周 娜，吳學麗，譚 揚，欒傳磊

（中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003）

連續(xù)流動分析（continuous flow analysis，CFA）技術興起于上世紀50 年代[1]，是傳統比色法（分光光度法）的延伸.相關設備由自動進樣器、蠕動泵、化學反應模塊、比色計和軟件工作站等部件組成，可自動完成進樣、吸液、混勻、顯色、檢測及結果計算等一系列過程[2].相比于分光光度法，CFA 技術擁有自動化程度高、分析速度快（40~100 樣品/小時）、分析精度高、試劑消耗少等突出優(yōu)點[3]，因而在醫(yī)學、環(huán)保、水質、農業(yè)等領域得到了廣泛應用.

建立連續(xù)流動分析技術標準，是推動我國流動分析儀器市場健康發(fā)展的必然需求.近十年來，CFA 技術在我國飛速發(fā)展[4]，相關的國家、行業(yè)、地方標準修訂工作也在持續(xù)進行.針對海洋領域開發(fā)的CFA 技術高達上百項，對分光光度法的替代升級基本完成.相比之下，CFA 技術在農業(yè)中的應用較為局限，目前僅應用于土壤和植物中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的測定[5]，大量關鍵要素的測定仍嚴重依賴低效率的分光光度法，其中又以土壤中總氮測定的局限問題表現最為突出[6-7].

連續(xù)流動分析儀在使用的過程中，需要先將樣品導入連續(xù)流動分析儀內再進行檢測[8].但在使用現有的連續(xù)流動分析儀時，樣品被導入連續(xù)流動分析儀內進行檢測分析時的pH 值難以控制[9]，并且難以保證樣品在被檢測時溫度處于合適區(qū)間.

針對土壤樣品總氮測定過程中的混合不均、分析測試方法原始、人員勞動強度大、工作效率低、分析結果可靠性差等問題，設計了一種新型驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊，該模塊是在德國SEAL 公司生產的AA3 連續(xù)流動分析儀基礎上進行改造.所設計的模塊通過轉軸旋轉帶動加熱棒旋轉，對進入模塊的樣品、試劑和空氣進行攪拌，從而實現充分混合.這一設計有助于加快樣品與試劑的反應速度，避免因混合不夠均勻而影響試劑與樣品的反應效率.同時，利用加熱棒對樣品、試劑和空氣進行攪拌的同時對其進行一定的控溫加熱，使得混合樣品、試劑和空氣保持在合適的溫度區(qū)間內，并且通過對pH 值的實時檢測和調節(jié)，保證酸堿平衡.這為后續(xù)使用連續(xù)流動分析儀對土壤樣品進行總氮檢測分析提供了便利條件，從而提高了連續(xù)流動分析儀對土壤樣品的分析精度.

1 系統總體設計

原AA3 連續(xù)流動分析儀是由自動進樣器、蠕動泵、化學模塊、檢測器和計算機5 大模塊構成.其中化學模塊是將試劑和樣品隨著時間融合發(fā)生化學反應的地方，我們對該模塊進行改進（圖1），加入驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊，可以實現反應pH 的調節(jié)及控溫.

圖1 系統整體設計示意圖Fig. 1 Schematic diagram of overall system

圖2 為不同角度驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊的設計圖.其中，控溫功能的工作流程是：轉軸23旋轉時，進而帶動加熱棒24 旋轉對進入的樣品、試劑和空氣進行攪拌混合，加快樣品與試劑的反應速度，避免樣品與試劑混合不夠均勻.同時，在加熱棒24 旋轉的過程中，利用網狀過濾濾紙20 對混合后的樣品、試劑和空氣中的雜質進行過濾，避免反應后的樣品、試劑和空氣中存在雜質，影響后期連續(xù)流動分析儀樣品分析的準確性.

圖2 （a）~（f）不同角度驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊的設計圖（1）安裝殼，（2）酸溶液箱，（3）第一輸送管，（4）堿溶液箱，（5）第二輸送管，（6）第一連接端口，（7）第二連接端口，（8）支撐板，（9）混合箱，（10）蓋板，（11）固定板，（12）連接桿，（13）開口，（14）第三連接端口，（15）第四連接端口，（16）清潔水箱，（17）驅動馬達，（18）pH 值傳感器，（19）廢液回收箱，（20）網狀過濾濾紙，（21）第三輸送管，（22）第四輸送管，（23）轉軸，（24）加熱棒Fig. 2 (a)~(f) Design drawings of different angles of motor-driven shaft rotation module

調節(jié)pH 的工作流程是：轉軸23 旋轉過程中，還帶動pH 值傳感器18 旋轉，通過pH 值傳感器18對混合后的樣品、試劑和空氣進行pH 值檢測.當pH 值傳感器18 檢測到樣品、試劑和空氣中的混合物pH 值過高時，則啟動第一輸送管3 內的液體泵抽取酸溶液箱2 內的酸性溶液，將酸性溶液導入至混合箱9 內，降低混合后的樣品、試劑和空氣中的pH 值，保持酸堿平衡性.當pH 值傳感器18 檢測到樣品、試劑和空氣中的混合物pH 值過低時，啟動第二輸送管5 內的液體泵抽取堿溶液箱4 內的堿性溶液，將堿性溶液導入至混合箱9 內，增大混合后的樣品、試劑和空氣中的pH 值，保持酸堿平衡性.這樣能夠對混合箱9 內混合后的樣品、試劑和空氣中pH 值進行調節(jié)，保證待測混合物處于中性環(huán)境，提高后期利用連續(xù)流動分析儀對樣品的檢測分析精度.

所設計的驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊連接在德國SEAL 公司生產的AA3 連續(xù)流動分析儀的化學模塊上，系統整體設計示意圖如圖1 所示.

2 系統的測試

系統搭建成功后，實驗人員開展了一系列測試與分析，并從測試的正確度、重復性、再現性、檢出限（LOD）及重現性進行驗證.

2.1 正確度測試

通過采集煙臺市周圍土壤進行總氮的測定，驗證本設計的測試正確度.試驗方法：將0.05 g 土壤干樣和5 mL 濃硫酸在380 ℃進行消解，然后用水溶液定容至100 mL，同時加入不同濃度總氮標準溶液（GSB07-3168-2014）進行加標回收.消解后的樣品經過驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊后通過銅-鎘還原柱還原為亞硝酸鹽，再與磺胺/N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽反應生成紅色絡合物，在波長550 nm 下測定.表1 為總氮標準溶液加標質量濃度分別為50、100、500 mg/L 下的測試結果，以驗證裝載驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊后測試的正確度.由表1 可知，總氮平均回收率在96.8%~107.1%范圍內，符合國家標準“合格評定化學分析方法確認和驗證指南”[10]中關于回收率的要求.說明加入驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊后，試驗正確度良好.

表1 土壤中總氮方法正確度試驗結果Table 1 Results of spiked recovery for determination of total nitrogen in soil

2.2 重復性測試

使用搭載驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊的連續(xù)流動分析儀進行總氮的重復性測試，其試驗結果如表2 所列.在總氮標準溶液加標質量濃度為100 mg/L 添加水平下對實驗室內晾干的土壤樣品平行7 次進行測試，測得總氮的相對標準偏差（RSD）為3.66%，符合國家標準“合格評定化學分析方法確認和驗證指南”要求[10]，說明加入驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊后，試驗重復性良好.

表2 實驗室內總氮測定的相對標準偏差Table 2 Relative standard deviation of total nitrogen determination

2.3 再現性測試

使用帶有驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊的連續(xù)流動分析儀測定總氮的再現性，對質量濃度分別為50、100、500 mg/L 的總氮標準溶液進行測定，試驗結果如表3 所列.進一步對測試結果進行方差分析，項目組間平方和為0.382 222，自由度為2，均方為0.191 111.項目組內平方和為396 185.8，自由度為6，均方為66 030.96.經過計算得出F 值（統計檢定值）等于2.89×10-6，P 值（結果可信程度的一個遞減指標）等于0.999 997，F crit（相應水平下的F 臨界值）等于5.143 253.F 小于F crit，所以3 個質量濃度總氮重復測定數據之間無顯著性差異，說明加入驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊后測定土壤中總氮測定結果具有較好的再現性.

表3 實驗室內總氮測定方法再現性測定結果Table 3 Reproducibility of this method for determination of total nitrogen/(mg/L)

2.4 檢出限及重現性

運用研發(fā)的基于驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊改良的AA3 連續(xù)流動分析儀對土壤中的總氮進行測定.10 次空白試驗總氮測定結果分別為7.8、7.2、6.0、5.6、6.2、5.6、8.2、5.8、7.2、6.0 μg/L.使用公式計算LOD：LOD = 3s/k，k為線性斜率，s為空白樣品檢測值的標準偏差.計算得到使用驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊時測定的總氮LOD 為10.0 μg/L.另外，還使用未安裝所設計模塊的AA3 連續(xù)流動分析儀進行測試，得出10 次空白樣品的總氮質量濃度分別為：13.6、6.5、3.4、17.9、23.3、11.5、10.8、9.6、18.5、10.5 μg/L，經過計算得出未改進儀器的總氮的LOD 為16.4 μg/L.通過對比發(fā)現，所研制的驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊明顯提高了連續(xù)流動分析儀對樣品的分析精度，將土壤中總氮的檢出限從16.4 μg/L 降低至10.0 μg/L.此外，還對方法的重現性進行了探究，取5 組100 μg/L 的總氮標準溶液進行測定，使用裝有所設計模塊的AA3 連續(xù)流動分析儀均表現出相似的信號響應，計算得RSD 為10.1%.該結果充分證明，使用驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊測定，具備良好的重現性.

3 結論

研發(fā)的驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊成功應用于連續(xù)流動分析儀上測定土壤中的總氮.測得的數值符合國家標準“合格評定化學分析方法確認和驗證指南”要求，其正確度和精密度均達到標準.在總氮的分析中，該模塊實現了96.8%~107.1%的平均回收率.實驗室內的總氮測定RSD 為3.66%，表明了良好的重復性.此外，通過3 個濃度總氮的重復測定數據之間的比較，發(fā)現測定結果具有較好的重現性，再現性也得到了驗證.總氮的檢出限為10.0 μg/L，這一結果證明了本模塊設計的合理性和可靠性.所研制的驅動馬達帶動轉軸旋轉模塊提高了連續(xù)流動分析儀對樣品的分析精度，將土壤中總氮的檢出限從16.4 μg/L 降低至10.0 μg/L，實現了目標明確、可操作性強的設計.