韓亮亮 趙佳焱 李夢(mèng)媛 董慧峪 楚文海 周 慶 施 鵬 潘 旸**

（1.污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京，210023；2.中國(guó)科學(xué)院飲用水科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085；3.污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海，200092）

飲用水消毒始于20 世紀(jì)初[1]，它能有效殺滅水中的微生物病原體,大大降低了人們因飲水而感染痢疾、霍亂等水傳播疾病而致死的幾率,是人類(lèi)公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一次重大突破.然而，在飲用水消毒工藝中，氯、氯胺等化學(xué)消毒劑可與水源水中的天然有機(jī)物（NOM）反應(yīng)生成消毒副產(chǎn)物（DBPs）[2?4].毒理學(xué)和流行病學(xué)研究已經(jīng)證明，飲用水DBPs 具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性，并且與癌癥、流產(chǎn)和出生缺陷等風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[5?8].盡管研究人員已在飲用水中發(fā)現(xiàn)700 多種DBPs[9]，但已知DBPs 均為分子量小于800 Da 的低分子量DBPs，仍有超過(guò)50%的DBPs 處于未知狀態(tài)[10?11].Kopfler 等[12]通過(guò)超濾實(shí)驗(yàn)證明了高分子量DBPs 的存在，且沙門(mén)氏菌突變?cè)囼?yàn)表明DBPs 中高分子量組分有顯著的致突變作用，從而證實(shí)了高分子量DBPs 的生物毒性.Zhang 等[13?14]研究發(fā)現(xiàn)，高分子量氯代DBPs 的平均分子量約為2000 Da 且分子量分布高度分散.由此可見(jiàn)，高分子量DBPs 是DBPs 的重要組成部分，亟需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步探索.

目前對(duì)飲用水DBPs 的檢測(cè)識(shí)別主要集中于小分子DBPs，而對(duì)單個(gè)高分子量DBPs 的檢測(cè)與識(shí)別還非常缺乏.氣相色譜/質(zhì)譜法（GC/MS）是目前對(duì)于DBPs 常用的檢測(cè)方法，但是GC/MS 不適合鑒定極性/親水/非揮發(fā)性衍生物，尤其不適合鑒定高分子量化合物[15].而液相色譜/質(zhì)譜法（LC/MS）對(duì)無(wú)機(jī)鹽耐受程度低[16]，并且電噴霧電離等電離方式會(huì)產(chǎn)生多電荷離子[17]，這又會(huì)給未知DBPs 的識(shí)別帶來(lái)很大挑戰(zhàn).因此，研究高分子量DBPs 的關(guān)鍵是選擇合適的檢測(cè)方法.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）是測(cè)定高分子量物質(zhì)的摩爾質(zhì)量和摩爾質(zhì)量分布的最有用的分析技術(shù)之一[18?20]，并因其速度快，使用方便，靈敏度高，雜質(zhì)耐受度較高，已被廣泛應(yīng)用在微生物、蛋白質(zhì)、聚合物等大分子物質(zhì)的檢測(cè)領(lǐng)域[21?25].MALDI 是一種比電噴霧電離（ESI）更溫和的電離技術(shù)，幾乎只產(chǎn)生單電荷分子離子，能電離極性分子和非極性分子.MALDI-TOF MS 在分析中能夠保持高分子量化合物的完整[26]，同時(shí)具有高分辨率質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)，具有較高的質(zhì)量精度和分辨率[24].因此MALDI-TOF MS 對(duì)高分子量DBPs 樣品的識(shí)別具有巨大潛力.

MALDI-TOF MS 的檢測(cè)條件（如基質(zhì)、陽(yáng)離子化試劑、沉積方法、激光能量、檢測(cè)模式等）應(yīng)根據(jù)目標(biāo)樣品進(jìn)行選擇[27?28].盡管目前文獻(xiàn)中已有一些樣品制備和檢測(cè)方法，但是由于高分子量DBPs 的結(jié)構(gòu)未知，且分子量分散、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如何針對(duì)其性質(zhì)找到最佳的樣品制備方案和儀器條件仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).因此，篩選合適的基質(zhì)、陽(yáng)離子化試劑、儀器參數(shù)和點(diǎn)靶方法等，是基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 檢測(cè)方法的關(guān)鍵.在沒(méi)有大量精確數(shù)據(jù)的情況下，識(shí)別未知物質(zhì)是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的工作.僅使用低分辨率質(zhì)譜，未知DBPs 可能有許多分子式（分子量在800 Da 以上的化合物則會(huì)有更多可能的分子式），且每個(gè)分子式都有多種可能結(jié)構(gòu).高分辨率質(zhì)譜可以提供精確的質(zhì)荷比（通常是小數(shù)點(diǎn)后3 位或4 位），這大大縮小了分子式的選擇范圍[29].MALDI-TOF MS 作為一種高分辨率質(zhì)譜（HRMS），憑借超高分辨率可以明確地分配每種物質(zhì)的元素組成.MALDI-TOF MS 還可以提供TOF/TOF 串聯(lián)質(zhì)譜，分析碎片離子的組成，從而得到分子的結(jié)構(gòu)信息.因此MALDI-TOF MS 為高分子量DBPs 分子式和結(jié)構(gòu)式的識(shí)別提供了可能.

本研究率先在高分子量DBPs 的檢測(cè)中引入了MALDI-TOF MS，建立了未知高分子量DBPs 的檢測(cè)方法，從檢測(cè)模式、基質(zhì)、激光強(qiáng)度、陽(yáng)離子化試劑、點(diǎn)靶方法等進(jìn)行優(yōu)化，提高了未知高分子量DBPs 的響應(yīng)信噪比（S/N），改善了樣品間測(cè)量的重現(xiàn)性；在檢測(cè)基礎(chǔ)上，通過(guò)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、同位素模式分析、TOF/TOF 串聯(lián)質(zhì)譜提供的結(jié)構(gòu)信息以及SciFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)，建立了高分子量DBPs 的分子式/結(jié)構(gòu)式識(shí)別方法.

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：美國(guó)Bruker Daltonics 公司UltrafleXtreme 基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；美國(guó)FEI 公司Quanta FEG 250 Environmental 掃描電子顯微鏡;美國(guó)Labacoco 公司CentriVap 離心真空濃縮機(jī)；美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司Barnstead Micropure 超純水機(jī).

實(shí)驗(yàn)所用試劑純度均為質(zhì)譜純、色譜純或優(yōu)級(jí)純.超級(jí)2,5-二羥基苯甲酸（Super-DHB，2,5-二羥基苯甲酸和 2-羥基-5-甲氧基苯甲酸的9:1 混合物）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、地蒽酚（DIT）、2,4,6-三羥基苯乙酮（THAP）、芥子酸（SA）、2-（4-羥基苯基偶氮）-苯甲酸（HABA）、3-吲哚丙烯酸（IAA）、可溶性淀粉購(gòu)自Sigma-aldrich 公司.反-2-[3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基-2-亞丙烯基]丙二腈（DCTB）、三氟乙酸鈉（NaTFA）、氯化鉀（KCl）購(gòu)自Tokyo Chemical Industry 公司.三氟乙酸銀（AgTFA）購(gòu)自J&K Scientific 公司.次氯酸鈉（NaClO）儲(chǔ)備溶液購(gòu)自Sigma-aldrich 公司，并通過(guò)DPD 亞鐵滴定法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[30].本研究中使用的其他所有化學(xué)品均從Sigma-Aldrich 公司購(gòu)買(mǎi).

1.2 氯化消毒

為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，本研究選擇淀粉作為模型天然高分子量有機(jī)物，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行消毒.淀粉是分子結(jié)構(gòu)為（C6H10O5）n?H2O 的聚合碳水化合物.淀粉分子式為（C6H10O5）n?H2O，廣泛存在于藻類(lèi)細(xì)胞、細(xì)胞外有機(jī)物中，是自然界中廣泛存在的一種天然有機(jī)物[31?33].淀粉作為常用消毒場(chǎng)景下的模型化合物[31,34?35]，其組成簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)已知，已被廣泛應(yīng)用在MALDI-TOF MS 檢測(cè)中，因此是理想的高分子量DBPs 的前體物.

為驗(yàn)證消毒樣品中高分子量DBPs 的產(chǎn)生，本研究中配制了以下模擬飲用水水源水水樣：向1 L 超純水中加入可溶性淀粉（5 mg·L?1以C 計(jì)）、NaHCO3（90 mg·L?1以CaCO3計(jì)）制備模擬原水樣品.然后，向模擬原水樣品加入2.0 mg·L?1NaClO（以Cl2計(jì)）進(jìn)行氯化，并在20 ℃避光條件下無(wú)頂空接觸24 h.通過(guò) DPD 亞鐵滴定法測(cè)量每個(gè)模擬飲用水樣品中的氯殘留量，并立即用硫代硫酸鈉終止反應(yīng).將未消毒的模擬水樣作為對(duì)照組，超純水作為空白組.3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置3 個(gè)平行樣品.

1.3 水樣預(yù)處理

樣品預(yù)處理對(duì)于解決污染問(wèn)題以及使用MALDI-TOF MS 來(lái)分析復(fù)雜的樣品混合物很有幫助[36?37].首先利用離心真空濃縮機(jī)將1 L 水樣濃縮10 mL，隨后將水樣放入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的透析袋（美國(guó)MYM 公司透析袋；截留分子量為500 Da）中脫鹽.水樣脫鹽程序基于先前的研究[38].脫鹽完成后，使用離心真空濃縮機(jī)對(duì)水樣進(jìn)行再次濃縮至0.5 mL，得到濃縮水樣.

1.4 MALDI-TOF MS 分析

所有質(zhì)譜均使用配備355 nm Nd:YAG 的Bruker Daltonics 公司UltrafleXtreme MALDI-TOF MS 質(zhì)譜儀獲得.分子量檢測(cè)范圍設(shè)置為500—5000 Da，以排除由低質(zhì)量離子產(chǎn)生的高強(qiáng)度信號(hào)，并覆蓋模型化合物整個(gè)質(zhì)量分布范圍，研究質(zhì)量范圍為 800—5000 Da.每個(gè)質(zhì)譜是通過(guò)在樣品的均勻區(qū)域上隨機(jī)獲得的，每個(gè)質(zhì)譜總共有2000 次激光射擊.使用flexAnalysis Version 3.4 質(zhì)譜軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù).

1.4.1 基質(zhì)配制與檢測(cè)器參數(shù)比選的樣品制備

將DHB、THAP、CHCA、DIT、SA、DCTB、HABA 和IAA 分別稱(chēng)重并溶解在TA30（H2O:乙腈=70:30，V/V，含0.1% TFA）中，制成20 mg·mL?1溶液.將陽(yáng)離子化試劑稱(chēng)重并溶解在TA30 中以制備5 mg·mL?1溶液.以濃縮水樣/基質(zhì)/陽(yáng)離子化劑為5/10/1（V/V/V）的混合比制備每一個(gè)質(zhì)譜樣品.然后將3 μL 樣品沉積在MALDI 靶板上，并在環(huán)境條件下干燥，分別進(jìn)行反射-正離子、反射-負(fù)離子、線性-正離子、線性-負(fù)離子4 種檢測(cè)模式的不同激光強(qiáng)度下的檢測(cè).確定基質(zhì)種類(lèi)、檢測(cè)模式以及激光強(qiáng)度后，則進(jìn)一步對(duì)基質(zhì)濃度進(jìn)行優(yōu)化.將不同濃度的基質(zhì)溶液（濃度設(shè)置為0、5、10、20、30、40、50 mg·mL?1），與濃縮樣品、5 mg·mL?1陽(yáng)離子化試劑混合（負(fù)離子模式下不添加陽(yáng)離子化試劑）.進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用干點(diǎn)法[39]點(diǎn)靶，陽(yáng)離子化試劑為5 mg·mL?1NaTFA，檢測(cè)器m/z 范圍設(shè)置為500—5000 Da.

1.4.2 陽(yáng)離子化試劑比選的樣品制備

陽(yáng)離子化試劑的作用則是通過(guò)陽(yáng)離子加合物提高分析物的靈敏度和響應(yīng)強(qiáng)度[18].根據(jù)1.4.1 節(jié)確定的基質(zhì)、激光能量和檢測(cè)模式，使用干點(diǎn)法將濃縮樣品/基質(zhì)/陽(yáng)離子化劑按照5/10/1（V/V/V）分別與NaTFA、KCl 和AgTFA 混合.確定最佳陽(yáng)離子化試劑種類(lèi)后，將最佳陽(yáng)離子化試劑配制為不同濃度的溶液（濃度設(shè)置為0、0.5、1、2、5、10、20、50 mg·mL?1），與濃縮樣品、20 mg·mL?1基質(zhì)溶液混合，干點(diǎn)法制備質(zhì)譜樣品.

1.4.3 不同點(diǎn)靶方法比選的樣品制備

確定基質(zhì)、激光能量、檢測(cè)模式和陽(yáng)離子化試劑后，本研究使用4 種不同的沉積方法，同時(shí)確保等量的分析物和基質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF MS 分析：（1）干點(diǎn)法（混合法），將濃縮水樣和基質(zhì)首先以體積比1:2 混合，然后將3 μL 所得樣品點(diǎn)樣到靶板上，自然風(fēng)干；（2）薄層法（底層法），將2 μL 基質(zhì)施加到靶板上，干燥后將1 μL 濃縮水樣滴加在基質(zhì)上并使其干燥；（3）種子層法，將1 μL 基質(zhì)施加到靶板上，自然風(fēng)干后，將濃縮水樣和基質(zhì)等體積混合的2 μL 樣品點(diǎn)樣到靶板上并讓樣品干燥；（4）三明治法（夾層法），將1 μL 基質(zhì)點(diǎn)樣到靶板上，干燥后，將1 μL 濃縮水樣滴加到基質(zhì)層上并使其干燥，最后將1 μL 基質(zhì)點(diǎn)樣到樣品上.

1.5 掃描電子顯微鏡（SEM）

Quanta FEG 250 Environmental SEM 用于評(píng)估不同點(diǎn)靶方式干燥后樣品的表面分布.SEM 圖像是在高真空（130 Pa）下以200 倍放大倍數(shù)獲得的，電子束以10 kV 電壓和238 μA 電流運(yùn)行.

1.6 高分子量DBPs 的識(shí)別

只在消毒水樣（n=3）中重復(fù)出現(xiàn)、未消毒和空白水樣中不存在的質(zhì)譜出峰視為DBPs.因此，僅根據(jù)存在和不存在而不是出峰的高度差異，來(lái)確定形成的DBPs.根據(jù)高分子量DBPs 的同位素模式，判斷結(jié)構(gòu)中是否存在鹵素（即Cl），從而對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步識(shí)別.對(duì)于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理，使用美國(guó)Bruker Daltonics 公司開(kāi)發(fā)的質(zhì)譜分析軟件flexAnalysis Version 3.4 將特定的分子式分配給質(zhì)譜中高分子量DBPs 的分子離子.分子式計(jì)算需要滿(mǎn)足“氮原則”，元素個(gè)數(shù)約束需要根據(jù)分子量來(lái)確定，質(zhì)量誤差設(shè)為±10×10?6.同時(shí)需要舍棄不切實(shí)際的C、H、O 比例的分子式，只考慮C、H、O＞0、0≤O/C≤1、0≤H/C≤2.5、雙鍵當(dāng)量（DBE）≥0 的分子式[40].軟件計(jì)算進(jìn)行分子式賦值后，隨后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的可能反應(yīng)產(chǎn)物以及SciFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行合理性驗(yàn)證.

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 檢測(cè)方法建立

建立高質(zhì)量和可靠的MALDI-TOF MS 檢測(cè)方法需要考慮許多因素，其中主要影響因素有基質(zhì)（種類(lèi)和濃度）、陽(yáng)離子化試劑（種類(lèi)和濃度）、激光能量、檢測(cè)模式（線性/反射模式，正離子/負(fù)離子模式）以及點(diǎn)靶方式等[41].本研究比較了兩個(gè)參數(shù)來(lái)評(píng)估高分子量DBPs 的出峰效果：信噪比和變異系數(shù)（CV）[42].信噪比反映了質(zhì)譜出峰信號(hào)的強(qiáng)弱，CV 值則反映了結(jié)果的重現(xiàn)性的好壞.兩個(gè)參數(shù)都是根據(jù)消毒水樣中出現(xiàn)的新峰信噪比之和計(jì)算的.

2.1.1 基質(zhì)、檢測(cè)模式和激光強(qiáng)度的確定

基質(zhì)在MALDI 分析中非常重要，因?yàn)樗仁羌す饽芰课談?，也是能量傳輸?shù)墓ぞ?此外，理想的基質(zhì)應(yīng)具有以下特性：在所用波長(zhǎng)處具有高電子吸收、良好的真空穩(wěn)定性、低蒸氣壓以及與分析物的良好互溶性，從而導(dǎo)致均勻的共結(jié)晶[18].CHCA、DHB 和THAP 基質(zhì)已被用于模型化合物淀粉的分析[43?45].SA、DCTB、DIT、HABA 和 IAA 作為常用基質(zhì)也被納入基質(zhì)篩選的范疇.NaTFA 被用作基質(zhì)比選階段的陽(yáng)離子化試劑.表1 顯示了8 種基質(zhì)的檢測(cè)新的DBPs 的結(jié)果.通過(guò)對(duì)消毒前后水樣的逐一比對(duì)發(fā)現(xiàn)，以SA、DCTB、DIT、HABA 和 IAA 為基質(zhì)未檢測(cè)到新峰，表明這些基質(zhì)不適合淀粉的高分子量DBPs 分析，而DHB、CHCA 和THAP 均在反射-正離子模式下檢測(cè)到了高分子量DBPs.以DHB 為基質(zhì)，檢測(cè)模式為反射-正離子模式時(shí)，高分子量DBPs 出峰信噪比遠(yuǎn)高于THAP 和CHCA，并且CV 值更小，結(jié)果重現(xiàn)性更好，因此以DHB 為基質(zhì)，檢測(cè)模式為反射-正離子模式時(shí)，高分子量DBPs 出峰效果最好.圖1 為以DHB 為基質(zhì)，檢測(cè)模式為反射-正離子模式，激光強(qiáng)度設(shè)置為90%時(shí)，模擬水樣消毒前后的全局對(duì)比圖.圖2 為m/z 889.2478、1051.3018、1213.3578、1375.4115 和1537.4675 的5 種高分子量DBPs 出峰情況.

圖1 模擬水樣消毒前后在m/z 500—5000 的質(zhì)譜出峰全局對(duì)比Fig.1 Global comparison of mass spectrometry peaks at m/z 500—5000 before and after disinfection of simulated water samples

圖2 （a）m/z 889.2478;（b）m/z 1051.3018;（c）m/z 1213.3578;（d）m/z 1375.4115;（e）m/z 1537.4675 處的5 種高分子量DBPs 出峰情況Fig.2 Peaks of 5 high molecular weight DBPs at（a）m/z 889.2478;（b）m/z 1051.3018;（c）m/z 1213.3578;（d）m/z 1375.4115;（e）m/z 1537.4675

高分子量DBPs 在負(fù)離子模式下無(wú)法出峰可能是由于高分子量DBPs 去質(zhì)子化（[M-H]-）的能力較弱.此外，DHB 作為基質(zhì)時(shí)，高分子量DBPs 信噪比遠(yuǎn)高于其他基質(zhì).此外，通過(guò)將信噪比的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均信噪比來(lái)計(jì)算它們的CV 值，且使用DHB 基質(zhì)時(shí)，DBPs 信噪比的CV 值更小說(shuō)明共結(jié)晶的均勻性更好，結(jié)果重現(xiàn)性更好.然而這些峰的信噪比不高，信號(hào)重現(xiàn)性較差.因此針對(duì)高分子量DBPs 的MALDI-TOF MS 檢測(cè)方法亟待建立.

激光能量是決定解吸和陽(yáng)離子化樣品數(shù)量的一個(gè)關(guān)鍵因素，激光能量較低時(shí)，響應(yīng)信噪比會(huì)顯著降低或者無(wú)信號(hào)，過(guò)高的能量則可能會(huì)破壞樣品，從而降低信噪比，而激光能量對(duì)信噪比影響的差異可歸因于基質(zhì)性質(zhì)的差異[46?47].因此，本研究在各個(gè)檢測(cè)模式下都進(jìn)行了激光能量?jī)?yōu)化，只有在反射-正離子模式下可以檢測(cè)到高分子量DBPs.各基質(zhì)在反射-正離子檢測(cè)模式下，高分子量DBPs 在不同激光能量下的信噪比如圖3 所示.結(jié)果顯示DHB 作為基質(zhì)，在各激光強(qiáng)度下，高分子量DBPs 的信噪比均高于其他基質(zhì).DHB 作為基質(zhì)的情況下，在激光強(qiáng)度為90%時(shí)信噪比達(dá)到最高.其原因可能是在90%激光強(qiáng)度以下時(shí)，激光能量不足，隨著激光能量增加，電離水平提高，因而產(chǎn)生更高的信噪比峰[41]，超過(guò)90%后，激光能量過(guò)高，在離子飛行過(guò)程中分子離子被破壞，增強(qiáng)了背景峰，從而導(dǎo)致信噪比降低.

圖3 反射-正離子模式下各基質(zhì)在不同激光強(qiáng)度時(shí)的高分子量DBPs 的信噪比Fig.3 Signal-to-noise ratios of high molecular weight DBPs in reflection-positive ion mode for each substrate at different laser intensities

基質(zhì)濃度直接影響基質(zhì)與樣品混合比例，因而可能會(huì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生影響[27,41,48].因此需要確定檢測(cè)高分子量DBPs 的DHB 基質(zhì)的最佳濃度.檢測(cè)模式為反射-正離子模式，激光強(qiáng)度為90%，陽(yáng)離子化試劑為5 mg·mL?1NaTFA，點(diǎn)靶方式為干點(diǎn)法.如圖4 所示，在DHB 濃度從0 增加到50 mg·mL?1，高分子量DBPs 的信噪比先升高，在DHB 濃度為20 mg·mL?1時(shí)，達(dá)到最高信噪比，然后下降.結(jié)果表明，DHB 基質(zhì)的濃度對(duì)高分子量DBPs 響應(yīng)信噪比有明顯的影響，因此，選擇20 mg·mL?1作為合適的DHB 濃度.

圖4 在不同DHB 濃度下的高分子量DBPs 的信噪比Fig.4 Signal-to-noise ratio of high molecular weight DBPs at different DHB concentrations

2.1.2 陽(yáng)離子化試劑的比選

寡糖由于缺乏基本官能團(tuán)及其高度親水性，寡糖在包括MALDI-TOF MS 在內(nèi)的質(zhì)譜分析中電離效率較低，在質(zhì)譜分析中很難形成質(zhì)子化離子，通常需要使用堿金屬離子來(lái)實(shí)現(xiàn)的寡糖的離子化，形成堿金屬締合離子[49?51].本研究測(cè)試了3 種陽(yáng)離子化劑，包括NaTFA、KCl 和AgTFA，用于分析消毒水樣中產(chǎn)生的高分子量DBPs.如圖5（a）和（c）所示，當(dāng)添加NaTFA 或AgTFA 時(shí)，高分子量DBPs 出現(xiàn)在m/z 889、1051、1213、1375 和1537 處.如圖5（b）所示，添加KCl 時(shí)，高分子量DBPs 新增了m/z 905、1067、1229、1391、1553 系列峰（圖中標(biāo)“*”），在這種情況下，m/z 889、1051、1213、1375 和1537 系列峰也能在質(zhì)譜中被明顯觀察到，并且兩個(gè)系列峰m/z 對(duì)應(yīng)相差約16，這與K 和Na 相對(duì)原子質(zhì)量之差相同.這表明m/z 889、1051、1213、1375 和1537 系列峰為加鈉峰，而m/z 905、1067、1229、1391、1553 系列峰為加鉀峰.添加NaTFA 或添加AgTFA 時(shí)，高分子量DBPs 均以[M+Na]+離子的形式出現(xiàn)，并且添加NaTFA 的樣品高分子量DBPs 響應(yīng)信噪比更高，說(shuō)明高分子量DBPs 與銀離子親和力很弱，而易與鈉離子結(jié)合.而添加KCl 時(shí)，高分子量DBPs 則以[M+Na]+和[M+K]+離子的形式出現(xiàn)，質(zhì)譜峰更加復(fù)雜，不利于質(zhì)譜分析.因此，NaTFA 是分析高分子量DBPs 的最佳陽(yáng)離子化試劑.

圖5 （a）AgTFA，（b）KCl 和（c）NaTFA 作為陽(yáng)離子化試劑的質(zhì)譜出峰對(duì)比Fig.5 Comparison of mass spectrometry peaks of（a）AgTFA,（b）KCl and（c）NaTFA as cationization agents

隨后，在反射-正離子模式，激光強(qiáng)度為90%，基質(zhì)為20 mg·mL?1DHB，點(diǎn)靶方式為干點(diǎn)法的條件下，確定了NaTFA 的最佳濃度.如圖6 所示，NaTFA 濃度在0 到2 mg·mL?1范圍內(nèi)，響應(yīng)信噪比迅速增加，然后在超過(guò)2 mg·mL?1后降低.因此，選用了2 mg·mL?1作為NaTFA 的最佳濃度.因?yàn)橄舅畼又锈c離子的存在，所以即使不添加添加劑，仍然有一定強(qiáng)度的加鈉峰.隨著鹽濃度增加，高分子量DBPs 信噪比先增高后降低.這是因?yàn)檩^低濃度下鈉離子對(duì)高分子量DBPs 離子化有促進(jìn)作用，而高濃度的鈉離子又會(huì)使噪聲升高，造成信噪比降低.

圖6 在不同NaTFA 濃度下的高分子量DBPs 的信噪比Fig.6 Signal-to-noise ratio of high molecular weight DBPs at different NaTFA concentrations

2.1.3 點(diǎn)靶方法優(yōu)化

在前面實(shí)驗(yàn)確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，評(píng)估了干點(diǎn)法、薄層法、種子層法、三明治法等4 種沉積方法的響應(yīng)信噪比和結(jié)果重現(xiàn)性.如圖7 所示，在200 倍的掃描電鏡下研究了4 種不同沉積方法下，基質(zhì)與樣品的共結(jié)晶情況.在使用干點(diǎn)法的情況下，觀察到直徑超過(guò)200 μm 的晶體.其他3 種沉積方法的晶體均明顯更小，結(jié)晶更加均勻.在使用三明治法時(shí)，晶體的直徑＜50 μm，至少小了4 倍.使用三明治法的靶板上形成了更薄更均勻的樣品和DHB 的共結(jié)晶層.由于產(chǎn)生更小的晶體有利于提高信號(hào)信噪比和結(jié)果重現(xiàn)性，因此三明治法的共結(jié)晶效果最好.薄層法、種子層法更小晶體的形成可能是由于（1）薄層法、種子層法均有兩次點(diǎn)靶過(guò)程，這使得大晶體可以再溶解和再結(jié)晶，這有利于形成更小的結(jié)晶；（2）此外，第一層基質(zhì)干燥后，可以充當(dāng)?shù)诙訕悠贩肿拥某珊酥行?，增加了溶劑蒸發(fā)的速度，反過(guò)來(lái)阻止了大晶體的生長(zhǎng)，并且這個(gè)過(guò)程使得樣品更好地與基質(zhì)結(jié)合，形成了更均勻分布的晶體層.而三明治法經(jīng)歷了兩次再溶解和再結(jié)晶過(guò)程，加強(qiáng)了上述兩種效果.

圖7 （a）干點(diǎn)法,（b）薄層法,（c）種子層法和（d）三明治法的樣品結(jié)晶在200 倍放大倍數(shù)下的SEM 圖像Fig.7 SEM images of sample crystals with（a）dried droplet method,（b）thin-layered method,（c）seed-layered method,and（d）sandwich method at 200 magnifications

在反射-正離子模式，激光強(qiáng)度為90%，基質(zhì)為20 mg·mL?1DHB，陽(yáng)離子化試劑為2 mg·mL?1NaTFA 條件下，計(jì)算了4 種沉積方法的信噪比和CV 值（n=10）.CV 值越小，數(shù)據(jù)越穩(wěn)定.如圖8 所示，在對(duì)高分子量DBPs 的檢測(cè)中，觀察到4 種沉積方法獲得的響應(yīng)信噪比為：三明治法＞種子層法＞薄層法＞干點(diǎn)法，這表明三明治法獲得了最好的信號(hào)響應(yīng)，采用三明治法有助于提高檢測(cè)方法靈敏度和降低檢測(cè)限；而CV 值則為三明治法＜薄層法＜種子層法＜干點(diǎn)法，這說(shuō)明使用三明治法的樣品，分析物和基質(zhì)共結(jié)晶更好，形成最佳的共結(jié)晶層，獲得了最佳的結(jié)果重現(xiàn)性.因此，對(duì)于高分子量DBPs，使用三明治法5 種高分子量DBPs 信噪比之和達(dá)到了136.2，CV 值則為4.77%，優(yōu)于其他點(diǎn)靶方法.

圖8 不同點(diǎn)靶方式的（a）高分子量DBPs 信噪比和（b）CV 值（n=10）Fig.8 （a）Signal-to-noise ratio and（b）CV values of high molecular weight DBPs for different p deposition methods（n=10）

2.2 基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 識(shí)別方法建立

MALDI-TOF MS 在消毒樣品中發(fā)現(xiàn)m/z 889.2478、1051.3018、1213.3578、1375.4115 和1537.4675共5 種新形成的高分子量DBPs.識(shí)別步驟如下，以m/z 1051 處出峰為例.

2.2.1 同位素模式評(píng)價(jià)

根據(jù)高分子量DBPs 出峰（圖9），其同位素峰與碳同位素出峰情況相符，不符合Cl 的同位素出峰情況.因此可判斷消毒過(guò)程中未發(fā)生鹵素取代反應(yīng)，其分子式中不含Cl.因此分子式分配的元素范圍為12C: 0—100,1H: 1—200,16O: 0—100,23Na: 0—2.

圖9 高分子量DBPs 的同位素模式，以m/z 1051 處出峰為例Fig.9 Isotopic patterns of high molecular weight DBPs,taking the peak at 1051 as an example

2.2.2 MALDI TOF/TOF 串聯(lián)質(zhì)譜的碎片離子分析

以m/z 1051.3018 峰為例，根據(jù)其碎片離子質(zhì)譜圖（圖10），m/z 1051.3018 母離子產(chǎn)生了一系列寡糖碎片離子（以※標(biāo)記的峰），其中m/z 833 碎片離子為五糖結(jié)構(gòu).因此m/z 1051 分子中存在五糖結(jié)構(gòu)，由此可判斷高分子量DBPs 雙鍵當(dāng)量DBE≥5.

圖10 m/z 1051 的碎片離子質(zhì)譜圖，圖中“※”表示寡糖結(jié)構(gòu)Fig.10 Fragment ion mass spectrum of m/z1051.3018,"※" in the figure indicates the oligosaccharide structure

2.2.3 高分子量DBPs 分子式分配

分子式計(jì)算中，設(shè)置質(zhì)量誤差為± 10×10?6，設(shè)置雙鍵當(dāng)量（DBE）≥ 5.若要在地球物理化學(xué)環(huán)境中存在，分子式的C、H、O 比例須滿(mǎn)足：C、H、O ＞ 0、0 ≤ O/C ≤ 1、0 ≤ H/C ≤ 2.5[40].根據(jù)MALDI-TOF MS 提供的精確質(zhì)量1051.3018 以及上述篩選條件，得到分子式計(jì)算結(jié)果如表2 所示.

表2 m/z 1051.3018 的分子式計(jì)算結(jié)果Table 2 The calculation result of the molecular formula of m/z 1051.3018

2.2.4 高分子量DBPs 結(jié)構(gòu)式確定

有文獻(xiàn)報(bào)道，淀粉與次氯酸反應(yīng)過(guò)程中，葡萄糖殘基可被氧化為葡萄糖羧酸，高分子量DBPs 可能為寡糖羧酸或寡糖羧酸鈉[52].因此若消毒過(guò)程與文獻(xiàn)中報(bào)道的反應(yīng)相同，則可認(rèn)為C36H61O32Na 與C36H62O32（C36H61O32Na 的酸）是同種物質(zhì).過(guò)往文獻(xiàn)中報(bào)道的可能產(chǎn)物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖11.

圖11 已報(bào)道的可能產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，R=COOH 或CH2OH[52]Fig.11 Possible product structures have been reported,R=COOH or CH2OH[52]

通過(guò)SciFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證.候選分子式C38H60O32、C40H61O29Na 均未檢索到對(duì)應(yīng)物質(zhì)，而C36H61O32Na（C36H62O32），得到了4 種對(duì)應(yīng)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如圖12 所示.考慮到消毒前體物淀粉的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可排除圖12（c）和（d）結(jié)構(gòu).此外，圖12（a）、（b）結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)中報(bào)道結(jié)構(gòu)（圖11）吻合.因此可確定高分子量DBPs m/z 1051.3018 的結(jié)構(gòu)即為圖12（a）或（b）結(jié)構(gòu).

圖12 C36H62O32 的四種結(jié)構(gòu)式Fig.12 Four structural formulas of C36H62O32

同樣的識(shí)別方法可以得到，5 種高分子量DBPs 分子式分別為C30H51O27Na、C36H61O32Na、C42H71O37Na、C48H81O42Na、C54H91O47Na（表3），并且通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證與以往研究證明5 種新形成的高分子量DBPs 同為羧酸糖類(lèi)物質(zhì)，新產(chǎn)生的高分子量DBPs 的分子量相鄰物質(zhì)質(zhì)量差約為162.1 Da，與己糖殘基質(zhì)量相同，因此可推測(cè)5 種高分子量DBPs 為相差若干個(gè)己糖殘基的同類(lèi)型物質(zhì).

表3 高分子量DBPs 分子式識(shí)別結(jié)果Table 3 Molecular formula identification results of high molecular weight DBPs

在消毒過(guò)程中，淀粉中的還原端糖殘基本身被氧化并開(kāi)環(huán)，消毒模型化合物被氧化為寡糖醛酸或者寡糖羧酸鈉.因此，高分子量DBPs 中未檢測(cè)到含氯分子峰，可能是由于淀粉中糖苷鍵和還原端糖殘基的存在，導(dǎo)致其消毒過(guò)程中更容易發(fā)生糖苷鍵斷鍵、還原端糖殘基開(kāi)環(huán)和羥基-羧基轉(zhuǎn)化，而不易發(fā)生鹵素的取代反應(yīng).

3 結(jié)論（Conclusion）

（1）本研究引入MALDI-TOF MS，構(gòu)建了針對(duì)高分子量DBPs 的檢測(cè)方法，并通過(guò)對(duì)消毒前后水樣的質(zhì)譜出峰逐一比對(duì)，在模擬飲用水中發(fā)現(xiàn)了5 種新的高分子量DBPs.

（2）發(fā)現(xiàn)基質(zhì)、檢測(cè)模式、激光強(qiáng)度、陽(yáng)離子化試劑和點(diǎn)靶方式均能對(duì)高分子量DBPs 信噪比和信號(hào)重現(xiàn)性產(chǎn)生影響.以DHB 為基質(zhì)，NaTFA 為陽(yáng)離子化試劑，三明治法為點(diǎn)靶方法，MALDI-TOF MS 在反射-正離子模式、90%激光強(qiáng)度下，高分子量DBPs 信噪比和信號(hào)重現(xiàn)性達(dá)到最優(yōu)，信噪比達(dá)到136.2，CV 值為4.77%.

（3）通過(guò)高分辨質(zhì)譜提供的精確質(zhì)量和同位素評(píng)價(jià)，TOF/TOF 串聯(lián)質(zhì)譜提供的碎片離子特征以及SciFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，建立了高分子量DBPs 的識(shí)別方法.最終確定5 種高分子量DBPs 為相差若干己糖殘基的寡糖羧酸鈉類(lèi)物質(zhì).

本研究基于MALDI-TOF MS 的高分子量DBPs 檢測(cè)識(shí)別方法可為實(shí)際飲用水中復(fù)雜DBPs 混合物的檢測(cè)與鑒定提供新的技術(shù)支持.