楊彥濤 ，李卓倫 ，周 霖 ，康 建 ，程 旭，孫 志 *

1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450052

2. 河南省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床質(zhì)譜工程研究中心，河南 鄭州 450052

3. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203

腎康注射液（Shenkang Injection，SKI）是由丹參、大黃、紅花、黃芪4 味中藥提取加工制成的中藥復(fù)方，具有降逆泄?jié)?、益氣活血和通腹利濕等功效，臨床應(yīng)用已20 余年，療效顯著且應(yīng)用廣泛。研究表明，腎康注射液在治療糖尿病腎病方面，可顯著改善多項(xiàng)腎功能指標(biāo)，如降低尿白蛋白排泄率、24 h 尿蛋白、血肌酐和尿素氮等，從而減輕糖尿病對(duì)腎臟的損傷作用，提高腎功能[1]。慢性腎功能衰竭是由各種病因引起腎臟損害和進(jìn)行性加重的結(jié)果，腎康注射液可使該病患者內(nèi)生肌酐清除率升高，降低血肌酐，有效率達(dá)73.05%[2]。在造影劑腎病防治方面，腎康注射液亦表現(xiàn)出良好的改善腎功能指標(biāo)的作用，大大減少了造影劑腎病的發(fā)生[3]。研究表明SKI 治療糖尿病腎病的機(jī)制可能與減輕高糖誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞衰老和腎小管間質(zhì)損傷、抑制腎系膜細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[4-6]。然而，目前關(guān)于SKI 體內(nèi)代謝物的研究尚不系統(tǒng)全面[7]，這限制了SKI 的藥理學(xué)、毒理學(xué)和作用機(jī)制的進(jìn)一步研究。因此亟需一種具有高通量、高分辨率和高靈敏度且能準(zhǔn)確鑒定其在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物的方法，以對(duì)SKI 進(jìn)行進(jìn)一步的分析探索。

超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）具有高通量、高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，可用于快速準(zhǔn)確鑒定中藥藥效成分在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物；其可在一個(gè)分析周期內(nèi)獲得大量高精度的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，為人體內(nèi)微量乃至痕量的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的確定提供了客觀可靠的數(shù)據(jù)支持。Compound Discoverer（CD）代謝平臺(tái)是一種基于LC-MS 獲得代謝物檢測(cè)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，其可通過對(duì)樣本組和對(duì)照組進(jìn)行差異性分析，結(jié)合對(duì)待測(cè)物質(zhì)色譜質(zhì)譜峰的數(shù)據(jù)分析，篩選出樣品組中存在而對(duì)照組中不存在的化合物，并提示可能的生物轉(zhuǎn)化途徑[8-10]。

在本課題組前期研究中，SKI 中共鑒定出90 種化學(xué)成分，主要化學(xué)結(jié)構(gòu)類型為酚酸類、黃酮類和蒽醌類等[11]。隨后，又研究了SKI 在大鼠體內(nèi)的組織分布和藥動(dòng)力學(xué)[12]。為了鑒定SKI 在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 和CD平臺(tái)，提出了“提取-化合物篩選-鑒定-驗(yàn)證”的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定策略，最終從iv SKI 后的大鼠血漿、尿液和糞便中篩選出并鑒定了92 種代謝產(chǎn)物，明確了SKI 在大鼠體內(nèi)的代謝譜，為針對(duì)SKI進(jìn)一步的藥物研究奠定了堅(jiān)實(shí)的理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Ultimate 3000 UHPLC（美國Dionex 公司）；Q Exactive HRMS（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Xcalibur 3.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Finnigan 公司）。

腎康注射液（批號(hào)202109111）由西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。對(duì)照品沒食子酸（批號(hào)MUST-18032801）、丹參素（批號(hào)MUST-18060920）、咖啡酸（批號(hào)MUST-19032003）、原兒茶酸（批號(hào)MUST-16032102 ）、 5- 羥甲基糠醛（ 批號(hào)MUST-16031202）、羥基紅花黃色素 A（批號(hào)MUST-16070508）、阿魏酸（批號(hào)MUST-19032928）和芹菜素（批號(hào)MUST-16061301）均購自成都Must生物技術(shù)有限公司；對(duì)照品大黃酸（批號(hào)wkq16062204）購自成都維可奇生物技術(shù)有限公司。所有對(duì)照品經(jīng)HPLC-UV 檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。甲醇和乙腈為高效液相色譜級(jí)，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。HPLC 級(jí)甲酸購自阿拉丁工業(yè)有限公司。

雄性SD 大鼠（180～220 g）12 只購自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)SCXK（豫）2021-0002。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)2023-KY-0543）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），體積流量0.2 mL/min；梯度洗脫： 0～3 min，5% B；3～16 min，5%～15% B；16～20 min，15%～22% B；20～26 min，22%～55%B；26～30 min，55%～100% B；30～35 min，100%B；35～36 min，100%～5% B；36～40 min，5% B。進(jìn)樣量5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀采用加熱電噴霧離子源（HESI）。離子傳輸管溫度320 ℃，輔助氣體積流量為10 μL/min。正離子模式下：噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣體積流量為40 μL/min。負(fù)離子模式下：噴霧電壓為-2.8 kV，鞘氣體積流量為38 μL/min。全掃描質(zhì)量范圍m/z80～1 200。碰撞能梯度為20、40、60 eV。

2.3 動(dòng)物飼養(yǎng)和給藥

將SD 大鼠隨機(jī)分為給藥組和對(duì)照組，每組6只。隨后將各組再進(jìn)一步隨機(jī)均分為采血組（3 只）和收集尿液及糞便組（3 只），這些大鼠均飼養(yǎng)在光照/黑暗周期為12 h 的動(dòng)物房內(nèi)，溫度25 ℃，相對(duì)濕度在60%左右，飼養(yǎng)1 周。在這1 周內(nèi)，大鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。給藥前，在代謝籠中的大鼠被禁食12 h，只自由飲水[13]。給藥組大鼠注射劑量為9 mL/kg（相當(dāng)于臨床劑量的6.3 倍），使用前SKI 先濃縮，濃度提高5 倍，經(jīng)尾iv 給予大鼠。對(duì)照組大鼠同樣方法注射生理鹽水[14]。

2.4 生物樣本采集和預(yù)處理

2.4.1 血漿樣本 采血組大鼠，ip 10%水合氯醛水溶液（0.2 mL/100 g）進(jìn)行麻醉。分別于尾iv SKI或生理鹽水后0.5、1、2、4、8、12、24 h 從大鼠眼眶靜脈中采集血液各0.3 mL，置于肝素鈉抗凝EP管中，在4 ℃下以1.3×104r/min 離心10 min，取上清液。最后將各時(shí)間點(diǎn)血漿上清液混合在一起，取2 mL 與8 mL 甲醇混合，渦旋、離心、干燥。用200 μL 50%甲醇-水再溶解殘余物，制備成供試液。

2.4.2 尿液和糞便樣本 收集尿液和糞便組大鼠在代謝籠內(nèi)尾iv SKI或生理鹽水后24 h的尿液和糞便樣本。尿液樣本濾過后，在4 ℃下以1.3×104r/min 離心10 min。取2 mL 上清液與8 mL 甲醇混合，渦旋、離心。室溫下氮?dú)飧稍锷锨逡?。?00 μL 50%甲醇-水將殘余物再溶解。另外，取1 g 干燥后的糞便樣品，加入10 mL 甲醇，超聲處理30 min后濾過。然后渦旋、離心。上清液干燥。用200 μL 50%甲醇-水復(fù)溶，制備成供試液。所有供試液在進(jìn)樣前均用0.22 μm 微孔濾膜濾過[15]。

2.5 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品沒食子酸、丹參素、咖啡酸、原兒茶酸、5-羥甲基糠醛、羥基紅花黃色素A、阿魏酸、芹菜素、大黃酸各1.0 mg，精密稱定后，分別置于10 mL 量瓶中，加入50%甲醇-水溶解并稀釋至刻度，搖勻，最終制備成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，將其混合后加入50%甲醇-水稀釋，最終制備成各對(duì)照品質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用Xcalibur 3.0 軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括總離子流圖、提取離子流圖、MS2質(zhì)譜圖、碎片離子和元素組成，質(zhì)量誤差均在5×10-6以內(nèi)。大鼠靜脈注射SKI 后，各生物樣本的總離子流圖見圖1。將Q Exactive HRMS 獲取的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Compound Discoverer 2.1（CD）軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行代謝物的篩選鑒定。選擇“Metabolism w Statistics Expected w Fish Scoring and Unknown w Pattern and Compound Class Scoring”處理流程，根據(jù)導(dǎo)入的原型化合物結(jié)構(gòu)和所選的代謝反應(yīng)類型，系統(tǒng)自動(dòng)篩選出潛在的代謝物。主要參數(shù)：最大位移0.2 min，質(zhì)量誤差5×10-6，最小質(zhì)量150，最小峰強(qiáng)度1×105。峰面積的比值（給藥組/對(duì)照組）設(shè)置為大于5。

圖1 大鼠iv SKI 后各生物樣本的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms (TICs) of bio-samples after intravenous administration of SKI in rats

2.7 大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定策略

為了系統(tǒng)分析SKI 在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定，提出了“提取-化合物篩選-鑒定-驗(yàn)證”的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定策略，如圖2 所示。第一步，根據(jù)文獻(xiàn)檢索信息和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立化合物數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫不僅包含SKI 中的已知化學(xué)成分，還包含文獻(xiàn)報(bào)道的部分化合物的已知代謝物，包括化合物名稱、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)和特征碎片離子等信息[16]。

圖2 大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的鑒定策略Fig.2 Identification strategy of metabolites in rats

第二步，原型化合物的體內(nèi)鑒定。依據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫，利用Xcalibur 軟件從生物樣本的色譜圖中提取原型化合物，然后根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、分子式和特征碎片離子進(jìn)行確認(rèn)。

第三步，已知代謝物的鑒定。這些代謝物是文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的，來源于SKI 中某一味草藥或某一種活性成分的體內(nèi)代謝研究。同樣，用Xcalibur 軟件從生物樣本的色譜圖中提取已知代謝物，然后根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、分子式和特征碎片離子進(jìn)行確認(rèn)。

第四步，未知代謝物的鑒定。通過Compound Discoverer 2.1 和Mass Frontier 7.0 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）對(duì)未知代謝物進(jìn)行篩選和鑒定。將給藥組、對(duì)照組和空白溶劑組的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入CD 軟件。空白溶劑組用于去除背景和噪聲。另外，導(dǎo)入SKI 中35 個(gè)代表性活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，選擇15 種I相代謝反應(yīng)和19 種Ⅱ相代謝反應(yīng)。設(shè)定好參數(shù)運(yùn)行，系統(tǒng)篩選出較多潛在代謝物。然后，根據(jù)原型化合物結(jié)構(gòu)、代謝反應(yīng)、中性損失和特征碎片離子，推測(cè)潛在代謝物的結(jié)構(gòu)。將該化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Mass Frontier 7.0 軟件，可以自動(dòng)生成理論的碎片離子和二級(jí)質(zhì)譜圖。隨后將該二級(jí)質(zhì)譜圖與CD 篩選出的潛在代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行匹配。根據(jù)匹配結(jié)果驗(yàn)證推測(cè)的代謝物結(jié)構(gòu)是否正確。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體內(nèi)SKI 原型化合物的鑒定

大鼠iv SKI 后，在其血漿、尿液和糞便中共檢測(cè)到29 種原型成分。通過與標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的比較，確定了原型的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其中包括17 種酚酸類、5 種蒽醌類、3 種黃酮類、壬二酸、5-羥甲基糠醛、蓮花掌苷和羥基紅花黃色素A。原型化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表1 所示。

表1 大鼠iv SKI 后血漿、尿液和糞便中的原型化合物Table 1 Prototype compounds in rat plasma, urine and feces after intravenous administration of SKI

3.1.1 酚酸類 P3 的母離子m/z169.01 和特征碎片離子m/z125.02、m/z97.03 與沒食子酸一致，P3 為沒食子酸。P2 具有與P3 相同的母離子和碎片離子，是沒食子酸的異構(gòu)體。P1、P4、P5、P8 具有相同的母離子m/z331.07，比沒食子酸高162（C6H10O5），且具有相同的特征碎片離子m/z169.01 和m/z125.02。另外，僅P1 和P4 具有碎片離子m/z271.04和m/z211.02。因此，P5 和P8 鑒定為沒食子酸-4-O-葡萄糖苷和沒食子酸-3-O-葡萄糖苷[11]，P1 和P4 為沒食子?；?葡萄糖或其異構(gòu)體[17]。P13 的母離子比沒食子酸的母離子高14（CH2），碎片離子m/z168.01和124.02 是母離子連續(xù)丟失CH3和CO2。因此，P13被認(rèn)為是沒食子酸甲酯[11]。P10 和P16 顯示出與原兒茶酸（P9）相同的母離子和碎片離子，被鑒定為原兒茶酸的異構(gòu)體。P11 母離子m/z167.03 和碎片離子m/z152.01、123.04、108.02 與香草酸均一致，P11 為香草酸[11,18]。P7 的分子離子比丹參素（P6）小18（H2O），碎片離子m/z135.04 和107.05 是從母離子連續(xù)丟失CO2和CO 產(chǎn)生，經(jīng)鑒定P7 為咖啡酸。而P18 的母離子比P7 高14（CH2），鑒定為阿魏酸。P15 顯示出與阿魏酸相同的母離子和碎片離子，鑒定為異阿魏酸[11,19]。P21 的碎片離子m/z373.09、237.04、197.04、175.04、135.04 與文獻(xiàn)報(bào)道的丹酚酸D 相同，P21 為丹酚酸D[18]。

3.1.2 蒽醌類 P25 的母離子比蘆薈大黃素高162（C6H10O5），碎片離子一致，鑒定為蘆薈大黃素-O-葡萄糖苷[11]。同理，P20 經(jīng)鑒定為大黃酸-8-O-葡萄糖苷。P27 的母離子比大黃素高16（O），考慮為ω-羥基大黃素[20]。P28 的母離子比大黃酸（P29）高14（CH2），鑒定為6-甲基大黃酸[17]。

3.1.3 黃酮類 由于黃酮類化合物的特殊碎裂模式，黃酮類特征碎裂離子的命名參考了Zhang 等[21]的研究。P26 的母離子和主要碎片離子均與芹菜素相同，鑒定為芹菜素。P23 的開環(huán)碎片離子m/z135.01、133.03 和117.03 分別對(duì)應(yīng) [M-H-C8H6O,1,3A]-、[M-H-C7H4O2, 0,3B]-和[M-H-C7H4O3,1,3B]-，通過與文獻(xiàn)比較，P23 被鑒定為大豆苷元[21-22]。P24 顯示 [M＋H]+為m/z285.08，碎片離子m/z270.05、242.06 和214.06 是從母離子依次中性損失CH3、CO 和CO 所得。開環(huán)碎片離子m/z137.02、134.04 和121.03 分別對(duì)應(yīng) [M＋H-C9H8O2,1,3A]+、[M＋H-CH3-C7H4O3, 1,3B]+和 [M＋HC9H8O3, 0,3A]+。根據(jù)以上質(zhì)譜信息和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，P24被明確地定性為毛蕊異黃酮[11,21]。

3.1.4 其他 經(jīng)與對(duì)照品的母離子和碎片離子比較，P12 和P14 分別被明確鑒定為5-羥甲基糠醛和羥基紅花黃色素A。P19 的二級(jí)碎片離子m/z169.01和125.02 與沒食子酸的特征碎片離子一致，經(jīng)鑒定P19 為蓮花掌苷。P22 的碎片離子m/z169.09、125.10和97.06 從母離子先后丟失H2O、CO2和C2H4，可鑒定為壬二酸[11]。

3.2 大鼠體內(nèi)SKI 代謝產(chǎn)物的鑒定

基于本課題組提出的大鼠體內(nèi)SKI 代謝產(chǎn)物的鑒定策略，共篩選并鑒定了92 種代謝產(chǎn)物。對(duì)其中39 種已知代謝產(chǎn)物進(jìn)行了提取和確認(rèn)。又利用CD代謝平臺(tái)，導(dǎo)入SKI 中35 種代表性活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)為母化合物，設(shè)置15 種I 相代謝反應(yīng)和19種II 相代謝反應(yīng)，篩選并鑒定了53 種未知代謝產(chǎn)物。所有代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表2 所示。

表2 大鼠iv SKI 后血漿、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物Table 2 Metabolites in rat plasma, urine and feces after intravenous administration of SKI

3.2.1 酚酸類代謝物 大鼠靜脈注射SKI 后，檢測(cè)到15 種沒食子酸（P3）代謝物。其代謝途徑如圖3所示。M8 的母離子比沒食子酸大80（SO3），兩者的特征碎片離子m/z169.01 和125.02 相同。因此，M8 是沒食子酸的硫酸化產(chǎn)物，鑒定為沒食子酸-O-硫酸酯。M17 的母離子比M8 高14（CH2），M17的碎片離子m/z183.03 和139.00 也比M8 的碎片離子m/z169.01 和125.02 高14，因此，M17 是沒食子酸經(jīng)過甲基化和硫酸化后的代謝產(chǎn)物。同樣，M14、M18、M23 也是M17 的甲基化產(chǎn)物，它們被鑒定為二甲基-沒食子酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。M42 的碎片離子m/z125.02 是由母離子連續(xù)丟失C2H3ON 和CO2產(chǎn)生，它也是沒食子酸的特征碎片離子；另一個(gè)碎片離子m/z151.00 是由母離子損失C2H5O2N（甘氨酸）產(chǎn)生的，這表明化合物與甘氨酸進(jìn)行了結(jié)合。M42 被初步鑒定為沒食子酸-甘氨酸結(jié)合物。M27 的母離子m/z125.02 比沒食子酸少44（CO2），碎片離子m/z125.02、97.03 和69.03 均與沒食子酸的特征碎片離子一致。M27 是沒食子酸脫羧基代謝產(chǎn)物，鑒定為鄰苯三酚[17]。M1 和M19是具有相同分子式和碎片離子的同分異構(gòu)體，母離子比M27 高80（SO3），結(jié)合特征碎片離子m/z125.02、97.03 和69.03，認(rèn)為M1 和M19 是鄰苯三酚的硫酸化產(chǎn)物。M4 和M10 的母離子比M1 高14（CH2），特征碎片離子分別為m/z203.97 [M-HCH3]-、139.04 [M-H-SO3]-和124.02 [M-HSO3-CH3]-。結(jié)果表明，M4 和M10 是由鄰苯三酚通過甲基化和硫酸化生成的。同一分析方法，M12和M16 被確認(rèn)為鄰苯三酚經(jīng)過硫酸化和二甲基化的代謝物。M7 的母離子比鄰苯三酚高 176（C6H8O6），為鄰苯三酚的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M11的母離子m/z329.09 比鄰苯三酚大204，對(duì)應(yīng)的是加入了C6H8O6和2CH2。初步鑒定M11 為二甲基-鄰苯三酚-O-葡萄糖醛酸。

圖3 沒食子酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathway of gallic acid in rats

大鼠iv SKI 后，檢測(cè)到原兒茶酸（P9）的12種代謝產(chǎn)物。代謝途徑如圖4 所示。M2 的母離子比原兒茶酸高80（SO3），碎片離子相同，可表征為原兒茶酸-O-硫酸酯。M35、M48、M71 的母離子比原兒茶酸少16（O），碎片離子m/z93.03 和65.04是母離子連續(xù)損失CO2和CO 產(chǎn)生。M35、M48、M71 被鑒定為脫羥基-原兒茶酸或其異構(gòu)體。M13和M26 為M35 的硫酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為脫羥基-原兒茶酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體[23]。同樣，M31 經(jīng)鑒定為脫羥基-原兒茶酸-O-葡萄糖醛酸。M41 和M52 的母離子m/z151.04 和碎片離子m/z123.04、107.05 均比M35 高14（CH2），鑒定為脫羥基-甲基-原兒茶酸。M20 的碎片離子m/z121.03 [M＋HC2H5NO2]+和93.03 [M＋H-C2H5NO2-CO]+顯示其為甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物，且M20 和M35 相同的碎片離子m/z93.03 為羥基苯離子，因此，M20 被初步鑒定為脫羥基-原兒茶酸-甘氨酸結(jié)合物，結(jié)合部位發(fā)生在甘氨酸的氨基。此外，M30 和M50 可能是M20 經(jīng)過甲基化反應(yīng)的產(chǎn)物，亦可能是M41 與甘氨酸結(jié)合的產(chǎn)物。

圖4 原兒茶酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of protocatechuic acid in rats

M33 的母離子和碎片離子均比香草酸大14（CH2），M33 是香草酸的甲基化產(chǎn)物。M25、M29、M34 的準(zhǔn)分子離子 [M-H]-（m/z261.01）比M33高80（SO3），碎片離子相同，它們是由M33 硫酸化產(chǎn)生的，經(jīng)鑒定為甲基-香草酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。同樣，M3 和M24 被鑒定為香草酸-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。

大鼠iv SKI 后，檢測(cè)到丹參素（P6）的19 種代謝物，代謝途徑如圖5 所示。M39 的碎片離子m/z193.05、178.03 和134.04 是從母離子連續(xù)丟失H2O、CH3和CO2產(chǎn)生，均比丹參素高14（CH2），M39 被認(rèn)為是丹參素的甲基化產(chǎn)物[19]。由于碎片離子相同且分子式多SO3，M22 是M39 的硫酸化產(chǎn)物，被鑒定為甲基-丹參素-O-硫酸酯。M5、M9 也是丹參素的硫酸化產(chǎn)物[24]。M45 顯示其特征碎片離子為m/z181.04 [M-H-CH2OCO]-和179.04 [MH-CH3COOH]-，且其母離子比丹參素高 42（C2H2O），因此，M45 是丹參素的乙?；a(chǎn)物[18]。M28 的特征碎片離子為m/z135.04 [M-HHCOOH]-和109.03 [M-H-HCOOH-C2H2]-，其母離子比丹參素少16（O），這表明M28 是脫羥基化產(chǎn)物，且脫羥基位置發(fā)生在羧基的α-C。M15 的母離子比M28 高176（C6H8O6），為葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為脫羥基-丹參素-O-葡萄糖醛酸。由于O 的減少和CH2的加入，M36 的母離子比丹參素小 2，其特征碎片離子m/z151.08 [M＋HHCOOH]+、137.06 [M＋H-CH3COOH]+和123.04[M＋H-CH3COOH-CH2]+表明對(duì)應(yīng)的基團(tuán)變化是去羥基化和甲基化，M36 可鑒定為脫羥基-甲基-丹參素。同時(shí)，M40、M44 又是M36 的硫酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為脫羥基-甲基-丹參素-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。M79 的特征碎片離子為m/z120.06 [M-HCO2-CH3COO]-，其母離子比M28 高42（C2H2O），因此，M79 為乙酰化產(chǎn)物，初步鑒定為脫羥基-乙?；?丹參素。M85 為M79 的甲基化產(chǎn)物，初步鑒定為脫羥基-甲基-乙?；?丹參素。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[24]，M57、M60 作為已知代謝物被提取驗(yàn)證，結(jié)果表明，M57、M60 是丹參素的脫二羥基產(chǎn)物。另外，M38、M46 是M57、M60 的硫酸化產(chǎn)物，鑒定為脫二羥基-丹參素-O-硫酸酯或其異構(gòu)體。由于減少2O 和增加2CH2，M86 的母離子比丹參素少4，M86 可能是丹參素的脫二羥基和二甲基化產(chǎn)物。M56、M66 的母離子比M86 高14（CH2），初步鑒定為脫二羥基-三甲基-丹參素或其異構(gòu)體。

圖5 丹參素在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathway of danshensu in rats

M6 和M32 的碎片離子與咖啡酸相同，但母離子比咖啡酸高80（SO3），M6 和M32 是咖啡酸的硫酸化代謝產(chǎn)物。M51 的碎片離子m/z193.05、178.03 和134.04 由母離子連續(xù)丟失C6H8O6、CH3和CO2產(chǎn)生。結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，M51 是咖啡酸的甲基化和葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，且甲基化位置發(fā)生在羧基[19]。基于文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[23]，M67 和M43 在總離子流圖中提取得到。MS2碎片離子結(jié)果表明，M67是由咖啡酸經(jīng)去羥基產(chǎn)生的，M43 是M67 的硫酸化產(chǎn)物。

M49 和M37 具有共同的碎片離子m/z193.05、178.03、149.06 和134.04，且與阿魏酸相同。此外，M49 和M37 的母離子分別比阿魏酸大80（SO3）和176（C6H8O6）。因此，M49 是阿魏酸的硫酸化產(chǎn)物，M37 是阿魏酸的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[25]。M69的母離子m/z209.04 和碎片離子m/z165.06 均比阿魏酸大16（O），結(jié)合其他碎片離子，M69 可能是阿魏酸的羥基化產(chǎn)物。M54 的母離子比阿魏酸大57（C2H3NO），結(jié)合碎片離子m/z177.06 [M-HC2H3NO2]-和 134.04 [M-H-CO2-CH3-C2H3NO]-，M54 是阿魏酸的甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物。M80的特征碎片離子m/z193.05 [M-H-C11H8O5-H2O]-與阿魏酸的母離子相同，且其母離子比丹酚酸D 高14（CH2），認(rèn)為M80 為丹酚酸D 的甲基化產(chǎn)物[18]。

3.2.2 蒽醌類代謝物 M73、M87 和M75 具有相同的碎片離子m/z269.04、241.05、225.06，與大黃素一致。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，M73 和M87 為大黃素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，M75 為大黃素-O-葡萄糖苷的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[26-27]。由于加入SO3和2H，M90的母離子比大黃素大82，且其碎片離子m/z271.06和243.06 比大黃素的碎片離子m/z269.04 和241.05也大2。因此，M90 是大黃素的還原氫化和硫酸化產(chǎn)物，經(jīng)鑒定為9(10)-羥基-大黃素-O-硫酸酯。M91的母離子和主要碎片離子均比M90 小16（O），故初步鑒定M91 為脫羥基-9(10)-羥基-大黃素-O-硫酸酯。M68 的母離子比蘆薈大黃素高176（C6H8O6），兩者均有特征碎片離子m/z269.04 和240.04。M68是蘆薈大黃素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M74 的母離子經(jīng)連續(xù)丟失C6H10O5（162）和C6H8O6（176）產(chǎn)生碎片離子m/z429.08 和253.05，且與大黃酚具有相同的碎片離子m/z253.05 和225.06，M74 被認(rèn)為是大黃酚-O-葡萄糖苷-O-葡萄糖醛酸。M62 的母離子比大黃素甲醚高176（C6H8O6），碎片離子相同，M62 是大黃素甲醚的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M70 也是大黃酸的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，而M83 是大黃酸的硫酸化產(chǎn)物。

3.2.3 黃酮類代謝物 M84 的母離子比芹菜素（P26）大80（SO3），碎片離子相同，M84 被鑒定為芹菜素-O-硫酸酯。由于增加了2C6H8O6，M53的母離子比芹菜素高352，M53 是芹菜素的二葡萄糖醛酸反應(yīng)產(chǎn)物。M76 和M59 的母離子分別比大豆苷元（P23）高80（SO3）和176（C6H8O6），兩者和大豆苷元具有相同的碎片離子m/z253.05、225.06、209.06、197.06、135.01 和133.03，因此，M76 為硫酸化產(chǎn)物，M59 為葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[28-29]。M63 也是毛蕊異黃酮通過葡萄糖醛酸化反應(yīng)產(chǎn)生的代謝物。由于增加SO3和2H，M92 的母離子比柚皮素高82，此外，其開環(huán)的特征碎片離子m/z199.01 [M-H-C7H6O4, 1,3B]-和137.02 [M-HSO3-C8H8O2，0,3A]-表明M92 是柚皮素的還原氫化和硫酸化產(chǎn)物，且硫酸化的位置發(fā)生在B 環(huán)。因此，M92 被表征為4-羥基-柚皮素-O-硫酸酯。M89的母離子m/z367.05 和碎片離子m/z287.09 與151.04 均比M92 高14（CH2），另外，通過比較M89 的特征碎片離子m/z272.07 [M-H-SO3-CH3]-與 136.02 [M-H-SO3-C8H8O2-CH3，0,3A]-和M92 的特征碎片離子m/z273.08 [M-HSO3]-與137.02 [M-H-SO3-C8H8O2，0,3A]-，M89可確認(rèn)為M92 的甲基化產(chǎn)物，鑒定為甲基-4-羥基-柚皮素-O-硫酸酯。

3.2.4 壬二酸類代謝物 大鼠iv SKI 后，檢測(cè)到壬二酸（P22）的11 種代謝物，代謝途徑如圖6 所示。由于CH2和O 的加入，M64 的母離子比壬二酸高30，其碎片離子m/z199.10 [M-H-H2O]-、157.09 [MH-CH3COOH]-和143.07 [M-H-CH3COOHCH2]-表明M64 很可能是壬二酸的甲基化和羥基化產(chǎn)物。初步鑒定M64 為羥基-甲基-壬二酸。M58 的主要碎片離子m/z215.09、197.08、155.07、153.09、135.08、111.08 比M64 均少2（2H），M58 是脫飽和產(chǎn)物。M65、M81 的母離子由于CH2的加入和2H 的損失比壬二酸的母離子高12，推測(cè)M65、M81是壬二酸經(jīng)過甲基化和脫飽和的產(chǎn)物。M72 的主要碎片離子m/z199.10、181.08、153.09、135.08、107.08和93.07 比M65 少2（2H），M72 是脫飽和產(chǎn)物。M88 的母離子由于CH2的加入和O 的減少比壬二酸小2，結(jié)合生物轉(zhuǎn)化和碎片離子，推測(cè)M88 是壬二酸的甲基化和還原（-O）產(chǎn)物，其中1 個(gè)羧基（-COOH）還原為醛基（-CHO）。M47 的碎片離子m/z124.01 [M-H-C9H12O3，C2H6NO3S]-和106.98 [MH-C9H12O3-NH3，C2H3O3S]-表明它是?；撬岬慕Y(jié)合產(chǎn)物，另外，中性丟失C9H12O3表明其為脫飽和產(chǎn)物。因此，M47 被鑒定為壬烯二酸-牛磺酸結(jié)合物。M61 的碎片離子及歸屬為m/z261.12 [M＋HNH3]+、201.11 [M＋H-C2H7NS]+、183.10 [M＋HC2H7NS-H2O]+、155.11 [M＋H-C2H7NSHCOOH]+、137.10 [M＋H-C2H7NS-H2OHCOOH]+和 123.08 [M＋H-C2H7NS-H2OCH3COOH]+，半胱氨酸的分子式是C3H7NO2S（C2H6NS-COOH），由此可推測(cè)它是半胱氨酸結(jié)合產(chǎn)物；另外，根據(jù)擬合的分子式也表明它經(jīng)歷了還原反應(yīng)（-O，＋2H），其中1 個(gè)羧基（-COOH）還原為醇羥基（-CH2OH），最后鑒定M61 為9-羥基-壬酸-半胱氨酸結(jié)合物。M55 的大部分碎片離子比M61 小2（2H），M55 是M61 的脫飽和產(chǎn)物，鑒定為9-羥基-壬烯酸-半胱氨酸結(jié)合物。M78、M82的碎片離子及歸屬分別為m/z167.11 [M-HCH3COOH-H2O]-、153.09 [M-H-CH3COOHH2O-CH2]-、141.13 [M-H-CH3COOH-CO2]-和125.10 [M-H-CH3COOH-CH3COOH]-，結(jié)合CD軟件分析的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，M78、M82 經(jīng)歷了羥化、甲基化、還原（-O，＋2H）和乙?；磻?yīng)，初步鑒定為9-羥基-甲基-羥基-乙?；?壬酸/異構(gòu)體。

圖6 壬二酸在大鼠體內(nèi)的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of azelaic acid in rats

3.2.5 其他代謝物 M21的母離子比5-羥甲基糠醛（P12）大73，質(zhì)量的變化是由于增加了NH2CH2COOH（甘氨酸，75）并脫去2H，結(jié)合其碎片離子m/z168.03[M-H-HCHO]-、154.05 [M-H-CO2]-和136.04[M-H-CO2-H2O]-，表明M21 是甘氨酸結(jié)合產(chǎn)物[30]，結(jié)合部位發(fā)生在甘氨酸的氨基和5-羥甲基糠醛的醛基，生成了酰胺。M77 的母離子比二氫丹參酮I高16（O），且其碎片離子m/z277.09、267.10、249.09、239.11 和221.10 與文獻(xiàn)報(bào)道的羥基-二氫丹參酮I 相同[31]，可鑒定為羥基-二氫丹參酮I。

4 討論

在iv SKI 后的大鼠尿液、血漿和糞便中鑒定出29 種原型成分，分別為酚酸類、蒽醌類、黃酮類和壬二酸類等。然而，僅發(fā)現(xiàn)了其中16 種原型成分的代謝產(chǎn)物。另外，有趣的是，一些原型成分的代謝物（M62、M68、M73～M75、M77、M87、M89～M92）很容易被檢測(cè)到，但它們的原型化合物（大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、柚皮素和二氫丹參酮I 等）在大鼠的尿液、血漿和糞便中沒有被檢測(cè)到。這些現(xiàn)象表明體內(nèi)藥物代謝研究的難點(diǎn)仍在于復(fù)雜成分的生物樣本中痕量的原型化合物或代謝物，加之受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾[23,31]。

SKI 在大鼠體內(nèi)的原型化合物和代謝產(chǎn)物來源于尿液樣本較多，而血漿和糞便樣本中較少，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[17,22]，這可能與藥物半衰期、蛋白結(jié)合率、取樣方式、代謝排泄途徑等有關(guān)。大鼠體內(nèi)SKI 成分主要經(jīng)歷了I 相代謝反應(yīng)（羥基化、還原、脫飽和）和II 相代謝反應(yīng)（甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化、乙?；?、甘氨酸結(jié)合、半胱氨酸結(jié)合和?；撬峤Y(jié)合）。值得注意的是，甘氨酸、半胱氨酸和?；撬崾蔷哂兄匾飳W(xué)功能的內(nèi)源性物質(zhì)[32]。對(duì)與甘氨酸、半胱氨酸和?；撬峤Y(jié)合的代謝物（M20、M30、M42、M47、M50、M54、M55、M61）的進(jìn)一步研究可能有助于闡明SKI 在體內(nèi)的作用機(jī)制。

本研究共鑒定了SKI 在大鼠體內(nèi)的121 種化合物。其中，通過一些代謝反應(yīng)從原型中產(chǎn)生了92種代謝物，參與的代謝反應(yīng)主要包括羥基化、脫飽和、甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等。其中有53種代謝物是首次在大鼠的生物樣本中鑒定出來的。一些與內(nèi)源性物質(zhì)甘氨酸、半胱氨酸和牛磺酸結(jié)合的代謝物由于其潛在的活性將被重點(diǎn)研究。本研究將為SKI 在體內(nèi)的藥效學(xué)、毒理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及作用機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，本文基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 和CD 代謝平臺(tái)，提出的“提取-化合物篩選-鑒定-驗(yàn)證”的鑒定策略能快速、系統(tǒng)、全面的鑒定體內(nèi)化合物原型及其代謝產(chǎn)物，有助于體內(nèi)藥效物質(zhì)的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突