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小春花木犀草素提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

2024-02-28 10:35:04何若男林啟凰張豫杰陳仲巍
保鮮與加工 2024年2期
關(guān)鍵詞:草素木犀春花

何若男,陳 歡,易 超,林啟凰,張豫杰,吳 婷,陳仲巍

(廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,福建 廈門 361023)

小春花為陰地蕨(Sceptridium ternatum(Thunb.)Lyon)植物的帶根全草[1],廣泛分布于我國大部分省區(qū),其全草均可入藥,為福建民間常用草藥[2],具有清熱解毒、止咳平喘及化痰之功效。福建省立醫(yī)院藥劑科參考民間經(jīng)驗將小春花結(jié)合其他藥物開發(fā)為復(fù)方藥劑——小伏口服液[3],臨床主要用于久咳、病后聲啞、支氣管哮喘等疾病的治療[4-5]。前期研究發(fā)現(xiàn),小春花中含有大量黃酮類化合物,主要為木犀草素、槲皮素、山奈酚、陰地蕨素[6],其毒性較低,小鼠的最大耐受灌胃給藥量為80 g/kg,臨床用藥較安全[7],但目前對其臨床及藥理相關(guān)報道仍較少,未被收錄進(jìn)2015 版《中華人民共和國藥典》,僅被收錄入同年的《浙江省中藥炮制規(guī)范》,也僅有小伏口服液這款單一藥品問世,其潛在價值亟待開發(fā)。

木犀草素是小春花的主要成分之一,木犀草素含量高的植物在伊朗、中國和巴西常被用于傳統(tǒng)藥物中治療炎癥相關(guān)疾病,因此受到諸多關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn),木犀草素有助于減輕皮膚炎癥[8]和肝臟纖維化[9],對腫瘤(MA腫瘤細(xì)胞)[10]、病毒[11]、腸道沙門氏菌均有抑制作用[12]。近年來還發(fā)現(xiàn)其對各種大腦慢性?。òò柎暮D。┚哂兄委熥饔肹13],使用前景已由抗菌藥物拓展到神經(jīng)保護(hù)保健品、食品保護(hù)劑等多個方向。小春花是目前已知含木犀草素較高且來源豐富的植物資源[14-15],是制備木犀草素的理想原料[16-19]。

此外,市面上一些合成類抗氧化劑的潛在毒性正逐步凸顯,如二丁基羥基甲苯(BHT)和丁基羥基茴香醚(BHA)。有研究表明,定量攝取BHT 可促進(jìn)化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的小鼠肺癌的發(fā)生,合成類化學(xué)物質(zhì)的毒副作用限制了其抗氧化能力的應(yīng)用范圍,因而篩選安全、天然的抗氧化活性成分備受關(guān)注。

當(dāng)前,一些植物源抗氧化劑已有良好的市場應(yīng)用前景,如提取自迷迭香和茶葉的抗氧化劑均已通過國家衛(wèi)生健康委員會的安全檢驗,成為食品安全級抗氧化劑。其中,迷迭香提取劑的抗氧化效果可達(dá)合成氧化劑的3~6倍,且耐熱性良好,在持續(xù)190 ℃高溫油炸下仍具有抗氧化效果。此外,它還適用于各種復(fù)雜的類脂物抗氧化,應(yīng)用廣泛[20]。市場信心方面,消費者普遍認(rèn)為天然抗氧化劑更為安全,也成為其一大優(yōu)勢[21]。小春花富含包括木犀草素的多種具有抗氧化性的黃酮類物質(zhì),因此,對其抗氧化性進(jìn)行評價,將為小春花的開發(fā)及應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

小春花,采摘自福建省廈門市同安區(qū)五顯鎮(zhèn);木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.063%),成都瑞芬思生物科技有限公司;VC、蘆丁、總還原力(T-AOC)試劑盒,北京索萊寶公司;乙醇、甲醇、乙酸等試劑均為分析純,西隴化工股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

3K15型離心機(jī),美國Sigma公司;DHG-9140鼓風(fēng)干燥箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;SpectraMax i3X酶標(biāo)儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;N-1300VWB 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化器械株式會社。

1.2 方法

1.2.1 小春花中木犀草素的提取

用蒸餾水將采摘的新鮮小春花洗凈,太陽光下自然風(fēng)干,后置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥,粉碎后過100 目篩備用。取小春花干粉1 g,按照不同的料液比加入不同濃度的乙醇溶劑,混合均勻后分別設(shè)定不同的超聲功率、時間和溫度進(jìn)行超聲提取,再離心(10 000 r/min,4 ℃)10 min,吸出上清液備用。沉淀殘渣重復(fù)上述步驟再提取2 次。合并上清液,進(jìn)行單因素試驗和正交試驗。以上試驗均重復(fù)3 次。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

固定液料比20∶1(mL/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,超聲功率350 W,超聲溫度70 ℃,超聲時間30 min,分別考察不同超聲溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)、超聲時間(10、20、30、40、50 min)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g))及乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)對木犀草素提取量的影響。

1.2.3 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,以超聲溫度、超聲時間、液料比及乙醇體積分?jǐn)?shù)為主要影響因素,以木犀草素提取量為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗,試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal test

1.2.4 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考王春紅等[22]的方法,精確稱取20.000 mg 的70 ℃下烘干至恒重的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品,以適量的50%甲醇溶液(輔以水浴加熱)溶解后,再以無水甲醇定容搖勻,精確制取以0.002 mg/mL 為濃度梯度的0~0.012 mg/mL 的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,測定其在408 nm處的吸光度值(OD408nm),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 木犀草素提取量的測定

將0.5 mL 提取液與1 mL 提前配制的0.1 mol/L AlCl3溶液快速混勻,隨即與1.6 mL 濃度為1 mol/L 的乙酸鉀溶液混勻,于室溫靜置15 min 后測定其OD408nm[23-24],帶入下式計算樣品(小春花干粉)提取液中木犀草素提取量。計算公式如下:

式中:C為測得的吸光度代入回歸方程式計算得到的木犀草素的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液體積,mL;K為稀釋倍數(shù);m為小春花干粉質(zhì)量,g。

1.2.6 小春花體外抗氧化能力的測定

精確稱取小春花提取物經(jīng)旋蒸所得干樣品,用無水乙醇溶解配制成不同濃度樣品液,以文獻(xiàn)[25-26]中的方法進(jìn)行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)自由基、羥基自由基(·OH)清除能力及總還原力測定,每個樣品重復(fù)測定3 次,并以天然抗氧化物VC和天然黃酮苷蘆丁作為對照。

1.2.6.1 DPPH·清除能力測定

分別將質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 mg/L的VC溶液、小春花樣液、蘆丁樣液100μL置于不同試管中,取等量當(dāng)天新鮮配制的DPPH溶液(0.2 mol/L)于避光處混合均勻,避光常溫(25 ℃)反應(yīng)40 min 后立即測定其在517 nm 處的吸光度值A(chǔ)1,將其中去離子水替換為小春花樣液測得A2,將DPPH溶液替換為無水乙醇測得A0,重復(fù)3次。DPPH·清除率計算公式為:

1.2.6.2 ·OH清除能力測定

于96孔板中依次加入精確配制的質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 mg/L的小春花樣液25μL,之后分別添加1.76 mmol/L水楊酸-乙醇溶液(以50%乙醇作溶劑)25 μL 和1.76 mmol/L FeSO4(當(dāng)天新鮮配制)25μL,混勻,隨后添加1.76 mmol/L H2O2試液25μL以啟動反應(yīng),37 ℃避光水浴30 min后,測定其在510 nm處的吸光度值A(chǔ)′1。以25μL小春花樣液與75μL無水乙醇混合測定其在510 nm 處的吸光度值A(chǔ)′0,以去離子水替代小春花樣液作空白對照A′2,重復(fù)3 次,并測定同濃度下VC、蘆丁對·OH 的清除率?!H 清除率計算公式為:

1.2.6.3 ABTS+自由基清除能力測定

將97.5 mg ABTS粉末與16.5 mg K2S2O8溶解于超純水并定容至25 mL,待4 ℃避光16 h 溶液變穩(wěn)定后得到ABTS 儲備液。將儲備液與無水乙醇以體積比1∶75 比例混合,使OD734nm為0.700±0.015,得ABTS 工作液。將10μL梯度濃度(20、40、60、80、100 mg/L)樣品液與500 μL 新鮮配制的ABTS 工作液避光混勻,6 min 后測定其在734 nm 處的吸光度值A(chǔ)″1,以無水乙醇代替小春花樣液得A″0,以無水乙醇代替ABTS工作液得A″2,重復(fù)3 次,并測定同濃度下VC、蘆丁的清除率。ABTS+自由基清除率計算公式為:

1.2.6.4 總還原力測定

參考試劑盒的方法測定小春花提取物總還原力。于96 孔板中依次加入新鮮配制的FRAP 工作液(配制參照T-AOC試劑盒)180μL,梯度濃度(20、40、60、80、100 mg/L)小春花樣品液6μL,蒸餾水18μL,室溫混合10 min后,吸取200μL測定其在593 nm處的吸光度值A(chǔ)3,用蒸餾水替代樣品得A3′,重復(fù)3次,并測定同濃度下VC、蘆丁的總還原力,總還原力單位為mmol/L。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差和組間差異顯著性SSR 檢驗分析,P<0.05 表示具有顯著差異,P<0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以“1.2.4”中的方法擬合回歸方程為:y=125.86x-0.014 3(R2=0.999 8),由圖1可見,木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)量濃度0~0.012 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of luteolin

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2和圖3可知,隨著超聲溫度與時間的增加,小春花木犀草素提取量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢,最佳超聲溫度和提取時間分別為80 ℃和20 min。早期溫度升高和提取時間延長均會促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出,隨后的降低可能是因為溫度過高會促進(jìn)其余細(xì)胞內(nèi)容物更多的溶出,溶液黏度增加,對木犀草素的進(jìn)一步溶出形成阻礙[25];亦或當(dāng)超聲時間過長時,超聲波的剪切力破環(huán)了木犀草素的化學(xué)鍵,導(dǎo)致木犀草素提取量下降。由圖4和圖5可知,最佳液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20∶1(mL/g)和50%。前期木犀草素提取量增加是因為溶質(zhì)分子越多越有利于其余溶質(zhì)分子的溶出,后續(xù)降低則是因為雜質(zhì)過多對木犀草素提取產(chǎn)生不良影響[27]。

圖2 超聲溫度對木犀草素提取量的影響Fig.2 Influence of ultrasonic temperatures on the extraction amounts of luteolin

圖3 超聲時間對木犀草素提取量的影響Fig.3 Influence of ultrasonic time on the extraction amounts of luteolin

圖4 液料比對木犀草素提取量的影響Fig.4 Effects of liquid-solid ratios on the extraction amounts of luteolin

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對木犀草素提取量的影響Fig.5 Effects of ethanol concentrations on the extraction amounts of luteolin

2.3 正交試驗結(jié)果

如表2 所示,4 個因素對木犀草素提取量影響的主次順序為:C>A>D>B,即液料比>超聲溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時間;最佳提取工藝條件為:A3B3C3D3,即超聲溫度85 ℃,超聲時間25 min,液料比25∶1(mL/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。方差及顯著性分析結(jié)果如表3 所示,4 個因素對提取量均具有極顯著性影響(P<0.01)。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal results

2.4 組間差異顯著性SSR檢驗

采用SPSS 20.0軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行組間差異顯著性SSR 檢驗分析[28]。結(jié)果如表4 所示,因素A的水平1與水平2、水平3之間均具有顯著性差異(P<0.05),水平2 和水平3 之間無顯著性差異;因素B的各水平間均無顯著性差異;因素C的水平1與水平2、水平3之間均具有極顯著性差異(P<0.01),水平2和水平3之間無顯著性差異;因素D的水平1和水平3,水平2 和水平3 之間有顯著性差異(P<0.05),水平1和水平2 之間無顯著性差異。根據(jù)此結(jié)果修正最佳工藝條件為:A2B1C2D3,即超聲溫度80 ℃、超聲時間15 min、液料比20∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。

表4 組間差異顯著性SSR檢驗Table 4 SSR test for significance of differences between groups

2.5 驗證試驗結(jié)果分析

對試驗所得最佳提取工藝進(jìn)行驗證,試驗重復(fù)3 次,結(jié)果表明,正交試驗優(yōu)化的最佳工藝條件下得到的木犀草素提取量(4.88 mg/g)高于組間差異顯著性SSR檢驗結(jié)果(4.63 mg/g),且高于正交試驗各試驗號的提取結(jié)果。

2.6 小春花提取物體外抗氧化活性

2.6.1 DPPH·清除能力

如圖6 所示,VC、蘆丁與小春花樣品均具備DPPH·清除能力,且清除力強(qiáng)弱與質(zhì)量濃度存在量效關(guān)系。當(dāng)小春花提取物質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/L時,其清除率已超出50%,與VC相當(dāng);當(dāng)質(zhì)量濃度為80 mg/L及100 mg/L 時,清除率分別為90.1%和92.8%,與VC接近(97.6%)。但質(zhì)量濃度為40 mg/L 時,其清除率顯著低于VC(P<0.05)。小春花提取物清除DPPH·的IC50為14.9 mg/L,總體而言其DPPH·清除能力高于蘆?。↖C50=16.4 mg/L),且其在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與VC(IC50=14.8 mg/L)接近,清除能力較強(qiáng)。

圖6 VC、蘆丁及小春花提取物對DPPH·的清除能力Fig.6 Scavenging abilities of VC,rutin and Botrychium ternatum extract against DPPH·

2.6.2 羥基自由基清除能力

還原劑與試液發(fā)生Fenton 反應(yīng),產(chǎn)生·OH,其與水楊酸反應(yīng)顯紅色,色澤輕重與·OH 質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。如圖7所示,樣品質(zhì)量濃度在20~100 mg/L時,其對·OH 清除能力隨樣品質(zhì)量濃度的提高而增強(qiáng)。當(dāng)小春花提取物質(zhì)量濃度為20、40、100 mg/L時,·OH清除率分別達(dá)31.2%、36.6%和70.5%,與VC(34.5%、38.8%、74.5%)接近,小春花提取物清除·OH的IC50為78.6 mg/L,蘆 丁 與VC 的IC50分別為105.3 mg/L 和61.2 mg/L。

圖7 VC、蘆丁及小春花提取物對·OH的清除能力Fig.7 Scavenging abilities of VC,rutin and Botrychium ternatum extract against·OH

2.6.3 ABTS+自由基清除能力

常態(tài)下,ABTS+的離子基團(tuán)經(jīng)氧化后形成更為穩(wěn)定的水溶性離子基團(tuán),溶液由淺色變?yōu)樗{(lán)綠色。而還原劑的加入可減弱氧化進(jìn)程,使溶液顏色變淺,特征峰值降低,因此,反應(yīng)液褪色越明顯(特征峰值越低)則表明該檢測物(小春花)的抗氧化能力越強(qiáng)[29]。如圖8 所示,樣品質(zhì)量濃度在20~100 mg/L 時,ABTS+自由基的清除能力與蘆丁、小春花樣品提取物、VC質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān),相對呈線性關(guān)系,且蘆丁對ABTS+自由基的清除率遠(yuǎn)低于小春花提取液和VC。當(dāng)小春花提取物質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L 時,清除率可達(dá)42.5%,與VC(43.4%)接近,遠(yuǎn)高于蘆丁(13.6%),小春花提取物清除ABTS+自由基的IC50為80.2 mg/L,蘆丁與VC的IC50分別為248.3 mg/L和76.6 mg/L。

圖8 VC、蘆丁及小春花提取物對ABTS+自由基的清除能力Fig.8 Scavenging abilities of VC,rutin and Botrychium ternatum extract against ABTS+free radical

2.6.4 總還原力測定

該測定中包括了各種還原性大分子、還原性小分子及酶的總體還原力水平,在酸性條件下,測樣中的還原性物質(zhì)將三價鐵離子Fe3+-TPTZ(赤血鹽K3Fe(CN)6)還原生成普魯士藍(lán)色的二價鐵離子Fe2+-TPTZ(黃血鹽K4Fe(CN)6),進(jìn)而使試樣溶液變色,測定其OD700nm可通過檢測普魯士藍(lán)的深淺來評價待測樣的還原力[30]。如圖9 所示,3 個測試品的還原力均與質(zhì)量濃度呈明顯量效關(guān)系。同質(zhì)量濃度下,小春花提取物的還原力顯著強(qiáng)于蘆丁(P<0.05),但顯著弱于VC(P<0.05),表明其具有一定的還原力。

圖9 VC、蘆丁及小春花提取物的總還原力Fig.9 Total reducing power of VC,rutin and Botrychium ternatum extract

3 討論與結(jié)論

小春花自古便為福建草藥[31],福建省立醫(yī)院采用小春花為主要成分制作了小伏口服液應(yīng)用于臨床。最近有研究表明,給予肺動脈高壓SD大鼠(野百合堿所致)模型以小春花總黃酮給藥干預(yù)后,各組肺心病的癥狀均出現(xiàn)緩解[32]。但小春花作為地方性傳統(tǒng)中藥,并未載入新版《中華人民共和國藥典》,其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍需制定,具體活性成分仍需進(jìn)一步解析。本文對小春花中主要成分木犀草素提取進(jìn)行了研究,獲得自小春花中提取天然木犀草素的最佳條件為:超聲時間25 min,液料比25∶1(mL/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲溫度85 ℃。該條件下的木犀草素提取量達(dá)4.88 mg/g,抗氧化試驗結(jié)果表明,小春花提取物具有較強(qiáng)的抗氧化性,可為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

近年來,木犀草素在食物保鮮和功能性食品領(lǐng)域有了新應(yīng)用。在酚醛離子液體中添加木犀草素用以保鮮紅蘋果片,可保留其感官特性和風(fēng)味[33];將從椰子殼中提取所得的木犀草素添加至木瓜切片中,發(fā)現(xiàn)其對食源性致病菌——腸道鏈球菌、單核細(xì)胞增生乳桿菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出顯著的抑制能力[34]。木犀草素通過多光譜進(jìn)行分子結(jié)合形成的復(fù)合物可抑制過氧化物酶活性,防止食物褐變與變質(zhì)[35]。木犀草素也可膠囊化,用于開發(fā)功能性食品,以其為主要成分的“Algonot Neuroprotek”品牌產(chǎn)品具有減輕腸道與大腦屏障受損及抑制氧化應(yīng)激和炎癥等功效,暫無副作用報道[36]。此外,木犀草素還可調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊信號,破壞腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤附著的血管生長,還能減輕癌癥患者化療的副作用[37-38]。木犀草素對其靶細(xì)胞具有特異性、選擇性。有研究表明,木犀草素對突變細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,但不影響其他健康的身體組織,具有較高研究價值。當(dāng)前小春花相關(guān)開發(fā)應(yīng)用仍較少,其對肺部作用的藥理機(jī)制和其中有價值的化合物有待進(jìn)一步挖掘研究。

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