欒永勝 ，劉佳琳 ，劉 萍 ，吳學(xué)麗 ，周 娜 ，欒傳磊

（1.山東省煙臺(tái)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 煙臺(tái) 264000；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所公共技術(shù)中心，山東 煙臺(tái) 264000）

流式細(xì)胞儀是一種用于單個(gè)細(xì)胞多參數(shù)快速分析的先進(jìn)儀器，能對(duì)處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選.檢測(cè)時(shí)，樣品中的懸浮顆粒在鞘液的包被下呈單行排列，依次流經(jīng)檢測(cè)區(qū)域.對(duì)于顆粒非熒光物質(zhì)，在檢測(cè)區(qū)激光束照射在顆粒上時(shí)，由于顆粒大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)等的差異發(fā)出前向角散射光（forward scatter light，F(xiàn)SC）和側(cè)向角散射光（side scatter light，SSC），F(xiàn)SC 與被測(cè)顆粒的直徑密切相關(guān)，基本上可表征顆粒的大小，而SSC 受顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞質(zhì)折射率、細(xì)胞器等）影響重大，反映的是細(xì)胞的復(fù)雜程度.而對(duì)于顆粒熒光物質(zhì)，在激光的激發(fā)下能發(fā)出不同顏色的熒光，這些熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了細(xì)胞顆粒內(nèi)含有相關(guān)熒光物質(zhì)的濃度大小.這些信號(hào)通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)，通過表征這些顆粒不同性質(zhì)的光信號(hào)就可將不同類型的顆粒區(qū)分開[1-2].

由于流式細(xì)胞儀的工作原理是利用激光照射到單個(gè)細(xì)胞上產(chǎn)生信號(hào)的變化來進(jìn)行分析，所以樣品的穩(wěn)定性和均一性能夠直接影響流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)獲取的準(zhǔn)確性.樣品的前處理是獲得理想流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵步驟之一，傳統(tǒng)的前處理方式是選用孔徑是48~74 μm 的尼龍篩網(wǎng)在樣品檢測(cè)之前對(duì)樣品進(jìn)行過濾，但采用傳統(tǒng)方式前處理的樣品上機(jī)檢測(cè)時(shí)，易出現(xiàn)如下問題：（1）流式細(xì)胞儀的“單細(xì)胞”分析特性要求細(xì)胞樣品必須分散成單細(xì)胞狀態(tài).由于篩網(wǎng)難以完全去除樣品中的粘連細(xì)胞，在上機(jī)檢測(cè)過程中粘連細(xì)胞會(huì)造成雙細(xì)胞或多細(xì)胞復(fù)合物“污染”，從而對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析造成誤導(dǎo).（2）由于細(xì)胞樣品自身的細(xì)胞多樣性，容易導(dǎo)致在散點(diǎn)圖中細(xì)胞分布范圍太廣泛，SSC-A（side scatter-area）及FSC-A（forward scatter-area）的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值較大（流式細(xì)胞儀常用CV 值來表示數(shù)據(jù)的可信度.CV 值和標(biāo)準(zhǔn)偏差相關(guān)，代表的是一組數(shù)據(jù)分布的離散程度，數(shù)據(jù)越分散，CV 值越大，數(shù)據(jù)可信度越低.數(shù)值越集中，CV 值就越小，數(shù)據(jù)可信度越高）.尤其在分析海洋貝類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，由于篩網(wǎng)難以有效去除樣品中主流細(xì)胞以外粒徑較大的細(xì)胞，導(dǎo)致散點(diǎn)圖中細(xì)胞“全屏分布”的現(xiàn)象更明顯，因而降低了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性.為了解決上述流式細(xì)胞儀傳統(tǒng)樣品前處理方法的不足，本工作研制了一套基于微流控芯片技術(shù)的流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng).微流控芯片是一種在微米尺度空間內(nèi)對(duì)流體進(jìn)行操控的技術(shù)，它將復(fù)雜的微通道集成于面積很小的芯片上，實(shí)現(xiàn)生物、化學(xué)分析的基本功能.微通道的特征尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，特征尺寸和速度很小，慣性作用可以忽略不計(jì)，但在壓力驅(qū)動(dòng)下可以達(dá)到很高的流速（0.1~1 m/s），慣性效應(yīng)開始顯現(xiàn).雙螺旋微通道利用壓力驅(qū)動(dòng)液體樣品，樣品粒子經(jīng)過彎曲的管道，受到側(cè)向力和迪恩渦粘性阻力的共同作用，在橫截面內(nèi)達(dá)到特定的平衡位置.橫向受力與尺寸相關(guān)，不同尺寸的粒子通過聚集在不同的側(cè)向位置而分離[3-5].該裝置可以實(shí)現(xiàn)對(duì)粒徑小于100 μm 的細(xì)胞或微粒的驅(qū)動(dòng)和分選，無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記處理，分選的細(xì)胞便于后續(xù)流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1 系統(tǒng)的開發(fā)

1.1 流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

所設(shè)計(jì)的流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)基于微流控技術(shù)，根據(jù)不同尺寸細(xì)胞特異的遷移機(jī)制以及影響細(xì)胞聚焦平衡位置的不同因素，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同尺寸細(xì)胞的高通量分選.該系統(tǒng)主要包含微流控分選芯片和樣品驅(qū)動(dòng)模塊兩部分（如圖1 所示），其中微流控分選芯片是整個(gè)系統(tǒng)的核心部件.

圖1 流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)工作示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sample pre-processing system for flow cytometer

系統(tǒng)整體設(shè)計(jì)如下：

（1）將所設(shè)計(jì)的芯片繪制成版圖，通過軟光刻技術(shù)將版圖印制在涂覆有SU-8 光刻膠的硅襯底上，形成制作微流控芯片的陽膜.利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制作微流控芯片.

（2）搭建基于微流控技術(shù)的流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理平臺(tái).如圖1 所示，該平臺(tái)主要包含微流控分選芯片和樣品驅(qū)動(dòng)模塊.其中樣品驅(qū)動(dòng)模塊采用多通道高精度壓力泵來控制樣品流速.

（3）分別選取不同粒徑的聚苯乙烯微球和海洋貝類動(dòng)物血細(xì)胞進(jìn)行分選性能驗(yàn)證試驗(yàn)，以此驗(yàn)證本工作研發(fā)的預(yù)處理系統(tǒng)的可行性.

1.2 微流控分選芯片的設(shè)計(jì)與制作

選擇雙入口螺旋通道來設(shè)計(jì)微流控分選芯片，設(shè)計(jì)圖如圖2（a）所示.微流控分選芯片由直線管道和螺旋管道組成，采用雙入口對(duì)稱管道，由此可以形成雙鞘液包裹樣品流并使樣品流聚焦在直線管道中心位置，減少樣品流進(jìn)入螺旋管道時(shí)的位置偏離.兩個(gè)螺旋轉(zhuǎn)向相反并以S 形通道相連，每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)包含9 圈.共設(shè)有2 個(gè)入口，3 個(gè)出口.雙螺旋微通橫向受力與尺寸相關(guān)，不同尺寸的粒子通過聚集在不同的側(cè)向位置而實(shí)現(xiàn)分離.粒徑小的粒子更靠近通道內(nèi)側(cè)壁面.

圖2 微流控分選芯片的（a）設(shè)計(jì)圖及（b）實(shí)物圖Fig. 2 (a) Design and (b) physical drawings of microfluidic sorting chip

由圖2（b）微流控分選芯片實(shí)物圖可見，芯片由對(duì)稱管道、直線管道和螺旋管道三段構(gòu)成.對(duì)稱管道、直線管道和螺旋管道依次連接.對(duì)稱管道的頂部中間位置連接鞘液入口，底部中間位置連接樣品入口，且和直線管道連通.螺旋管道設(shè)置有三個(gè)出口，三個(gè)出口分別為內(nèi)出口、外出口、中出口.通過多通道壓力泵將鞘液容器中溶液注入鞘液入口，將樣品液容器中溶液注入樣品入口.芯片澆筑3 mm厚度，尺寸是65 mm×65 mm，與1 mm 厚度的載玻片鍵合.芯片管道尺寸寬300 μm，深100 μm，進(jìn)口和出口孔徑為1 mm.

1.3 系統(tǒng)的搭建

流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)主要包含微流控分選芯片和樣品驅(qū)動(dòng)模塊兩部分.樣品驅(qū)動(dòng)模塊采用多通道壓力泵控制樣品流速，樣品的流速對(duì)慣性分選效果影響很大，通過調(diào)節(jié)壓力泵的壓強(qiáng)可以為系統(tǒng)提供穩(wěn)定的樣品驅(qū)動(dòng)速度（如圖3 所示）.

流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)工作流程如圖4所示，鞘液和樣品液通過壓力泵以不同流速分別注入鞘液入口和樣品入口，鞘液經(jīng)對(duì)稱管道形成雙鞘液包裹樣品流進(jìn)入直線通道，因雙鞘液流速和樣品液流速不同，二者在直線管道中形成層流，使樣品流聚焦在直線管道中心位置，減少樣品流進(jìn)入螺旋管道時(shí)的位置差異，樣品進(jìn)入旋轉(zhuǎn)管道后，在迪恩渦流作用下，矩形截面管道中不同大小的粒子在管道內(nèi)外側(cè)的不同位置聚焦，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的分選.

圖4 流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)工作流程圖Fig. 4 Workflow chart of sample pre-processing system for flow cytometer

2 系統(tǒng)驗(yàn)證

2.1 聚苯乙烯微球分選驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證微流控芯片的分選性能以及本工作開發(fā)的預(yù)處理系統(tǒng)平臺(tái)的可行性和合理性，進(jìn)行了不同粒徑尺寸的聚苯乙烯微球分選試驗(yàn).相對(duì)于柔性、多分散的細(xì)胞粒子而言，剛性的聚苯乙烯微球尺寸更加均一，且不會(huì)在剪切應(yīng)力作用下發(fā)生變形，因而其遷移軌跡能更好地反映出流體運(yùn)動(dòng)規(guī)律，進(jìn)而表征芯片的聚焦、分選性能.

本試驗(yàn)采取3 μm 的聚苯乙烯熒光微球，模擬具有相似尺寸的雙殼貝類淋巴血細(xì)胞，即小粒子.采用25 μm 的聚苯乙烯熒光微球模擬粘連細(xì)胞或大粒子雜質(zhì)，即大粒子.將兩種顆粒以體積比1︰1加入去離子水中，制作成混合顆粒懸浮液，使每毫升含有1×105個(gè)顆粒.取1 mL 混合顆粒懸浮液直接于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，剩余混合顆粒懸浮液進(jìn)行微流控芯片的分選性能驗(yàn)證試驗(yàn).

樣品入口壓強(qiáng)設(shè)為9×106Pa，鞘液入口壓強(qiáng)設(shè)為4.5×107Pa，樣品和鞘液分別從樣品入口和鞘液入口注入通道內(nèi).內(nèi)、中、外三個(gè)出口用于收集分選后的樣品.小粒子聚焦于通道內(nèi)側(cè)，最終從內(nèi)出口流出.大粒子聚焦于通道外側(cè)，最終從外出口流出.多余的鞘液從中間出口流出.

將三個(gè)樣品收集管中的樣品分別于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，聚苯乙烯熒光微球混合樣品經(jīng)分選預(yù)處理后，SSC-A 和FSC-A 的CV 值明顯降低，大粒子和小粒子分選效果明顯（表1 所示）.這表明流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)對(duì)不同粒徑聚苯乙烯熒光微球混合樣品分選效果明顯，通過分選預(yù)處理成功分選了粒徑分別為3 μm 和25 μm 的聚苯乙烯熒光微球，增加了流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性.

表1 聚苯乙烯熒光微球混合樣品經(jīng)樣品預(yù)處理分選前后的流式細(xì)胞儀分析變異系數(shù)Table 1 Coefficients of variation (CV) of mixed samples of polystyrene fluorescent microspheres before and after preprocessing by flow cytometer/%

2.2 細(xì)胞分選驗(yàn)證試驗(yàn)

太平洋牡蠣為雙殼貝類，屬于底棲生物、濾食性動(dòng)物，相比于其他海洋生物，更容易蓄積自然界中難以降解的且易于在生物體內(nèi)蓄積的污染物.其受到污染物的脅迫后能激發(fā)免疫防御反應(yīng)，因而常被作為指示生物來進(jìn)行海岸帶環(huán)境毒理學(xué)研究.太平洋牡蠣的血液循環(huán)為開管式循環(huán)，免疫防御依靠細(xì)胞和體液成分介導(dǎo)，由細(xì)胞免疫和體液免疫共同組成免疫防御系統(tǒng)以抵御外界刺激，一般通過借助流式細(xì)胞儀完成對(duì)太平洋牡蠣淋巴血細(xì)胞的分析、分選，進(jìn)而來開展海岸帶環(huán)境毒理學(xué)研究.因此試驗(yàn)選取太平洋牡蠣為試驗(yàn)樣本，抽取其淋巴血細(xì)胞用以驗(yàn)證流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理平臺(tái)的細(xì)胞分選效果.

試驗(yàn)所用太平洋牡蠣均購(gòu)于煙大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，體長(zhǎng)約10 cm.用注射器從外套膜腔中抽取血淋巴細(xì)胞，為防止細(xì)胞聚集，將抽取的血淋巴細(xì)胞迅速與預(yù)冷的等體積抗凝劑1︰1 混合置于50 mL 離心管中，將離心管靜置30 min 后取其上清液用于后續(xù)試驗(yàn).上清液經(jīng)74 μm 篩絹過濾后，取1 mL 直接于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，剩余樣品用于微流控芯片的細(xì)胞分選驗(yàn)證試驗(yàn).

由于牡蠣血液循環(huán)為開管式循環(huán)，獲取的淋巴液樣品里除了粒徑為3.5~4.5 μm 的血淋巴細(xì)胞外，還有卵細(xì)胞等大粒子雜質(zhì).因此血淋巴細(xì)胞小粒子聚焦于通道內(nèi)側(cè)，最終從內(nèi)出口流出.卵細(xì)胞等大粒子聚焦于通道外側(cè)，最終從外出口流出.多余的鞘液從中間出口流出.

將未經(jīng)分選預(yù)處理的樣品以及經(jīng)本系統(tǒng)預(yù)處理的樣品分別在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5 所示.由圖5 可見，經(jīng)分選預(yù)處理系統(tǒng)中內(nèi)出口收集到的血淋巴細(xì)胞分析散點(diǎn)圖相較于未經(jīng)分選預(yù)處理細(xì)胞分析散點(diǎn)圖分散更為集中，這表明本工作研發(fā)的流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)對(duì)牡蠣血淋巴細(xì)胞樣品分選效果明顯，通過分選預(yù)處理成功去除了血淋巴細(xì)胞樣品中的卵細(xì)胞等大粒子雜質(zhì)，使樣品粒徑更加均一.

圖5 （a）未經(jīng)分選預(yù)處理和（b）經(jīng)分選預(yù)處理的樣品的細(xì)胞分析散點(diǎn)圖Fig. 5 Scatterplots of cellular analysis of (a) unsorted pre-treated and (b) sorted pre-treated samples

3 結(jié)論

流式細(xì)胞儀作為一種常見的實(shí)驗(yàn)室儀器，具有強(qiáng)大的細(xì)胞分析分選功能，但一直以來其樣品前處理方法存在不足.本工作考慮了流式細(xì)胞儀對(duì)樣品“均一化”的需求，利用微流控細(xì)胞芯片技術(shù)，研制了一套流式細(xì)胞儀樣品預(yù)處理系統(tǒng)，整個(gè)分選過程無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記處理，分選的細(xì)胞便于后續(xù)流式細(xì)胞儀檢測(cè).通過聚苯乙烯微球和細(xì)胞的分選驗(yàn)證試驗(yàn)，表明了該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同尺寸細(xì)胞的高通量分選，提高了細(xì)胞樣品的穩(wěn)定性和均一性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)流式細(xì)胞儀對(duì)樣品“均一化”的需求，增加了流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性.