王興航， 丁佳媛， 李放， 包翠芬*， 閻麗菁*

錦州醫(yī)科大學(xué) 1.組織胚胎學(xué)教研室，2.人體解剖學(xué)教研室，3.分析化學(xué)教研室，4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 錦州 121001

缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）是臨床上最常見(jiàn)的一種卒中類型，占所有卒中患者的80%以上，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率四個(gè)特點(diǎn)，且常急性起病，嚴(yán)重威脅人類健康和生命[1]。目前，臨床上常采用溶栓治療IS，但若血栓自溶或溶栓藥物使用超過(guò)時(shí)間窗，血流再通后可引起腦缺血再灌注 損 傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）[2]。CIRI 是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的病理生理過(guò)程，包括能量代謝障礙、氧化損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血腦屏障破壞、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞自噬、凋亡等，其中炎性反應(yīng)是其主要病理過(guò)程之一[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)常駐免疫細(xì)胞，在受到內(nèi)源性或外源性刺激后迅速激活，釋放抗炎因子，促進(jìn)組織修復(fù)與重塑。但是在發(fā)揮抗炎作用的同時(shí)也釋放大量的促炎因子及神經(jīng)毒性介質(zhì)，加重缺血部位組織損傷[4]。因此，減輕炎癥，積極控制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活是減輕腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)之一。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein3，NLRP3）炎癥小體與炎癥的發(fā)展密切相關(guān)，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)炎癥反應(yīng)通常伴隨NLRP3 炎癥小體表達(dá)增多，因此，抑制NLRP3 炎癥小體表達(dá)對(duì)控制炎癥發(fā)展具有重要意義[5]。人參皂苷Rg1 是人參的主要生物活性成分，具有廣泛的藥理活性，例如抗炎癥反應(yīng)、抗纖維化、抗自由基損傷、抗疲勞及顯著的神經(jīng)保護(hù)和肝保護(hù)的作用，還可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Rg1 可減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的炎癥反應(yīng)[6]，本文旨在探討體外情況下Rg1 能否通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體在BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)減輕腦缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自上海傳秋生物公司；人參皂苷Rg1（純度＞95%）購(gòu)自吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室；DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、蛋白Marker 購(gòu)自TransGen Biotech 公 司；CCK-8 試 劑 購(gòu) 自 美 國(guó)APExBIO 公 司；ASC、Caspase-1 抗體購(gòu)自Abclonal 公司；NLRP3 抗體購(gòu)自Abcam 公司；IL-1β、IL-18 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D 公司。缺氧倉(cāng)購(gòu)自STEMCELL 公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自伯樂(lè)公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞用含10% 胎牛血清、106 IU /L 鏈霉素、105 IU /L 青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，接種于培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞至合適密度，加入2～3 mL 培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、含有95%空氣和5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氧葡萄糖剝奪/復(fù)供（OGD/R）模型構(gòu)建方法OGD 模型：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁后的細(xì)胞，加入無(wú)糖培養(yǎng)基，放入缺氧倉(cāng)中，為營(yíng)造缺氧環(huán)境，向缺氧倉(cāng)中通氮?dú)?0 min 以排空倉(cāng)內(nèi)的氧氣，排空后密閉，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在體外模擬腦缺血損傷。OGD/R 模型：OGD 處理2 h 后取出細(xì)胞恢復(fù)氧氣供應(yīng)，將無(wú)糖培養(yǎng)基置換為完全培養(yǎng)基，加入等量細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，置于含有95% 空氣和5% 的CO2孵箱中，在體外模擬腦缺血/再灌注損傷[7]。對(duì)照組細(xì)胞始終用完全培養(yǎng)基，并置于37 ℃、含有95% 空氣和5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為6 組：無(wú)處理組（Con）、氧糖剝奪/復(fù)供組（OGD/R）、人 參 皂 苷Rg1 低 劑 量 組（0.1 mmol/L，Rg1L）、人參皂苷Rg1 中劑量組（0.2 mmol/L，Rg1M）、人參皂苷Rg1 高劑量組（0.4 mmol/L，Rg1H）、MCC950對(duì)照組（0.05 mmol/L，MCC950）[8,9]。除Con 組不作任何處理外，其它各組制備OGD/R 模型后，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、不同濃度的人參皂苷Rg1 和MCC950，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行OGD/R 處理。接下來(lái)依次加入不同濃度人參皂苷Rg1 和MCC950。每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL CCK8 試劑，放入培養(yǎng)箱孵育1～4 h。于450 nm 處測(cè)定OD 值。根據(jù)說(shuō)明書計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)Iba-1、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平 將聚賴氨酸防脫載玻片置入12 孔板中，六組細(xì)胞分別接種于孔板的載玻片上，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104/ml，每孔加入1 mL 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁后，除Con 組不作任何處理外，其它各組制備OGD/R 模型后，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液、不同濃度的人參皂苷Rg1 和MCC950，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h 后取出孔板，棄上清，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次；4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，固定后以PBS 漂洗3 次，每次3 min；加入0.1%Triton X-100 的PBS 溶液通透細(xì)胞膜30 min 后，漂洗3 次，每次3 min；加入5%胎牛 血 清 室 溫 封 閉60 min。 每 孔 加 入200 μL 的NLRP3、ASC、Caspase-1（稀釋比例均為1∶100）、Iba-1（稀釋比例均為1∶1000）一抗工作液后置入4 ℃冰箱過(guò)夜。次日取出孔板，加入FITC 標(biāo)記的二抗工作液（稀釋比例為1∶200）室溫孵育60 min，全程避光；最后避光加入DAPI 染色劑常溫復(fù)染細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Western blotting 檢 測(cè)Iba-1、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平 RIPA 裂解法抽提細(xì)胞總蛋白后，根據(jù)二喹啉甲酸( bicinchoninic acid，BCA) 法測(cè)定的蛋白濃度結(jié)果，將各樣品的蛋白濃度調(diào)節(jié)一致; 經(jīng)過(guò)SDS-PAGE 蛋白轉(zhuǎn)印后，用含有3%BSA 封閉液將轉(zhuǎn)印好的PVDF 膜，室溫孵育，封閉1 h; 加入NLRP3、ASC（稀釋比例均為1∶1000）Caspase-1（稀釋比例為1∶2000）GAPDH（稀釋比例為1∶1500)一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜;次日加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1:2000），室溫下振搖1.5 h，以ECL發(fā)光顯色，得到條帶。

1.2.6 ELISA 法檢測(cè)IL-18、IL-1β 炎癥因子表達(dá)水平收集所有組別細(xì)胞上清液，將測(cè)試樣品按照說(shuō)明書精準(zhǔn)加液后，將孔板37 ℃水浴溫育60 min。取出孔板，吸棄所有孔內(nèi)液體，洗滌并盡量拍干，重復(fù)5 次。每孔加入顯色劑反應(yīng)10 min，加入終止液終止反應(yīng)。10 min 內(nèi)以450 nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔光密度值并計(jì)算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)使用SPSS 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本之間的比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD，方差不齊采用Tamhane 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1 對(duì)OGD/R 損傷后BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響。

如圖1 所示, BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞正常狀態(tài)下呈橢圓形和紡錘形，紡錘形細(xì)胞兩端有兩根細(xì)小突起[10]；經(jīng)OGD/R 處理后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，表現(xiàn)為胞體呈正圓形，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，折光度增強(qiáng)，此為M1(經(jīng)典型)，可啟動(dòng)吞噬功能、分泌促炎因子[11]。經(jīng)人參皂苷Rg1 和MCC950 處理48h 后，胞體縮小，細(xì)胞呈分支狀，突起粗且長(zhǎng)，此為M2(替代型)，主要分泌抗炎因子和神經(jīng)保護(hù)介質(zhì)[12]。與ODG/R 組對(duì)比，人參皂苷Rg1 和MCC950 均可促進(jìn)損傷激活的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞由M1 向M2 轉(zhuǎn)化，起到了抑制炎癥發(fā)展的作用。

圖1 人參皂苷Rg1 和MCC950 對(duì)BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化的影響Fig.1 Effect of ginsenoside Rg1 and MCC950 on morphological changes of BV-2 microglia cells.

2.2 Iba-1 免疫熒光法檢測(cè)BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況

如圖2 所示，Iba-1 通常作為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物[13]。免疫熒光染色結(jié)果顯示，Con 僅有少量細(xì)胞呈現(xiàn)Iba-1 綠色熒光，而OGD/R 組可見(jiàn)大量細(xì)胞呈現(xiàn)Iba-1 綠色熒光表達(dá)。提示經(jīng)過(guò)缺氧缺糖/復(fù)供后大量小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。

圖2 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1 染色Fig.2 Iba-1 staining of BV-2 microglia cells.

2.3 CCK8 法檢測(cè)BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況

如圖3 所示,與Con 組比較，OGD/R 處理后，BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率顯著增高；而經(jīng)過(guò)人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞48 h 后，BV-2 細(xì)胞的增殖率則呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，且Rg1 3 個(gè)劑量之間有顯著差異，但Rg1H 與MCC950之間無(wú)顯著差異。

圖3 各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞增殖率改變與Con 組 比 較，**P＜0.01；與OGD/R 組 比 較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig. 3 Changes in the proliferation rate of BV-2 microglia in each group. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01;Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01; Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

2.4 人參皂苷Rg1 對(duì)NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)的影響

如圖4、6、8 所示,免疫熒光結(jié)果顯示，Con 組僅見(jiàn)微弱的綠色熒光；經(jīng)OGD/R 處理后呈現(xiàn)明顯的綠色熒光表達(dá)；低、中、高濃度人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞48 h，綠色熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱；如圖5、7、9 所示，免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果分析，與其它各組比較，OGD/R 組呈現(xiàn)最為明顯的ASC、Caspase-1、NLRP3 表達(dá)條帶。低、中、高劑量人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞48h 后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、ASC 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，且Rg1 3 個(gè)劑量之間有顯著差異，但Rg1H 與MCC950 之間無(wú)顯著差異;Caspase-1 的表達(dá)與上述有些許不同，與Rg1L 組比較，Rg1M 和Rg1H的表達(dá)水平顯著降低，但二者之間無(wú)顯著差異，且與MCC950 組無(wú)顯著差異。

圖4 免疫熒光法觀察各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 表達(dá)情況Fig.4 The expression of NLRP3 in BV-2 microglia detected by immunofluorescence.

圖5 免疫印跡法檢測(cè)各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 蛋白表達(dá)水平及柱狀圖與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig.5 The protein expression level of NLRP3 in BV-2 microglia in each group detected by WB and the bar graph. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01;Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01;Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

圖6 免疫熒光法觀察各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞ASC 表達(dá)情況Fig. 6 The expression of ASC in BV-2 microglia detected by immunofluo rescence.

圖7 免疫印跡法檢測(cè)各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞ASC 蛋白表達(dá)水平及柱狀圖與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig. 7 The protein expression level of ASC in BV-2 microglia in each group detected by WB and the bar graph. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group,##P＜0.01; Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01;Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

圖8 免疫熒光法觀察各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞Caspase-1 表達(dá)情況Fig.8 The expression of Caspase-1 in BV-2 microglia detected by immunofluorescence.

圖9 免疫印跡法檢測(cè)各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞Caspase-1 蛋白表達(dá)水平及柱狀圖與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01Fig. 9 The protein expression level of Caspase-1 in BV-2 microglia in each group detected by WB and bar graph. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01;Compared with Rg1L group,ΔΔP＜0.01; Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01.

2.5 人參皂苷Rg1 對(duì)細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 表達(dá)的影響

ELISA 法檢測(cè)結(jié)果如圖10 所示，低、中、高劑量人參皂苷Rg1 和MCC950 作用于OGD/R 處理后的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1β、IL-18 的表達(dá)明顯下調(diào)。且Rg1 3 個(gè)劑量之間有顯著差異，但均高于MCC950 組。

圖10 各組BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18 蛋白表達(dá)影響與Con 組比較，**P＜0.01；與OGD/R 組比較，##P＜0.01；與Rg1L 組比較，ΔΔP＜0.01；與Rg1M 組比較，▲▲P＜0.01；與Rg1H 組比較，■P＜0.05Fig.10 Effect of IL-1β and IL-18 protein expression in the culture medium of BV-2 microglia cells in each group. Compared with Con group, **P＜0.01; Compared with OGD/R group, ##P＜0.01; Compared with Rg1L group, ΔΔP＜0.01;Compared with Rg1M group, ▲▲P＜0.01; Compared with Rg1H group, ■P＜0.05.

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一種可嚴(yán)重影響缺血性腦卒中預(yù)后的病理生理過(guò)程，病變周圍組織會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、線粒體自噬、嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)和激烈的級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)[14]。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，腦缺血損傷后，缺血組織會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，血流再通后，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子加重組織損傷[15]，因此控制炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中占有重要的位置。人參是指人參植物C.A.的根，是世界上使用歷史最悠久、最廣泛的草藥產(chǎn)品之一。人參皂苷是人參中最重要的生物活性成分，其中人參皂苷Rg1 含量最高。Rg1 可減少腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞壞死和凋亡，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而起到腦保護(hù)的作用[16]。

抵抗炎癥反應(yīng)，是減輕腦缺血再灌注損傷的重要一環(huán)。在腦缺血再灌注損傷初期的幾個(gè)小時(shí)，復(fù)灌區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞迅速聚集、增殖活化，啟動(dòng)吞噬功能，清除周圍壞死細(xì)胞，分泌抗炎細(xì)胞因子和神經(jīng)保護(hù)介質(zhì)，發(fā)揮炎癥反應(yīng)的積極作用。隨著病程的發(fā)展，小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖活化，分泌促炎因子，加重組織損傷。因此控制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖活化是抑制腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的首要任務(wù)[17]。CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)OGD/R 處理后BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞與對(duì)照組相比增殖能力明顯增強(qiáng)，表明細(xì)胞激活。經(jīng)不同濃度人參皂苷Rg1 處理后BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞增殖效率明顯下降，說(shuō)明Rg1 可抑制細(xì)胞激活，且具有劑量依賴性。經(jīng)過(guò)NLRP3 抑制劑MCC950 處理后的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞同樣抑制了細(xì)胞增殖活化，提示了人參皂苷Rg1 可能是通過(guò)抑制NLRP3 炎癥小體的激活從而抑制BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活化。小膠質(zhì)細(xì)胞活化分為M1（經(jīng)典型）和M2（替代型）兩種表型[18]。靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞呈“橢圓形”或“紡錘狀”，形似眼睛，胞體兩端發(fā)出細(xì)而短的突起。使用OGD/R 模型刺激BV-2 細(xì)胞后，細(xì)胞呈“阿米巴樣”改變，胞體變大，突起回縮，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，此為M1 型[19]。經(jīng)過(guò)不同濃度人參皂苷Rg1處理后，細(xì)胞變?yōu)椤胺种睢?，胞體較M1 型變小，突起增加，且與靜息態(tài)相比突起較為粗長(zhǎng)，此為典型M2型[20]。當(dāng)用OGD/R 方法刺激BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞迅速由靜息態(tài)轉(zhuǎn)化為M1 型，M1 型為促炎狀態(tài)，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，具有神經(jīng)毒性作用[21]。當(dāng)加入人參皂苷Rg1 和MCC950 處理后，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為M2 型，表現(xiàn)為抗炎和吞噬功能，分泌抗炎細(xì)胞因子以及各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，同時(shí)吞噬細(xì)胞碎片，拮抗神經(jīng)損傷[22]。M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞在抑制炎癥，過(guò)敏反應(yīng)，組織重塑，血管再生，免疫調(diào)節(jié)中和維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用[23]。諸多因素可刺激靜息狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 轉(zhuǎn)化，其中NLRP3 炎癥小體的蓄積是最重要的刺激因素之一[24]。從BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的形態(tài)變化，提示了人參皂苷Rg1 可能具有引導(dǎo)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化的能力，從而發(fā)揮抗炎功效，但是具體機(jī)制還有待研究。

炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)的固有受體，炎癥小體主要由3 部分組成：NLRs、具有CARD 的凋亡相關(guān)斑點(diǎn) 蛋 白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，ASC）以及包含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1 前體（pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1，pro-caspase-1），NLRP3炎癥小體是研究最為深入的炎癥小體之一[25]。許多缺血再灌注損傷后的器官，例如腦，心臟，腎臟和睪丸缺血再灌注后均發(fā)現(xiàn)了NLRP3 炎癥小體的蓄積[26]。NLRP3 廣泛存在于多種細(xì)胞中，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞是功能性NLRP3 炎癥小體產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[27]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制NLRP3 炎癥小體途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可顯著改善腦缺血再灌注損傷[28]。

細(xì)胞內(nèi)ROS 或ATP 蓄積到一定程度后會(huì)對(duì)下游NLRP3 產(chǎn)生刺激，形成蛋白復(fù)合體，該蛋白復(fù)合體由NLRP3 蛋 白，ASC 和pro-caspase-1 組 成，NLRP3 炎 性復(fù)合體也是pro-caspase-1 自我催化水解的平臺(tái)，促使自身轉(zhuǎn)化為成熟的Caspase-1。Caspase-1 能夠刺激炎癥因子IL-1β 和IL-18 釋放，并參與到后續(xù)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)OGD / R 誘導(dǎo)損傷 的BV-2 小 膠 質(zhì) 細(xì) 胞 中，NLRP3、ASC 和 下 游 的caspase-1 及炎癥因子IL-18、IL-1β 的表達(dá)水平均有所上升。而經(jīng)過(guò)不同濃度人參皂苷Rg1 處理激活的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞后NLRP3 炎癥小體及其下游產(chǎn)物caspase-1 均得到相應(yīng)抑制，炎癥因子IL-18，IL-1β 表達(dá)同樣減少，與經(jīng)典的NLRP3 炎癥小體抑制劑MCC950 結(jié)果一致。

綜上所述，人參皂苷Rg1 可抑制氧糖剝奪/復(fù)供損傷后BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可能與抑制NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白的表達(dá)、干擾NLRP3 炎癥小體合成，并減少相關(guān)炎癥因子釋放有關(guān)，但其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。