19亦可通過miR-152/VEGFA軸促進(jìn)氧化型LDL(Ox-LDL)誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。而lncRNA CHAST位于人類7號染色體上,可由去氧腎上腺素、異丙腎上腺素以活化的T 細(xì)胞 (nuclear factor of activated T cell,NFAT)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核因子激活[15]。有研究表明,在早期心肌梗死患者血清中l(wèi)ncRNA CHAST表達(dá)水平升高[5]。以上研究均提示lncRNA H19與lncRNA CHAST可能與冠心病相關(guān)。本研究表明,冠心病患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST的表達(dá)水平較對照組明顯升高(P< 0.05)。且ACS患者的lncRNA H19、lncRNA CHAST相較于CCS患者表達(dá)水平增高(P<0.05)。本研究顯示,lcnRNA H19、lncRNA CHAST參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展,這可能與其參與炎癥、脂質(zhì)代謝及內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等因素相關(guān)。

ROC曲線分析結(jié)果表明,lncRNA H19、lncRNA CHAST對診斷冠心病有一定的價值。AUC分別為0.9025、0.7749。且兩者聯(lián)合診斷冠心病的AUC達(dá)到了0.9299,表明lncRNA H19、lncRNA CHAST聯(lián)合對冠心病具有較好的診斷效能。高珩等[16]曾報道在冠心病患者中血清lncRNA H19表達(dá)升高,對診斷冠心病有一定的價值,本研究結(jié)果與之相似,且本研究表明lncRNA CHAST對冠心病也有同樣的診斷價值。提示lncRNA H19、lncRNA CHAST或可作為診斷冠心病的血清標(biāo)志物。

冠心病本質(zhì)上是一種慢性炎癥性疾病,炎性細(xì)胞因子貫穿動脈粥樣硬化病變的整個過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后,LDL沉積在內(nèi)皮下形成Ox-LDL,單核細(xì)胞在黏附因子和趨化因子的作用下聚集到內(nèi)皮下分化形成巨噬細(xì)胞并吞噬大量的Ox-LDL 形成泡沫細(xì)胞[17]。同時產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子,引發(fā)一系列炎性反應(yīng),使得內(nèi)皮損傷及趨化作用進(jìn)一步加劇[18,19]。miRNA let-7是一種與炎癥及脂質(zhì)代謝相關(guān)的miRNA,可通過NF-κB/let-7/IL-6軸促進(jìn)血管炎癥的發(fā)展,有研究表明,lncRNA H19可通過調(diào)節(jié)NF-κB下調(diào)miRNA let-7來促進(jìn)IL-6的表達(dá)[20],此外lncRNA H19還可以通過分子海綿作用直接靶向調(diào)節(jié)miRNA let-7促進(jìn)炎性反應(yīng)[21]。而lncRNA CHAST是自噬相關(guān)的lncRNA之一,冠心病患者心肌時常處于缺血狀態(tài),加重了心肌的自噬現(xiàn)象,進(jìn)一步激活了機(jī)體的炎性狀態(tài),受損的自噬通量有助于炎癥的激活[22]。此外,lncRNA CHAST表達(dá)調(diào)節(jié)的也可由NFAT信號激活,NFAT是一種具有多向調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄因子,受多種信號通路調(diào)節(jié),參與血管壁相關(guān)細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成和血管炎癥[15, 22]。以上研究均支持lncRNA H19、lncRNA CHAST與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明,炎性細(xì)胞因子hs-CRP、IL-6、TNF-α以及LDL、HDL等指標(biāo)在ACS組、CCS組及健康對照組間存在顯著性差異。且 lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平與炎性細(xì)胞因子hs-CRP、IL-6、TNF-α以及LDL呈正相關(guān),與HDL呈負(fù)相關(guān)。再次證明lncRNA H19、lncRNA CHAST與炎性反應(yīng)密切相關(guān),提示 lncRNA H19、lncRNA CHAST可能通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子及脂蛋白的表達(dá)水平而影響冠心病的發(fā)展。將lncRNA H19、lncRNA CHAST、hs-CRP、IL-6、TNF-α、LDL、吸煙、高血壓、性別等因素經(jīng)Logistic多因素回歸分析表明,lncRNA H19、lncRNA CHAST均為冠心病的獨(dú)立危險因素。

綜上所述,冠心病患者血清lncRNA H19、lncRNA CHAST表達(dá)水平較正常人升高,其中ACS患者血清表達(dá)水平高于CCS患者。lncRNA H19、lncRNA CHAST在冠心病患者中與hs-CRP、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子及LDL的表達(dá)呈正相關(guān),與HDL呈負(fù)相關(guān),lncRNA H19、lncRNA CHAST是冠心病的獨(dú)立危險因素,并可作為診斷冠心病的血清標(biāo)志物,可能成為未來基因治療的靶點(diǎn)。