萬 玥，劉 影，王 玥，姜博宸，劉明潔，王 璐，關國平

(東華大學 a.紡織學院,b.紡織面料技術教育部重點實驗室, 上海)

人體前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)是維持膝關節(jié)穩(wěn)定的主要韌帶[1]。ACL損傷是常見的運動損傷,尤其在劇烈運動中易發(fā)生挫傷、撕裂或斷裂。ACL損傷后若不及時處理易引發(fā)骨關節(jié)炎,嚴重者會引起半月板撕脫,造成不可逆的損傷[2]。ACL損傷自愈能力較低,臨床上常采用韌帶移植的方式進行修復[3]。常見的韌帶移植包括自體移植物、同種異體移植物以及人工韌帶。自體移植物強度較高、不存在免疫排斥反應,是臨床治療的首選。但是,自體移植物來源有限、易導致供區(qū)炎癥及肌肉萎縮,且移植后出現(xiàn)常見移植物萎縮斷裂等并發(fā)癥[4]。同種異體移植物除了存在著類似的問題,還有隱性疾病傳播風險[5]。

人工韌帶移植是臨床治療韌帶斷裂的有效手段[6]。臨床上曾使用較多的為LARS?人工韌帶,其力學性能優(yōu)良、生物學惰性。然而,由于不可降解性,LARS?人工韌帶植入體內后,常發(fā)生應力遮擋、疲勞松弛、滑膜炎等并發(fā)癥[7-14]。因此,開發(fā)可降解人工韌帶材料成為新的研究方向[4,15-17]。可降解人工韌帶的研究中,材料降解帶來的力學衰減周期與組織再生周期不適配以及材料力學的衰減過快是關鍵的問題。組織再生周期為6～24星期,在該周期內維持人工韌帶的力學性能且能以較好的生物相容性促進自體韌帶生長是人工韌帶的研制目標。絲素纖維來源于天然蠶絲,是一種天然蛋白長絲。它具有優(yōu)良的力學性能、可加工性和生物相容性[18]。Fan等[19]用絲素纖維編織組織工程支架用于ACL修復,植入體內24星期后得到的再生ACL與天然ACL結構類似,且力學性能穩(wěn)定。Zhi等[20]比較了滌綸與絲素纖維人工韌帶材料在ACL重建方面的效果,結果表明絲素纖維人工韌帶材料具有更好的誘導組織生長的效果。吳佳蔚等[21]設計并制備了一種編織基絲素纖維人工韌帶材料,對其在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和酶溶液條件下的體外降解性能進行了研究,發(fā)現(xiàn)在酶降解液中,1星期即出現(xiàn)絮狀物,2星期后質量下降明顯,這表明該絲素纖維人工韌帶的降解速度較快。盡管如此,文獻[22-23]研究發(fā)現(xiàn)絲素纖維人工韌帶材料在動物體內的力學及降解性能仍有待改進。

聚氨酯(polyurethane,PU)是由聚酯或聚醚類聚合物和二異氰酸酯分別作為軟段和硬段的聚酯類聚合物。通過引入可降解的聚醚或聚酯低聚物二元醇可制備降解性聚氨酯。可降解聚氨酯具有良好的生物相容性、彈性和易加工性。通過選擇不同的軟段和硬段,可以調控其降解周期和力學性能[24]。因此,可降解聚氨酯在生物材料方面的研究較廣泛,如人工血管、人造皮膚、骨組織工程、手術縫合線等[25]。羥基磷灰石(hydroxyapatite,Hap)是天然骨組織的主要成分,在人體骨組織中為納米級的針狀結晶體[26]。張海松等[27]研究表明,Hap在體外具有調節(jié)干細胞分化、促細胞黏附及礦化等作用。

因此,本研究以絲素纖維為原材料編織“殼芯”結構的人工韌帶原型材料(artificial ligament, AL),再制備由PU和Hap制成的PU/Hap分散液,對AL的“內芯”和“殼”分別進行涂層,制備了力學性能增強、降解延緩的絲素纖維人工韌帶材料(coated artificial ligaments, CAL),以期滿足動物試驗及臨床應用需求。

1 材料與方法

1.1 AL的設計與制備

ACL是由膠原纖維組成,具有前內側束和后外側束兩個基本功能束,表現(xiàn)為雙束結構。從仿生學角度考慮,模仿ACL結構制備人工韌帶,采用編織結構模擬膠原纖維的取向排列,這種編織結構通過兩條內芯和一層外殼的結構來模擬ACL的雙束結構。

本研究采用脫膠柞蠶絲復絲(遼寧采逸野蠶絲制品有限公司)于24錠編織機上進行編織。先將紗線通過全自動繞紗機卷繞在編織機的錠子上,共卷繞24個錠子。隨后,依次安裝在24錠編織機上,襯入直徑1.2 mm的不銹鋼棒,編織得到“內芯”。將2根“內芯”并在一起后,再在外面編織1層“殼”。最終得到由2根“內芯”和1層“殼”構成的“殼芯”結構AL。AL結構示意圖如圖1所示。

圖1 AL結構示意圖Fig.1 The structure schematic of AL

1.2 CAL的制備

將PU(AR,Sigma-Aldrich,Shanghai)顆粒溶解于DMF(N,N-Dimethylformamide)(AR,Sigma-Aldrich, Shanghai)中,得到質量分數(shù)為10%的混合溶液,并將其置于恒溫磁力攪拌器上以250 r/min的轉速攪拌均勻。將Hap(棒狀,粒徑為60～80 nm,上海麥克林生化科技有限公司)用少量DMF分散,在超聲波機中超聲振蕩15 min以得到均勻的分散液。用注射器將Hap分散液以0.1 mL/s的速率緩慢滴加于PU溶液中,使得Hap與PU的質量比為3∶20,并用磁力攪拌器以250 r/min的轉速攪拌均勻。

在“內芯”內襯入直徑為1.2 mm的不銹鋼棒,用毛刷將制得的PU/Hap分散液均勻涂覆至“內芯”表面。在電熱鼓風干燥箱中烘干,烘干溫度為40 ℃,烘干時間為120 min。取出后在電子天平上稱重,記錄涂層前后的質量。重復以上步驟,共涂覆3次。將涂覆完畢的2根“內芯”作為芯軸,在24錠編織機上編織外殼,再以同樣的方式對外殼涂層3次,制得CAL。CAL的制備流程如圖2所示。

圖2 CAL的制備流程Fig.2 The preparation process of CAL

1.3 表面形貌觀察

使用體視顯微鏡觀察AL和CAL樣品的表面形貌,對于降解過程中的樣品表面形貌,采用掃描電子顯微鏡進行觀察和拍照。

1.4 力學性能測試

樣品長度為5 cm,在自動多功能力學性能測試儀上測試其拉伸性能,包括拉伸斷裂強力和拉伸斷裂伸長率。樣品斷裂強度與彈性模量分別由式(1)和式(2)計算所得。通過彈性回復試驗測試樣品的抗形變能力及維持膝關節(jié)穩(wěn)定性的能力。抗疲勞性通過1 000次周期性拉伸試驗測試,定伸長率為10%。初始隔距為20 mm,拉伸速度為100 mm/min,停留時間為1 s。

(1)

式中：σ為斷裂強度,MPa;F為斷裂強力,N;S為樣品截面積,mm2。

(2)

式中：E為彈性模量,MPa;σ為斷裂強度,MPa;ε為應變,%。

1.5 體外降解

降解試驗的操作均在超凈工作臺中完成,所有耗材及器具均滅菌處理,使用前在超凈工作臺中紫外線照射30 min以上。降解液為PBS(即用型PBS片劑,pH=(7.4±0.2),BBI生命科學有限公司)配制的蛋白酶XIV(Protease type XIV Bacterial From Strepto, P5147-5G,Sigma)溶液,降解溫度為37 ℃,搖床轉速為60 r/min[26]。體外降解14、28、56和84 d后分別取樣,每3 d更換一次降解液。

1.6 細胞相容性

將玻璃片為空白組,試驗分為2組,分別為AL組和CAL組,以比較AL和CAL的細胞相容性。將AL樣品和CAL樣品按照24孔板的孔尺寸裁剪,并在超聲波清洗機中用PBS超聲清洗30 min,常溫干燥后放入24孔板孔中,在酒精缸中酒精熏蒸24 h滅菌。試驗前將樣品在恒溫搖床中37 ℃預熱10 min。

將人皮膚成纖維細胞(HFF-1,中科院細胞庫)以每孔4×104個的數(shù)量種植在每個樣品表面,在溫度為37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2環(huán)境下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的1、4和7 d進行CCK-8試驗(CCK-8試劑盒,500 T,上海翊圣生物科技),并利用式(3)計算細胞增殖率。

(3)

式中：M為細胞增殖率,%;A試驗為不同樣品在450 nm處的吸光度;A空白為空白孔板在450 nm處的吸光度。

通過熒光染色法觀察細胞形態(tài),采用DAPI染色液(50 mL,上海翊圣生物科技)將細胞核染成藍色,用鬼筆環(huán)肽染色液(300 T,上海翊圣生物科技)將細胞骨架染成紅色,使用激光共焦顯微鏡觀察并拍照。

1.7 組織相容性

組織相容性通過大鼠皮下包埋試驗進行評價,試驗分為AL和CAL兩組。每組樣品的每個時間點均采用3只SD大鼠(14～16周齡,上海雷根生物科技有限公司)(n=3),植入后的第14、28、42 d后取出。通過石蠟包埋切片及HE染色來觀察并評價樣品的組織相容性、組織長入材料情況及材料的降解情況。

2 結果與討論

2.1 表面形貌

CAL整體呈淺金黃色,手感柔軟,具有一定的硬挺度。條干均勻,結構規(guī)整,宏觀表面光滑。由圖3可知,AL的平均直徑為(4.82±0.47)mm(n=10),其表面平整,可見毛羽,編織結構較為疏松,孔結構規(guī)則、均勻,保形性良好。

圖3 AL的體視顯微鏡圖像Fig.3 Microscope images of AL

為探究不同涂覆層數(shù)對AL表面毛羽與孔結構的影響,對AL表面進行不同次數(shù)的涂層,其顯微外觀如圖4所示。涂層前的AL表面毛羽及孔結構較為明顯(圖4(a)),涂層后表面變得光滑、孔結構不明顯(圖4(b)～4(c))。經(jīng)過3次涂層后形成的CAL表面緊致、光滑,毛羽服貼,無明顯孔結構存在(圖4(d))。本研究采用PU/Hap涂層的目的在于通過物理包覆的方式隔絕絲素纖維與組織液的接觸,從而延緩及調控材料的降解。隨著降解的延緩,其力學性能衰減也將得到延緩。同時,涂層有望提高AL的起始力學性能。由圖4可見,完整均勻的涂層使得CAL的力學性能有望得到增強,同時延緩其降解速度。

圖4 AL和不同涂層次數(shù)的CAL樣品體視顯微鏡圖像Fig.4 Stereo microscopic images of CAL samples with AL and different number of coating times

2.2 力學性能

2.2.1 拉伸斷裂性能

圖5為CAL與AL的拉伸斷裂強力測試結果,表1為CAL與AL力學性能對比。由圖5和表1可知,涂層對提高AL的力學性能有積極作用。AL的拉伸斷裂強力為435.84 N,CAL的拉伸斷裂強力為491.38 N,提高了12.70%。AL的拉伸斷裂伸長率為(52.00±17.84)%;CAL的拉伸斷裂伸長率為(79.60±11.71)%。說明涂層顯著強化了AL的力學性能。計算可知CAL的拉伸斷裂強度為(62.28±2.54) MPa,高于ACL的拉伸斷裂強度(48.24 MPa)[28]。這是由于涂層的存在增加了纖維之間的抱合力,使得斷裂強度增大。CAL的彈性模量為128.90 MPa,也高于ACL的彈性模量(111.00 MPa)[29]。說明CAL在小應變時即可提供較大的應力,能夠滿足移植早期人體活動對人工韌帶力學性能的要求。涂層后的模量增加,整體力學性能提高,與天然韌帶組織的力學性能較好地吻合[27]。

表1 CAL與AL力學性能對比Table 1 Comparison of mechanical properties of CAL and AL

圖5 CAL與AL的拉伸斷裂強力測試結果Fig.5 Tensile breaking forces results of CAL and AL

2.2.2 彈性回復性能

CAL樣品的單次加載-卸載循環(huán)典型曲線如圖6所示。由圖6的測試結果可知,CAL樣品的彈性回復率為(76.83±1.77)%。與文獻[30]的人工韌帶產(chǎn)品相比,表現(xiàn)出了更優(yōu)異的回彈性。這說明CAL在關節(jié)活動過程中能很好的匹配關節(jié)的屈伸運動,維持膝關節(jié)的穩(wěn)定性。

圖6 CAL的彈性回復性能測試典型曲線Fig.6 Typical curve of elastic recovery performance test of CAL

2.2.3 耐疲勞性能

人工韌帶在植入人體后需要提供較長時間的支撐。Uchio等[31]研究表明,韌帶組織完全再生大約需要2 a的時間。其中,人工韌帶承擔主要力學支撐的時長約為30星期。CAL經(jīng)歷1 000次的加載卸載循環(huán)測試后,其斷裂強度和彈性回復率如圖7所示。CAL的斷裂強度下降了2.89%,彈性模量增加了3.52%。對疲勞測試前后的兩組數(shù)據(jù)進行t檢驗顯示CAL測試前后的力學性能無顯著性差異(P>0.05)。與文獻[32]的數(shù)據(jù)相比發(fā)現(xiàn),CAL的力學性能衰減較小,耐疲勞性更優(yōu),這是由于PU/Hap涂層具有天然優(yōu)異的耐磨及耐疲勞性能。在與AL復合時,PU/Hap涂層包覆在AL最外面并填充了紗線間的孔隙,既承擔了部分拉伸過程中的拉伸力,降低了CAL的力學損耗,又維持了紗線之間的相對位置,減少了紗線之間的摩擦,降低了紗線的磨損,從而使CAL整體的耐疲勞性能得到了提升。

圖7 CAL在1 000次加載卸載循環(huán)測試后的力學性能對比Fig.7 Comparison of mechanical properties of CAL after 1 000 loading and unloading cycles

2.3 體外降解性能

2.3.1 降解過程中的形貌變化

不同降解時間內CAL表面的掃描電鏡照片如圖8所示。在降解初期,CAL的涂層表面完整,PU與Hap形成完整的包覆;降解第2 星期,涂層表面部分位置出現(xiàn)了類似蜂窩狀的結構。隨著降解時間的增加,CAL的涂層表面呈現(xiàn)蜂窩狀結構的區(qū)域擴大,同時可見針狀的Hap再結晶,到第12 星期時,幾乎全部涂層表面區(qū)域都呈現(xiàn)蜂窩狀結構。然而,CAL的芯軸表面直到第12 星期蜂窩狀結構也未出現(xiàn)。由此可見,外殼發(fā)揮了明顯的保護作用,CAL芯軸的降解速率得到了明顯延緩,可以推斷,CAL的降解過程應該是先外殼、后芯軸的,且外殼降解快、芯軸降解慢。這表明本研究設計的“殼芯”結構能達到延緩人工韌帶在體內的降解速度的目的。相應地,CAL的力學性能衰減也將會得到延緩。

圖8 在不同降解時間點CAL的外殼與芯軸的掃描電鏡圖Fig.8 SEM images of the shell and core of CAL at different degradation time

2.3.2 降解過程中的力學衰減

樣品降解過程中的拉伸斷裂強力變化曲線如圖9所示。與AL相比,CAL及芯軸在降解過程中拉伸斷裂強力保持平穩(wěn),說明涂層可以明顯延緩人工韌帶的力學衰減。而AL的拉伸斷裂強力在最初的1 星期內有明顯的下降,在隨后的2 星期內保持平穩(wěn),最后又出現(xiàn)了急速的下降,降解5 星期后,力學性能呈緩慢下降的趨勢。但與芯軸相比,CAL和AL的力學性能始終高于芯軸,證明了“殼芯”結構對人工韌帶力學性能的增強。

圖9 降解不同時間試樣的拉伸斷裂強力變化曲線Fig.9 Curves of tensile breaking forces of samples after varying degradation time

在降解第12 星期,CAL斷裂強度為(48.79±2.64) MPa,與ACL的斷裂強度48.24 MPa相近[28],這說明在12 星期的降解后,CAL仍保持優(yōu)良的力學性能,可為膝關節(jié)提供足夠的力學支撐。分析結果進一步說明,本研究設計的“殼芯”結構及PU/Hap涂層較好地實現(xiàn)了力學性能增強及延緩降解的目標。

2.3.3 降解過程中的質量損失率

CAL、AL和芯軸降解試驗中的質量損失率趨勢如圖10所示。由圖10可知,與AL相比,CAL和芯軸的降解由于涂層的存在而明顯延緩,因此兩者質量損失率顯著低于AL。CAL和芯軸樣品從第1 星期開始出現(xiàn)質量損失,在第2和第6 星期之間,質量損失率增加較快,后趨于平穩(wěn)。該結果與降解過程中的形態(tài)變化規(guī)律和力學性能衰減趨勢相吻合。CAL與芯軸的質量損失率之間無顯著性差異(P>0.05)。降解12 星期后,芯軸的質量損失率為9.45%,CAL質量損失率為8.18%,均低于以往研究中相同條件下的CAL的質量損失率(降解第70 d,質量損失率為28.3%)[33],這說明涂層的存在對人工韌帶材料的降解起到了調控作用。

圖10 不同降解時間樣品的質量損失率Fig.10 Mass loss rates of samples after varying degradation time

2.3.4 降解過程中的結晶度

降解試驗中,不同降解時間樣品的X射線衍射(XRD)結果如圖11所示。結晶度結果如表2所示。絲素蛋白的特征衍射峰位于20.40°和9.60°,而Hap的特征峰一般出現(xiàn)在25.20°和32.00°兩個位置[34]。絲素纖維在降解過程中先降解非結晶區(qū),故結晶度隨降解時間的延長而升高。由圖11可知,CAL芯軸與CAL外殼的結晶峰變化基本一致,CAL芯軸的結晶峰變化較小,外殼位于32.00°的結晶峰變化較大。這說明CAL內部芯軸的降解速率相較于CAL外殼更慢,因為芯軸被外殼包裹,且涂層延緩了絲素纖維與降解液的接觸,從而延緩了材料的降解。以上結果證實了“殼芯”結構對樣品整體降解周期的調控作用,與其他研究結果相一致。

表2 不同降解時間樣品的結晶度

圖11 不同降解時間樣品的XRD結果Fig.11 XRD results of samples after varying degradation time

2.3.5 降解過程中的傅里葉紅外光譜

AL和不同降解天數(shù)的CAL紅外光譜如圖12所示。與AL的紅外圖譜相比,CAL在2 990 cm-1和1 033～1 093 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰,表明PU/Hap涂層的成功上載。觀察CAL的降解,發(fā)現(xiàn)2 990 cm-1附近的亞甲基逐漸減小,表明PU在逐漸降解。從第2 星期開始,3 324 cm-1附近的羥基吸收峰逐漸減弱,到第8 星期時基本消失。這表明第8 星期時,芯軸表面的Hap已全部降解或剝落,因為3 324 cm-1附近的羥基吸收峰歸屬于Hap。同時1 033～1 093 cm-1附近的磷酸基團吸收峰逐漸增強,說明Hap發(fā)生了重結晶,這也與XRD測試中結晶度逐漸增高的結果一致。

圖12 樣品紅外圖譜Fig.12 FTIR results of samples

2.4 細胞相容性

CAL和AL的CCK-8測試結果如圖13所示。由圖13可知,細胞在兩種材料表面均能正常生長,細胞數(shù)量隨培養(yǎng)時間的增加而增加;在分別培養(yǎng)1和4 d時,細胞在CAL表面的活性更高,這可能是由于PU/Hap涂層的表面光滑平整,有利于細胞的黏附鋪展;在培養(yǎng)第7 d時,兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05),且兩者的細胞相對增殖率均高于80%,細胞相容性良好。

圖13 AL和CAL的CCK-8試驗結果Fig.13 CCK-8 results of AL and CAL

不同培養(yǎng)時間CAL和AL的細胞熒光染色照片如圖14所示。由圖14可知,培養(yǎng)7 d后的CAL和AL表面均有較多細胞黏附生長;與AL相比,CAL表面的細胞數(shù)量更多、細胞活性更高;CAL表面的細胞更加鋪展,胞體的突起增多,說明細胞相容性優(yōu)良。

圖14 AL和CAL表面細胞在不同培養(yǎng)時間的熒光染色照片F(xiàn)ig.14 Fluorescent micrographs of cells on AL and CAL after varying culture time

2.5 組織相容性

為進一步考察CAL和AL的體內生物相容性,本研究還開展了CAL和AL樣品的大鼠背部皮下埋植試驗。將AL和CAL樣品分別在植入鼠背部皮下14、28和42 d后取出,進行石蠟包埋切片及H.E.染色,并利用生物顯微鏡觀察并拍照。移植術后大鼠狀態(tài)良好,術后2 d傷口處已基本愈合;4 d后有毛發(fā)長出,縫合處無炎癥癥狀;7 d后傷口愈合良好。

樣品在不同植入時間的組織切片顯微照片如圖15所示。由圖15可知,植入14 d后,2種樣品中均觀察到少量淋巴細胞浸潤,可見疏松結締組織進入材料內部。與CAL相比,AL材料內部的組織長入更明顯、更充分。這可能是由于CAL樣品表面及芯軸表面存在涂層的緣故。在植入28 d后,淋巴浸潤均有所減輕。材料內部的新生結締組織更加明顯、飽滿,CAL樣品中的增加更明顯。而且,新生組織中可見血管新生。植入42 d后,2種材料內部空隙已經(jīng)基本被新生組織填充,可見明顯的血管新生,如圖15紅色方框所示。CAL樣品中可見明顯的2根芯的輪廓,新生組織填充在紗線及纖維之間的空隙中,新生血管豐富。新生組織與材料之間無明顯界限,炎癥細胞基本消失。以上結果表明,CAL的組織相容性良好,不會引發(fā)明顯的炎癥反應。CAL的涂層延緩了材料的體內降解,其多孔結構有利于新生組織的長入。由此可知,本研究開發(fā)的力學性能增強、降解延緩的CAL有望滿足臨床對力學性能及組織再生的要求,這為可降解人工韌帶產(chǎn)品開發(fā)提供了積極參考。

圖15 AL和CAL樣品在不同植入時間的組織切片顯微照片F(xiàn)ig.15 Tissue section micrographs of AL and CAL samples at different implantation times

3 結 語

本研究針對目前人工韌帶產(chǎn)品在臨床應用中存在的問題,旨在開發(fā)一種具有力學性能優(yōu)良、降解性能可控的可降解人工韌帶材料。期望在人工韌帶移植早期,能夠提供充分的力學性能及可控的力學衰減。同時,隨著人工韌帶材料的降解,自體韌帶組織能夠再生。因此,本研究以力學性能及生物相容性良好的絲素纖維為原材料,編織了一種“殼芯”結構的人工韌帶材料。運用PU/Hap溶液對其涂層,實現(xiàn)了力學性能增強及降解延緩的目標。該人工韌帶材料結構規(guī)整、質感接近天然韌帶組織,其力學性能及生物相容性良好,涂層延緩了CAL在體內外的降解。此外,大鼠背部皮下埋植試驗結果表明,炎癥反應輕微,新生組織長入到CAL材料內部。這提示本研究開發(fā)的CAL有望滿足臨床移植和組織原位再生的需求。本研究為開發(fā)新一代人工韌帶產(chǎn)品提供了新的思路。