李凡凡, 徐陽, 王曉旭

1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心）乳腺外科，天津300193； 2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院（國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心）瘡瘍血管外科，天津 300193

肉芽腫性小葉性乳腺炎（GLM）是一種罕見的乳腺特發(fā)性慢性炎癥性病變，在臨床和乳房X 光檢查中通常偽裝成乳腺癌[1]。GLM 的病因和發(fā)病機制目前尚不清楚，其診斷治療是一個挑戰(zhàn)。 紫草素（Shikonin, SHI）是從紫草根中分離出來的一種天然萘醌類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種活性[2]。研究表明紫草素能通過抑制NF-κB 信號通路在LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎中發(fā)揮抗炎作用[3]。Nrf2/HO-1信號通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)中不可或缺的信號通路，參與抗炎、抗氧化、細胞凋亡等過程[4]。Nrf2 是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞的氧化應(yīng)激，也是維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子[5]。熱休克蛋白家族成員HO-1 是一種重要的抗炎、抗氧化和細胞保護酶，受主要轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 激活的調(diào)節(jié)，HO-1 表達上調(diào)對氧化應(yīng)激和炎癥條件下的細胞起保護作用。研究表明犬尿烯酸能通過抑制NF-κB 和激活Nrf2/Ho-1，減少炎癥反應(yīng)和增強血乳屏障完整性來減輕LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎[6]。紫草素能否通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1 信號通路改善大鼠肉芽腫性小葉性乳腺炎尚不清楚，本文建立肉芽腫性小葉性乳腺炎大鼠模型，基于Nrf2/HO-1 信號通路，探討紫草素對肉芽腫性小葉性乳腺炎的治療作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級大鼠，180～220 g，購自廣東南模生物科技有 限 公 司（SCXK（粵）2022-0062）；紫 草 素（HYN0822）和ML385（HY-100523）均購自MCE 公司；IL-1β（SP12225）、TNF-α（SP12250）、IL-8（SP12278）、SOD（SP12914）和GSH（SP12673）ELISA 試劑盒均購自武漢賽培生物科技有限公司；T-AOC（CB11081-Ra）和MPO（CB10780-Ra）ELISA 試劑盒均購自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司；NAGase（ER1177）ELISA 試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；ROS（JN482）ELISA 試劑盒購自上海紀寧生物科技有限公司；SYBR Premix EX Taq 試劑盒（RR390Q）購自Takara Bio 公司；抗體HO-1（ab305290）、GAPDH（ab8245）和二抗山羊抗兔IgG（ab6721）均購自Abcam 公司；抗體Nrf2（AF7623）和NLRP3（AF2155）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 肉芽腫性小葉性乳腺炎大鼠模型建立

根據(jù)參考文獻[7]建立肉芽腫性小葉性乳腺炎（GLM）大鼠模型。將人新鮮GLM 病變組織制成病變?nèi)橄俳M織勻漿液，取0.04 mL 病變?nèi)橄俳M織勻漿液在大鼠第3、4 對乳房進行注射包埋。正常大鼠注射等量的生理鹽水。1 周后進行大鼠乳腺組織局部觀察，隨后處死2 只大鼠，取第3、4 對乳腺組織進行病例切片觀察，鏡下出現(xiàn)特征性脂質(zhì)空泡周圍伴多種炎癥細胞浸潤，形成肉芽腫性炎癥或微膿腫時即可確認造模成功。將GLM 大鼠分為模型組（GLM 組）、紫草素低劑量組（SHI-L 組）、紫草素中劑量組（SHI-M組）、紫草素高劑量組（SHI-H 組）和紫草素高劑量+Nrf2 抑制劑ML385 組（SHI-H+ML385 組），每組15只。另取15 只正常大鼠作為對照組（Control 組）。根據(jù)參考文獻[3]及藥物劑量調(diào)整，SHI-L 組、SHI-M 組和SHI-H 組大鼠分別灌胃17.5、35、70 mg?kg-1·d-1的紫草素。SHI-H+ML385 組灌胃70 mg?kg-1·d-1的紫草素+腹 腔 注 射14 mg?kg-1·d-1的ML385[8]。Control 組 和GLM 組給予等量的生理鹽水。連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.1 HE 染色觀察乳腺組織病理學變化 各組隨機取5 只大鼠，取出乳腺組織，浸泡于4%多聚甲醛中固定，然后進行石蠟包埋，切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.2 炎癥因子水平和氧化指標檢測 各組隨機取5只大鼠，取出乳腺組織進行勻漿，離心收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明操作檢測乳腺組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α 和IL-8 水 平 及 過 氧 化 指 標T-AOC、SOD、GSH 和ROS 水平。

1.2.3 MPO 和NAGase 水平檢測 使用1.2.2 中乳腺組織勻漿，離心獲得上清液，嚴格按照ELISA 檢測試劑盒說明書操作，檢測MPO 和NAGase 水平。

1.2.4 NLRP3 炎性小體表達檢測 使用1.2.1 中的各組大鼠乳腺組織石蠟切片，脫水并水合，3%過氧化氫酶處理切片阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，與抗體NLRP3 在4 ℃下孵育過夜，后與熒光二抗室溫孵育1h，DAPI 復(fù)染，共聚焦顯微鏡下拍照觀察，并計算NLRP3 陽性率，NLRP3 陽性率（%）=NLRP3 陽性細胞數(shù)/DAPI×100%。

1.2.5 Nrf2、HO-1 蛋白水平檢測 將各組剩余5 只大鼠處死，取出乳腺組織。RIPA 緩沖液裂解各組大鼠乳腺組織，提取蛋白，BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，后使用5%的脫脂奶粉封閉1 h，與一抗Nrf2、HO-1 和GAPDH 在4 ℃下過夜孵育。后與二抗山羊抗兔IgG室溫孵育2h，ECL 顯影，Image J 軟件計算蛋白灰度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以(均值±標準差)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織病理變化的影響

與Control 組相比，GLM 組大鼠乳腺小葉被破壞、大片結(jié)節(jié)樣慢性肉芽腫炎性病灶生成，乳腺小葉組織邊界不清，腺葉內(nèi)出現(xiàn)空泡，伴有大量淋巴細胞及中性粒細胞浸潤；與GLM 組相比，SHI-L 組、SHI-M 組和SHI-H 組乳腺組織病變逐漸減輕；與SHI-H 組相比，SHI-H+ML385 組乳腺組織病變加重(圖1)。

圖1 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織病理變化的影響A: Control 組B: GLM 組C: SHI-L 組D: SHI-M 組E: SHI-H 組F: SHI-H+ML385 組Fig. 1 Effect of shikonin on pathological changes of mammary gland tissue in GLM rats. A: Control group; B:GLM group; C: SHI-L group; D: SHI-M group; E: SHI-H group; F: SHI-H+ML385 group.

2.2 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織炎癥因子水平和氧化指標的影響

與Control 組相比，GLM 組大鼠乳腺組織IL-8、IL-1β、TNF-α 和ROS 水 平 顯 著 增 加（P＜0.05），TAOC、SOD 和GSH 水平顯著降低（P＜0.05）；與GLM組相比，SHI-L 組、SHI-M 組和SHI-H 組大鼠乳腺組織IL-8、IL-1β、TNF-α 和ROS 水平依次降低（P＜0.05），TAOC、SOD 和GSH 水平依次增加（P＜0.05）；與SHI-H組相比，SHI-H+ML385 組大鼠乳腺組織IL-8、IL-1β、TNF-α 和ROS 水平顯著增加（P＜0.05），T-AOC、SOD和GSH 水平顯著降低（P＜0.05），見表1 和表2。

表1 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織炎癥因子水平的影響（±s, n=5）Tab.1 Effect of shikonin on the levels of inflammatory factors in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, n=5)

表1 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織炎癥因子水平的影響（±s, n=5）Tab.1 Effect of shikonin on the levels of inflammatory factors in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 組; bP＜0.05 vs GLM 組; cP＜0.05 vs SHI-L 組;dP＜0.05 vs SHI-M 組; eP＜0.05 vs SHI-H 組。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

TNF-α（pg/mL）76.47±5.32 226.82±13.17a 164.63±10.09b 138.25±8.42bc 89.68±5.91bcd 115.11±6.24e 203.352＜0.001 Groups Control 組GLM 組SHI-L 組SHI-M 組SHI-H 組SHI-H+ML385 組FP IL-8（ng/L）1.53±0.04 2.96±0.12a 2.61±0.10b 1.95±0.09bc 1.64±0.07bcd 1.79±0.05e 238.901＜0.001 IL-1β（pg/mL）5.02±0.24 18.43±2.05a 14.61±0.86b 9.57±0.35bc 5.34±0.41bcd 7.25±0.58e 156.297＜0.001

表2 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織氧化指標的影響（±s ,U/mg, n=5）Tab.2 Effect of shikonin on oxidative indicators of mammary tissue in GLM rats (Mean±SD,U/mg, n=5)

表2 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織氧化指標的影響（±s ,U/mg, n=5）Tab.2 Effect of shikonin on oxidative indicators of mammary tissue in GLM rats (Mean±SD,U/mg, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 組；bP＜0.05 vs GLM 組；cP＜0.05 vs SHI-L 組；dP＜0.05 vs SHI-M 組；eP＜0.05 vs SHI-H 組。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

ROS Groups T-AOC SOD GSH 1.14±0.07 5.82±0.47a 4.75±0.36b 3.28±0.21bc 1.86±0.09bcd 2.39±0.18e 217.750＜0.001 Control 組GLM 組SHI-L 組SHI-M 組SHI-H 組SHI-H+ML385 組FP 64.79±4.10 21.68±1.06a 33.04±1.15b 45.47±1.41bc 58.03±2.79bcd 51.25±2.36e 222.767＜0.001 174.32±10.56 76.82±4.32a 94.63±5.85b 128.25±6.91bc 159.68±9.03bcd 132.11±7.76e 116.951＜0.001 264.06±18.26 104.58±8.79a 145.61±12.43b 193.85±11.37bc 251.69±15.48bcd 206.92±13.01e 101.905＜0.001

2.3 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織MPO 和NAGase 水平的影響

與Control 組相比，GLM 組大鼠乳腺組織MPO 和NAGase 水平顯著增加（P＜0.05）；與GLM 組相比，SHI-L 組、SHI-M 組和SHI-H 組大鼠乳腺組織MPO 和NAGase 水平依次降低（P＜0.05）；與SHI-H 組相比，SHI-H+ML385 組大鼠乳腺組織MPO 和NAGase 水平顯著增加（P＜0.05），見表3。

表3 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織MPO 和NAGase 水平的影響（±s, ng/mL, n=5）Tab. 3 Effect of shikonin on MPO and NAGas levels in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, ng/mL, n=5)

表3 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織MPO 和NAGase 水平的影響（±s, ng/mL, n=5）Tab. 3 Effect of shikonin on MPO and NAGas levels in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, ng/mL, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 組；bP＜0.05 vs GLM 組；cP＜0.05 vs SHI-L 組；dP＜0.05 vs SHI-M 組；eP＜0.05 vs SHI-H 組。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

NAGase MPO 27.83±1.64 64.12±4.07a 56.37±3.29b 43.06±2.81bc 32.84±2.25bcd 38.10±2.43e 120.028＜0.001 Control 組GLM 組SHI-L 組SHI-M 組SHI-H 組SHI-H+ML385 組FP 34.53±2.84 92.96±7.73a 78.61±5.42b 65.95±4.17bc 43.64±2.36bcd 51.95±3.21e 110.016＜0.001

2.4 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織NLRP3 陽性表達的影響

與Control 組相比，GLM 組大鼠乳腺組織NLRP3陽性表達率顯著增加（P＜0.05）；與GLM 組相比，SHIL 組、SHI-M 組和SHI-H 組大鼠乳腺組織NLRP3 陽性表達率依次降低（P＜0.05）；與SHI-H 組相比，SHI-H+ML385 組大鼠乳腺組織NLRP3 陽性表達率顯著增加（P＜0.05），見圖2 和表4。

表4 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織NLRP3 陽性表達的影響（±s ,%, n=5）Tab.4 Effect of shikonin on NLRP3 positive expression in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, %, n=5)

表4 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織NLRP3 陽性表達的影響（±s ,%, n=5）Tab.4 Effect of shikonin on NLRP3 positive expression in breast tissue of GLM rats (Mean±SD, %, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 組；bP＜0.05 vs GLM 組；cP＜0.05 vs SHI-L 組；dP＜0.05 vs SHI-M 組；eP＜0.05 vs SHI-H 組。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

NLRP3 陽性表達率NLRP3 positive expression rate 7.89±0.35 45.36±3.62a 40.12±3.01b 24.79±2.17bc 14.63±1.86bcd 20.44±2.05e 183.946＜0.001組別Groups Control 組GLM 組SHI-L 組SHI-M 組SHI-H 組SHI-H+ML385 組FP

圖2 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織NLRP3 陽性表達的影響(標尺50 μm)Fig.2 Effect of shikonin on NLRP3 positive expression in breast tissue of GLM rats.(bar=50 μm)

2.5 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響

與Control 組相比，GLM 組大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與GLM 組相比，SHI-L 組、SHI-M 組 和SHI-H 組 大 鼠 乳 腺 組 織Nrf2 和HO-1 蛋白表達依次增加（P＜0.05）；與SHI-H 組相比，SHI-H+ML385 組大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖3 和表5。

表5 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響（±s , n=5）Tab.5 Effect of shikonin on Nrf2 and HO-1 protein expression in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, n=5)

表5 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響（±s , n=5）Tab.5 Effect of shikonin on Nrf2 and HO-1 protein expression in mammary gland tissue of GLM rats(Mean±SD, n=5)

注：aP＜0.05 vs Control 組；bP＜0.05 vs GLM 組；cP＜0.05 vs SHI-L 組；dP＜0.05 vs SHI-M 組；eP＜0.05 vs SHI-H 組。Note: aP＜0.05 vs Control group, bP＜0.05 vs GLM group, cP＜0.05 vs SHI-L group, dP＜0.05 vs SHI-M group, eP＜0.05 vs SHI-H group.

HO-1 0.74±0.04 0.13±0.01a 0.30±0.02b 0.48±0.03bc 0.69±0.05bcd 0.53±0.06e 177.418＜0.001 Groups Control 組GLM 組SHI-L 組SHI-M 組SHI-H 組SHI-H+ML385 組FP Nrf2 0.94±0.07 0.32±0.02a 0.51±0.03b 0.76±0.06bc 0.91±0.04bcd 0.80±0.05e 127.568＜0.001

圖3 紫草素對GLM 大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達的影響A: Control 組 B: GLM 組 C: SHI-L 組 D: SHI-M 組 E: SHI-H 組F: SHI-H+ML385 組Fig.3 Effect of shikonin on the expression of Nrf2 and HO-1 proteins in breast tissue of GLM rats. A: Control group；B:GLM group； C: SHI-L group； D: SHI-M group； E: SHI-H group；F: SHI-H+ML385 group.

3 討論

GLM 是一種罕見的慢性乳腺良性炎癥性疾病，通常表現(xiàn)為非干酪樣肉芽腫性病變。在過去二十年里，隨著發(fā)病率的迅速增加，GLM 往往發(fā)生在育齡婦女身上，病程長且反復(fù)發(fā)作[9]。研究表明紫草素主要通過調(diào)節(jié)多種信號通路、NLRP3 炎性體、活性氧應(yīng)激、Bax/Bcl-2 等發(fā)揮抗炎、抗癌、心血管保護等作用[10]。紫草素是一種很有前途的藥物，有必要對紫草素進行廣泛和深入的探索，以加快紫草素類藥物在臨床中的應(yīng)用。Lebda[11]等研究表明納米姜黃素顯著降低MDA、氧化型谷胱甘肽、促炎細胞因子的釋放以及TLR4、NF-κB p65 和HMGB1 的基因表達，提高還原型谷胱甘肽水平和Nrf2 活性，減輕LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎的炎癥和氧化應(yīng)激。本研究中紫草素治療后大鼠乳腺組織病變減輕，乳腺組織IL-8、IL-1β 和TNF-α 水平降低，T-AOC、SOD 和GSH 水平增加。表明紫草素能抑制炎癥因子及氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，改善大鼠肉芽腫性小葉性乳腺炎。

在炎癥部位中性粒細胞迅速集結(jié)，識別、吞噬和滅活外來微生物[12]。MPO 是中性粒細胞的主要成分，MPO 的激活可被視為中性粒細胞浸潤的直接生物標志物，外部刺激可導(dǎo)致中性粒細胞聚集，MPO 產(chǎn)生增加[13]。研究表明雞骨草總黃酮可以降低乳腺炎小鼠乳腺組織中的MPO 活性，減少中性粒細胞的聚集，緩解LPS 誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎癥[14]。NAGase 主要來源于乳腺上皮細胞，乳腺組織中NAGase 的水平與乳腺炎的嚴重程度成正比，當乳腺上皮細胞被破壞時釋放NAGase，該因素是乳腺上皮細胞損傷程度的標志[15]。研究顯示抑制MPO 和NAGase 活性，減少炎癥細胞浸潤，能保護大鼠乳腺組織免受過度炎癥反應(yīng)的損傷[16]。NLRP3 炎性小體在乳腺炎等炎癥性疾病的發(fā)病機制中起重要作用，通常被ATP 和活性氧（ROS）等各種“危險信號”激活[17]。NLRP3 炎癥小體通過調(diào)節(jié)炎癥因子水平影響炎癥的后續(xù)發(fā)展[18]。持續(xù)和不受控制的炎癥與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，嚴重的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致更多的ROS 產(chǎn)生，過量的ROS 會引起更嚴重的炎癥，加劇組織破壞[19]。本研究中紫草素治療后大鼠乳腺組織MPO、NAGase、ROS 水平及NLRP3 表達降低。表明紫草素能通過降低MPO、NAGase、ROS 水平減少炎癥細胞浸潤，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解炎癥。Nrf2/HO-1 信號通路被認為是最關(guān)鍵的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激途徑之一，是炎癥相關(guān)疾病的重要靶標[20]。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是抗氧化系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，HO-1 被認為是一種細胞保護、抗炎和抗氧化酶，Nrf2 和HO-1 是抗氧化信號傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)劑[21]。研究表明轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 通過誘導(dǎo)HO-1 來減輕炎癥，對氧化應(yīng)激起到保護作用[22]。Nrf2 儲存在細胞質(zhì)中，在正常狀態(tài)下與Keap 1 結(jié)合。當受到氧化刺激時，Nrf2 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，然后誘導(dǎo)HO‐1 轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮抗氧化作用[23]。Zhao[24]等研究表明衣康酸二甲酯上調(diào)Nrf2、HO-1、p38 和ERK 的 磷 酸 化，下 調(diào)TLR4 和p65-NF-κB 的 磷酸化，降低乳腺的病理損傷及炎癥因子水平，改善LPS 誘導(dǎo)的乳腺炎。本研究中紫草素治療后大鼠乳腺組織Nrf2 和HO-1 蛋白下調(diào)，炎癥因子水平降低及氧化應(yīng)激反應(yīng)受到抑制，抑制劑ML385 逆轉(zhuǎn)了紫草素對肉芽腫性小葉性乳腺炎大鼠的抗炎及抗氧化作用。表明紫草素可能通過激活Nrf2，上調(diào)HO-1 表達，進而抑制大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，緩解大鼠肉芽腫性小葉性乳腺炎。

綜上所述，紫草素可能通過增強Nrf2 和HO-1 的表達，抑制炎癥因子水平，增強抗氧化能力，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，改善大鼠肉芽腫性小葉性乳腺炎。紫草素對肉芽腫性小葉性乳腺炎大鼠的治療作用可能是通過激活Nrf2/HO-1 信號通路實現(xiàn)的。