梅 貴，陸正陽，谷英姿，石 可，熊 慧，陳 玉，楊光忠,

1. 中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074

2. 中南民族大學化學與材料科學學院，湖北 武漢 430074

3. 國家中醫(yī)藥管理局民族藥學三級實驗室，湖北 武漢 430074

大苞藤黃GarciniabracteataC. Y. Wu ex Y. H.Li，又稱為花皮樹、萬年果（云南麻栗坡），為藤黃科（Guttiferae）藤黃屬GarciniaL.植物，主要分布于中國云南南部至廣西南部，生于海拔400～1 300 m 的石灰山雜林中。藤黃屬植物用于治療多種疾病，如炎癥、氧化應激、微生物感染和癌癥。大苞藤黃果實可食用且具有極高的營養(yǎng)價值，富含維生素、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[1-2]。近年來，通過對其莖皮[3]、葉[3-7]、枝干[2,8-11]及果實[11-12]的植物化學研究發(fā)現(xiàn)該植物含有多環(huán)多異戊烯基間苯三酚類化合物（polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols，PPAPs）、二苯甲酮衍生物、酮、黃酮、三萜、甾體、聯(lián)苯等多種結構類型的化學成分，其中酮和PPAPs 是其特征及活性成分。課題組前期從大苞藤黃果實中分離出一系列結構新穎的PPAPs和酮類化合物，并展現(xiàn)出抗腫瘤、抗炎和降血糖等多種生物活性[13-16]。為進一步實現(xiàn)藥用植物的可持續(xù)利用和發(fā)現(xiàn)結構新穎的天然產(chǎn)物，本研究對大苞藤黃葉的化學成分進行了系統(tǒng)研究，采用正、反相硅膠柱色譜及半制備高效液相色譜等多種分離技術進行分離純化，并通過波譜學數(shù)據(jù)和量子化學的計算鑒定化合物結構。從大苞藤黃葉醋酸乙酯提取物中分離得到了12 個化合物（圖1），分別鑒定為1,3,5-三羥基-5,6,7,8- 四氫酮（ 1,3,5-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydroxanthone，1）、1,3-二羥基-5-羰基-5,6,7,8-四氫酮（1,3-dihydroxy-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydroxanthone，2）、1,3,5,6-四羥基-8-異戊烯基縮酚酸環(huán)醚（1,3,5,6-tetrahydroxy-8-prenyl-depsidone，3）、松脂醇（pinoresinol，4）、對羥基苯丙烯酸[3-(4-hydroxyphenyl) acrylic acid，5]、3-甲氧基-4,4',5-三醇聯(lián)苯（[1,1'-biphenyl]-3-methoxy-4,4',5-triol，6）、(2S)-2,9-巨豆二羥基-6-烯-1-酮 [(2S)-2,9-dihydroxymegastigm-6-en-1-one，7]、(2R)-2,9-巨豆二羥基-6-烯-1-酮 [(2R)-2,9-dihydroxy-megastigm-6-en-1-one，8]、(5Z)-9-羥基-1,5-巨豆二烯-2-酮 [(5Z)-9-hydroxy-1,5-megastigmadien-2-one，9]、2-氧代-α-紫羅蘭醇（2-oxo-α-ionol，10）、黑麥草內(nèi)酯（loliolide，11）、gardeterpenone A（12）?；衔?、2 為新的酮類化合物，化合物3 為新的縮酚酸類化合物，命名為為大苞藤黃甲素、大苞藤黃乙素和大苞藤黃丙素（garbractinones A～C）；化合物7～10 為降倍半萜類化合物，化合物11～12 為單萜類化合物，均是首次從大苞藤黃葉中分離得到。CCK-8 實驗表明，所有化合物（50 μmol/L）對人非小細胞肺癌A549 細胞沒有表現(xiàn)明顯的抗增殖活性，其抑制率小于50%。

圖1 化合物1～12 的結構Fig.1 Structures of compounds 1—12

1 儀器與材料

AM-500/600 型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Ultimate 3000 半制備型高效液相色譜儀（美國戴安公司，VWD，DAD 檢測器）；半制備型色譜柱（YMC-Pack ODS-A，250 mm×10 mm，5 μm）；AX224ZH/E 型電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；柱色譜硅膠（200～300、300～400 目，青島海洋化工廠）；石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇（分析純，國藥集團）；甲醇（色譜級，Sigma 公司）；乙腈（色譜級，中國昌泰興業(yè)有限公司）；ZF1-II 紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；UH5300紫外可見分光光度計（日立高新技術公司）；Autopo1IV-T 全自動數(shù)字旋光儀（美國魯?shù)婪蚬荆?；Chirascan Plus 圓二色譜儀（美國應用光物理公司）；Q Exactive 高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）。高糖培養(yǎng)基（DMEM，美國Gibco 公司）；0.25%胰酶-EDTA 消化液（美國Gibco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Gibco 公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物科技有限公司）；青-鏈霉素混合液（雙抗，美國Gibco 公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，北京索萊寶科技有限公司）；SP-MAX3500FL 多功能酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）；紫杉醇（貨號B21695，上海源葉生物科技有限公司）；冬凌草甲素（自制，質(zhì)量分數(shù)大于98%）。

大苞藤黃葉于2021 年9 月采集于云南省文山州西疇縣，由中南民族大學藥學院劉新橋教授鑒定為藤黃科藤黃屬植物大苞藤黃G.bracteataC. Y. Wu ex Y. H. Li 的葉，植物標本（20210901）保存于中南民族大學藥學院藥用植物標本室。

2 方法

2.1 提取與分離

取干燥的大苞藤黃葉20.0 kg，粉碎成粗粉，將粗粉置于95%乙醇中浸泡，室溫提取3 次，每次24 h。將浸提液進行減壓抽濾，合并濾液濃縮干燥，得到乙醇浸膏2.29 kg。將上述浸膏用10%甲醇-水溶解，再依次用石油醚、醋酸乙酯萃取3 次，濃縮、干燥后得到醋酸乙酯提取物0.43 kg。取醋酸乙酯粗提物0.3 kg，用硅膠（200～300 目）柱色譜進行分離，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1、3∶7、0∶1）為洗脫液進行梯度洗脫，TLC檢測合并所得的組分，最后得到13 個組分（A～M）。將H 組分（14.27 g）用反相硅膠柱色譜進行分離，用30%、50%、60%、70%、80%、100%水-甲醇依次洗脫后，TLC 檢測合并所得的組分，最后得到10個組分（H.01～H.10）。再將其中的H.02 和H.03 組分合并過正相硅膠柱，以石油醚-醋酸乙酯（10∶1、6∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1、0∶1）為洗脫液進行梯度洗脫，得到19 個組分（H0203-01～H0203-19）。將組分H0203-10 通過高效液相色譜（DAD 檢測器，乙腈-水24∶76）分離純化，得到化合物7（1.23 mg，tR＝17.1 min）、8（1.12 mg，tR＝17.8 min）、5（68.36 mg，tR＝13.5 min）、11（9.15 mg，tR＝26.4 min）和6（4.83 mg，tR＝28.6 min）。將組分H0203-13 通過高效液相色譜（乙腈-水27∶73）分離純化，得到化合物3（10.18 mg，tR＝96.1 min）和4（10.37 mg，tR＝29.3 min）。將組分H0203-14 通過高效液相色譜（乙腈-水25∶75）分離純化，得到化合物1（18.9 mg，tR＝22.9 min）。將組分H0203-12 通過高效液相色譜（乙腈-水22∶78）分離純化，得到化合物10（1.4 mg，tR＝50.1 min）和9（4.18 mg，tR＝27.5 min）。將組分H0203-7 通過高效液相色譜（乙腈-水27∶73）分離純化，得到化合物2（11.9 mg，41.2min）和12（4.2 mg，tR＝14.0 min）。

2.2 抗增殖活性測試

采用CCK-8 法測定化合物體外抑制A549 細胞增殖活性[17]。以化合物1～12 為實驗組，紫杉醇和冬凌草甲素為陽性對照組，同時設對照組（等體積的不含細胞空白培養(yǎng)基）和空白組（等體積的含10%CCK-8 培養(yǎng)基）。取處于對數(shù)生長期的A549 細胞，以5×103個/孔密度接種于96 孔板培養(yǎng)至細胞貼壁后給藥，每孔加入濃度為50 μmol/L 的受試化合物（1～12）100 μL 于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后，吸棄各培養(yǎng)孔上清液，向每孔加入100 μL含10% CCK-8 工作液的培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度（A）值。重復實驗3 次，各組分別設定6個復孔。根據(jù)測得的A值計算抑制率。

抑制率＝(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)

3 結果與分析

3.1 結構鑒定

表1 化合物1 和2 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)Table 1 1 H-NMR and 13C-NMR data of compounds 1—2

圖4 化合物1 的實驗ECD 和計算ECD 圖譜Fig.4 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2：黃色粉末，由HR-ESI-MSm/z:247.060 12 [M＋H]+（C13H11O5+，計算值247.061 01），結合13C-NMR 及DEPT 135 數(shù)據(jù)確定該化合物的分子式為C13H10O5，不飽和度為9。同化合物1 相比，多1 個飽和度，比較2 個化合物的NMR 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物2 比化合物1 多1 個共軛羰基的信號δC192.4 (s)，而少1 個連氧次甲基的信號，說明化合物2 為化合物1 的5-OH 氧化成羰基，HMBC 圖譜中H-6 (δH3.12) 與δC150.5 (C-5a), 192.4 (C-5) 相關，H-8 (δH2.96) 與δC128.5 (C-8a), 182.1 (C-9),δC150.5(C-5a) 相關證實了上述推斷，因而，化合物2 的結構鑒定為1,3-二羥基-5-羰基-5,6,7,8-四氫酮。

化合物3：橙黃色無定型粉末，由HR-ESI-MSm/z: 345.096 86 [M＋H]+（C18H17O7+，計算值345.096 88），結合13C-NMR 及DEPT 數(shù)據(jù)確定該化合物的分子式為C18H16O7，不飽和度為11。1HNMR 圖譜（表2）顯示有1 對苯環(huán)間位偶合的芳香質(zhì)子信號 [δH6.18 (1H ,d,J= 3.0 Hz ), 6.40 ( 1H , d,J= 3.0 Hz )]，1 個孤立的芳香質(zhì)子信號δH6.57 (1H,s)，2 個單峰甲基信號 [δH1.70 (3H, s)；1.66 (3H, s)]，1 個亞甲基信號 [δH3.40 (2H, d,J= 7.0 Hz)]，1 個雙鍵質(zhì)子信號 [δH5.19 (1H, t,J= 7.5 Hz)]。由13C-NMR和DEPT-135 圖譜可知存在1 個共軛酯羰基 [δC166.5 (s)]，1 個異戊烯基 [δC32.7 (t), 124.5 (d), 134.0(s), 18.1 (q), 26.1 (q)]，3 個sp2雜化的次甲基 [δC102.0 (d), 100.5 (d), 115.2 (d)]，9 個非質(zhì)子化的碳[150.2 (s), 156.5 (s), 154.6 (s), 151.4 (s), 135.4 (s),151.7 (s), 138.2 (s), 113.5 (s), 127.8 (s)]，綜合以上數(shù)據(jù)，推測該化合物結構類型為縮酚酸環(huán)醚，帶有4個羥基和1 個異戊烯基[19]。A 環(huán)的羥基取代的模式同化合物1 一致，HMBC 證實了上述推斷。HMBC圖譜中H-7 (δH6.57) 與δC151.7 (C-6), 135.4 (C-5),113.5 (C-8a) 相關，H2-11 (δH3.40) 與δC113.5 (C-8a), 115.2 (C-7), 138.2 (C-8) 相關，說明剩余的2 個羥基分別連在C-5 和C-6 位，異戊烯基連在C-8。綜上所述，鑒定化合物3 的結構為1,3,5,6-四羥基-8-異戊烯基縮酚酸環(huán)醚。

表2 化合物3 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù) (500/125 MHz, CD3OD)Table 2 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 3(500/125 MHz, CD3OD)

化合物4：白色粉末，分子式為C20H22O6。1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 6.94 (2H, d,J= 2.0 Hz,H-2, 2'), 6.76 (2H, d,J= 8.0 Hz, H-5, 5'), 6.80 (2H, dd,J= 8.5, 2.0 Hz, H-6, 6'), 4.69 (2H, d,J= 4.5 Hz, H-7,7'), 3.13 (2H, m, H-8, 8'), 4.22 (2H, dd,J= 9.0, 7.0 Hz,H-9a, 9'a), 3.82 (2H, m, H-9b, 9'b), 3.84 (6H, s, 3, 3'-OMe)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 134.0 (C-1,1'), 111.1 (C-2, 2'), 149.3 (C-3, 3'), 147.5 (C-4, 4'),116.3 (C-5, 5'), 120.3 (C-6, 6'), 87.2 (C-7, 7'), 55.6 (C-8, 8'), 72.8 (C-9, 9'), 56.6 (3', 3-OMe)，以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物4 為松脂醇。

化合物5：白色粉末，分子式為C9H8O3。1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 6.28 (1H, d,J= 16.0 Hz,H-2), 7.60 (1H, d,J= 16.0 Hz, H-3), 7.45 (2H, d,J=8.5 Hz, H-2', 6'), 6.81 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5')；13CNMR (125 MHz, CD3OD)δ: 171.3 (C-1), 115.7 (C-2),146.8 (C-3), 127.3 (C-1'), 131.2 (C-2'), 116.9 (C-3'),161.2 (C-4'), 116.9 (C-5'), 131.2 (C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物5 為對羥基苯丙烯酸。

化合物6：黃色粉末，分子式為C13H12O4。1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 6.63 (1H, s, H-2, 6), 7.34(1H, d,J= 8.5 Hz, H-2', 6'), 6.79 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5')；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 134.0 (C-1),103.3 (C-2), 150.1 (C-3), 134.5 (C-4), 147.0 (C-5),108.4 (C-6), 134.5 (C-1'), 128.8 (C-2'), 116.6 (C-3'),157.7 (C-4'), 116.6 (C-5'), 128.8 (C-6'), 56.9 (3-OMe),以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[22]，故鑒定化合物6為3-甲氧基-4,4',5-三羥基聯(lián)苯。

化合物7：白色固體，分子式C13H22O3。-36(c0.05, MeOH)，ECD (2.02×10-3M, MeOH)λ(θ)210 (＋4.76), 250 (-9.72), 311 (＋1.06) nm；1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 4.28 (1H, dd,J= 14.0, 5.5 Hz,H-2), 2.03 (1H, dd,J= 12.5, 5.5 Hz, H-3a), 1.74 (1H,t,J= 13.5 Hz, H-3b), 2.30 (1H, m, H-7a), 2.40 (1H, m,H-7b), 1.56 (2H, m, H-8), 3.79 (1H, m, H-9 ), 1.21 (3H,d,J= 6.0 Hz, CH3-10), 1.28 (3H, s, CH3-11), 1.22 (3H,s, CH3-12), 1.80 (3H, s, CH3-13)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 201.6 (C-1), 70.6 (C-2), 47.2 (C-3), 39.0 (C-4), 167.1(C-5), 129.9 (C-6), 28.2 (C-7), 39.1 (C-8), 69.1(C-9), 23.4 (C-10), 25.9 (C-11), 30.2 (C-12), 12.1 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[23]，結合CD 圖譜，鑒定化合物7 為 (2S)-2,9-巨豆二羥基-6-烯-1-酮。

化合物8：白色固體，分子式C13H22O3。＋28° (c0.05，MeOH)。ECD (2.02×10-3M, MeOH)λ(θ) 210 (-4.85), 250 (＋9.00), 320 (-9.22) nm；1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 4.28 (1H, dd,J= 14.0, 5.5 Hz, H-2), 2.20 (1H, dd,J= 12.5, 5.5 Hz, H-3a), 1.75(1H, t,J= 13.0 Hz, H-3b), 2.51 (1H, m, H-7a), 2.19(1H, m, H-7b), 1.56 (2H, m, H-8), 3.79 (1H, m, H-9),1.20 (3H, d,J= 6.5 Hz, CH3-10), 1.28 (3H, s, CH3-11),1.21 (3H, s, CH3-12), 1.80 (3H, s, CH3-13)；13C-NMR(125 MHz, CD3OD)δ: 201.6 (C-1), 70.6 (C-2), 47.2 (C-3), 39.0 (C-4), 167.1 (C-5), 129.9 (C-6), 28.2 (C-7),39.1 (C-8), 69.0 (C-9), 23.5 (C-10), 26.0 (C-11), 30.1 (C-12), 12.1 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[23]，結合CD 圖譜，故鑒定化合物8 為 (2R)-2,9-巨豆二羥基-6-烯-1-酮。

化合物 9：黃色無定型粉末，分子式為C13H20O2。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 5.89 (1H,s, H-1), 2.35 (2H, s, H-3), 6.23 (1H, t,J= 7.0 Hz, H-7),2.61 (2H, t,J= 6.5 Hz, H-8), 3.89 (1H, m, H-9), 1.23(3H, d,J= 6.0 Hz, CH3-10), 1.31 (3H, s, CH3-11), 1.30(3H, s, CH3-12), 2.12 (3H, d,J= 1.0 Hz, CH3-13)；13CNMR (125 MHz, CD3OD)δ: 134.8 (C-1), 202.3 (C-2),54.8 (C-3), 39.5 (C-4), 158.9 (C-5), 143.9 (C-6), 125.9(C-7), 40.6 (C-8), 68.8 (C-9), 23.6 (C-10), 29.5 (C-11),29.5 (C-12), 22.8 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[24]，故鑒定化合物9 為 (5Z)-9-羥基-1,5-巨豆二烯-2-酮。

化合物10：黃色固體，分子式為C13H20O2。1HNMR (600 MHz, CD3OD)δ: 5.88 (1H, brs, H-1), 2.42(1H, d,J= 16.8 Hz, H-3a), 2.05 (2H, d,J= 16.8 Hz, H-3b), 2.66 (1H, d,J= 9.6 Hz, H-5), 5.58 (1H, ddd,J=15.6, 9.0, 1.2 Hz, H-7), 5.68 (1H, dd,J= 15.0, 6.0 Hz,H-8), 4.28 (1H, m, H-9), 1.24 (3H, d,J= 6.6 Hz, CH3-10), 0.98 (3H, s, CH3-11), 1.03 (3H, s, CH3-12), 1.96(3H, d,J= 1.8 Hz, CH3-13)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 126.3 (C-1), 202.3 (C-2), 48.5 (C-3), 37.3(C-4), 56.9 (C-5), 166.3 (C-6), 127.6 (C-7), 140.4 (C-8), 69.0 (C-9), 24.0 (C-10), 28.2 (C-11), 27.6 (C-12),24.0 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[25]，故鑒定化合物10 為2-氧代-α-紫羅蘭醇。

化合物11：淡黃色粉末，分子式為C11H16O3。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 2.41 (1H, td,J= 2.5,13.5 Hz, H-1a), 1.72 (1H, dd,J= 4.0, 13.5 Hz, H-1b),4.21 (1H, m, H-2), 1.98 (1H, td,J= 2.5, 14.5 Hz, H-3a), 1.52 (1H, dd,J= 4.0, 14.5 Hz, H-3b), 5.74 (1H, s,H-7), 1.46 (3H, s, CH3-9), 1.27 (3H, s, CH3-10), 1.75(3H, s, CH3-11)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 46.6(C-1), 67.4 (C-2), 48.2 (C-3), 37.4 (C-4), 185.9 (C-5),89.2 (C-6), 113.5 (C-7), 174.6 (C-8), 27.1 (C-9), 31.2 (C-10), 27.6 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[26]，故鑒定化合物11 為黑麥草內(nèi)酯。

化合物 12：黃色無定型粉末，分子式為C10H14O2。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 2.39 (2H,s, H-5), 6.21 (1H, s, H-6), 4.44 (2H, d,J= 1.2 Hz, H-7), 5.43 (1H, d ,J= 1.2 Hz, H-8a), 5.46 (1H, s, H-8b),1.21 (6H, s, CH3-9, 10)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 202.1 (C-1), 159.0 (C-2), 150.4 (C-3), 40.1 (C-4),53.2 (C-5), 124.0 (C-6), 62.1 (C-7), 114.1 (C-8), 28.7(C-9, 10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[27]，故鑒定化合物12 為gardeterpenone A。

3.2 抗增殖活性測試結果

采用CCK-8 方法，以冬凌草甲素和紫杉醇為陽性藥，測試所有分離的化合物對A549 細胞體外抗增殖的活性，結果表明，在50 μmol/L 下，所有化合物對A549 細胞沒有表現(xiàn)出明顯的抗增殖活性，其抑制率小于50%，而陽性藥冬凌草甲素（50 μmol/L）和紫杉醇（10 μmol/L）的抑制率分別為97.83%和74.77%。

4 討論

本研究從大苞藤黃葉醋酸乙酯提取物中分離得到了12 個化合物，其結構類型涉及到酚類（1～6）和萜類化合物（7～12）。酚類化合物包括2 個新的四氫酮和1 個縮酚酸環(huán)醚類化合物，為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)的新結構類型，萜類化合物包括降倍半萜類和單萜，均是首次從該植物中分離得到，這些發(fā)現(xiàn)豐富了大苞藤黃化學成分的結構類型。盡管本研究在進行抗增殖活性的篩選中，并沒有發(fā)現(xiàn)所分離的化合物具有明顯的抗增殖活性，結合前期文獻報道[5]，大苞藤黃葉發(fā)揮抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎可能是酮（包括異戊烯基和籠狀酮），但這些化合物在抗炎和降血糖方面的生物活性值得進一步挖掘。研究成果為深入研究大苞藤黃葉的藥效物質(zhì)基礎奠定了基礎，也為這一藥用植物資源的合理開發(fā)及可持續(xù)利用提供了科學依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突