孫苗苗 張大△ 劉亞玲 楊洋

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科 鄭州 450000;2)河南濮陽市人民醫(yī)院 濮陽 457000

神經(jīng)母細胞瘤 (Nuroblastoma, NB)是兒童常見的顱外實體腫瘤,占兒童腫瘤的8%～10%,90%發(fā)生于5歲以下的兒童[1]。NB起源于交感神經(jīng)的神經(jīng)嵴祖細胞[2],其中絕大部分發(fā)生于腎上腺髓質(zhì)或腹部交感神經(jīng)節(jié),小部分發(fā)生于頸部、胸部或盆腔的交感神經(jīng)節(jié)。NB具有生物學(xué)異質(zhì)性,惡性度高,早期易轉(zhuǎn)移[3],并具有自發(fā)消退及體外誘導(dǎo)分化的獨特生物學(xué)特性,尤其在4 S期患兒中較易發(fā)生[4]。目前對NB的發(fā)病機制仍未完全明確。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法,篩選出HOXC9差異基因,并采用Q-PCR法驗證其在腫瘤組織中的表達,為探討NB的發(fā)生、發(fā)展機制和臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2021-01—2023-02在我院小兒外科行手術(shù)的28例NB、8例節(jié)神經(jīng)母細胞瘤(GNB)、6例節(jié)神經(jīng)細胞瘤(GN)患兒的臨床資料和手術(shù)切除標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):初治患兒且在我院行手術(shù)治療。病理結(jié)果經(jīng)組織病理學(xué)證實。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他腫瘤和免疫缺陷病患兒。未經(jīng)系統(tǒng)治療或失訪者。本研究已經(jīng)院倫理委員會審批(倫理號:2023-KY-0697),患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法下載TARGET數(shù)據(jù)庫的NB數(shù)據(jù)及臨床資料,分析NB中不同危險度間差異表達基因(differential expression genes,DEGS);富集分析差異基因參與的基因本體論(Gene ontology,GO)系統(tǒng)和KEGG通路,結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與基因相關(guān)的PPI關(guān)系對,采用K-M法和Log-rank檢驗分析PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因在各個樣本中的表達值與預(yù)后信息之間的關(guān)系[5]。以HOXC9為目的基因,GAPDHA為內(nèi)參基因,采用實時熒光定量PCR SYBR Green I方法檢測腫瘤組織中HOXC9基因mRNA水平表達情況。

1.3 檢測指標(biāo)采用實時熒光定量PCRSYBR Green I方法檢測NB、GNB、GN中HOXC9 mRNA表達水平,分析其表達水平與NB不良預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法將GN組設(shè)為對照組,采用(2-△△Ct 法)將CT值標(biāo)化后,采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組獨立定量資料,采用Kruskal-Wallis檢驗;兩組獨立定量資料,采用Mann-Whitney檢驗。設(shè)定=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析根據(jù)臨床數(shù)據(jù),將樣本分為高、中、低風(fēng)險3組。閾值設(shè)定: P.Val<0.05 &|logFC|>1,篩選出差異表達基因,各組差異基因的數(shù)目如表1。將3組差異基因取并集,得到681個并集基因。見圖1。

圖1 差異基因取并集韋恩圖

表1 差異基因數(shù)目統(tǒng)計

表2 HOXC9在 High vs Medium、High vs Low差異表達情況

將差異基因結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)表達矩陣,使用Stem軟件進行表達趨勢聚類分析,設(shè)置clustering method: STEM Clustering Method, significance level:0.05,得到模塊基因集,見圖2。利用富集分析工具DAVID6.8分析差異基因參與的基因本體論(GO)系統(tǒng)和KEGG通路。設(shè)置顯著性閾值P<0.05且富集個數(shù)(count)至少為2,可見差異基因與信號傳導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細胞分化顯著相關(guān)。

圖3 差異基因的GO和KEGG富集結(jié)果(從上到下依次是High vs Medium、 Medium vs Low、High vs Low,條形長度表示富集基因個數(shù),顏色從藍到紅表示顯著性P.Value值的減小,顯著性更高)

結(jié)合STRING10.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析HOXC9編碼蛋白之間是否存在互作關(guān)系。輸入基因集為所有關(guān)鍵模塊基因,物種為Homo Sapiens。設(shè)置參數(shù)PPI score設(shè)為0.9 (highest confidence),通過將患者按照其表達值的中位值分為高、低表達組,進行K-M生存曲線繪制,同時采用Log-rank檢驗值,篩選出差異基因HOXC9(P<0.05)。生存曲線如圖4。

圖4 HOXC9基因K-M生存曲線圖

圖5 HOXC9的相對表達水平注:A.HOXC9在NB、GNB、GN中的表達采用K-W檢驗,χ2=7.460,P=0.0240。B.HOXC9在NB+GNB、GN間的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=-1.348,P=0.0070。C.HOXC9在不同分期的表達采用K-W檢驗χ2=7.722,P=0.0521。D.HOXC9在不同危險度間的表達采用 K-W檢驗,χ2=12.93,P=0.0016。E.HOXC9在有無MYCN基因擴增的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.5423,P=0.020。F.HOXC9在有無骨轉(zhuǎn)移之間的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.1644,P=0.3853。G.HOXC9在有無骨髓浸潤之間的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.1816,P=0.99。H.HOXC9在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達采用Wilcoxon秩和檢驗,Z=0.6799,P=0.0634。I.確診年齡(月)與HOXC9表達的散點圖,簡單線性回歸,F=22.74,P<0.001,R2=0.3871)

2.2 Q-PCR結(jié)果HOXC9在不同病理類型的腫瘤中,GN組表達水平高,NB組的表達水平低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HOXC9在不同危險度分層中,低危組表達水平高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),HOXC9在有MYCN基因擴增中,有MYCN擴增組表達低(P<0.05)。HOXC9在不同分期、有無骨轉(zhuǎn)移、有無骨髓浸潤及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。繪制確診年齡(月)與HOXC9表達的散點圖,采用簡單線性回歸分析,回歸系數(shù)檢驗P<0.05,回歸方程成立,HOXC9表達水平=-0.01395×確診年齡+1.399,即HOXC9表達水平與確診年齡呈負相關(guān)。

3 討論

HOXC9基因是發(fā)育基因,屬于同源異型盒(Homebox)家族成員。在胚胎發(fā)育時期,在特定的空間位置以時間先后表達或沉默,控制胚胎結(jié)構(gòu)的發(fā)育[6]。研究表明,HOXC9基因除調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育外,也與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[7],參與細胞的增殖、分化、凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生理過程。

國際神經(jīng)母細胞瘤分期系統(tǒng)(international neuroblastoma staging system,INSS)是使用最廣泛的分期方法,根據(jù)確診年齡、分期、組織病理類型、生物學(xué)特征等[8]對疾病危險程度進行分組。但小部分腫瘤可以自發(fā)消退或良性轉(zhuǎn)化。自發(fā)消退是指在極少甚至無系統(tǒng)治療的情況下腫瘤自行縮小乃至消失,良性轉(zhuǎn)化是指腫瘤可由惡性程度高的NB轉(zhuǎn)化為節(jié)GNB[9-10]。研究表明,NB自發(fā)消退可能與年齡[11]、腫瘤部位[12-13]、組織學(xué)特征[14]、分子生物學(xué)基礎(chǔ)等因素有關(guān)。但目前NB自發(fā)消退及良性轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制尚不明確。

本研究中,HOXC9在良性GN中的表達水平高,在惡性NB中的表達水平低,在低危險度分層組的表達水平高。即,HOXC9的表達水平與腫瘤的惡性程度相關(guān),危險度越高,惡性程度越高。HOXC9表達水平越低,細胞分化越差。據(jù)報道,HOXC9可誘導(dǎo)細胞分化并使NB的自我更新能力降低[15],因此HOXC9可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)元分化及控制細胞周期調(diào)控NB自發(fā)消退或良性轉(zhuǎn)化進程。HOXC9在MYCN基因擴增組中表達低,在NB患兒中,22%的患者伴有MYCN基因擴增,或染色體1p32雜合性丟失,伴有這些基因突變的患兒預(yù)后大都較差[16-17];而MYCN基因不擴增的患兒預(yù)后較好。MYCN基因可誘導(dǎo)NB細胞分化,用RA治療后NB細胞的形態(tài)學(xué)分化伴隨著許多HOX基因表達的增加[18],因此HOXC9可能通過調(diào)控MYCN控制NB細胞分化。HOXC9表達水平與確診年齡呈負線性相關(guān),年齡越小,HOXC9表達越高,且患兒確診年齡是NB的獨立危險因素[19],年齡越大提示預(yù)后越不良。年齡是自發(fā)消退或良性轉(zhuǎn)化的影響因素,與HOXC9可能誘導(dǎo)NB細胞分化調(diào)控自發(fā)消退或良性轉(zhuǎn)化進程一致。

本研究中,HOXC9在不同分期、有無骨轉(zhuǎn)移、有無骨髓浸潤,以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能與樣本量太少及選擇偏倚有關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示,HOXC9與腫瘤神經(jīng)元分化、細胞分化相關(guān)。Q-PCR分析HOXC9表達低與差的分期、高的危險度、MYCN擴增相關(guān),提示預(yù)后不良,可能與神經(jīng)母細胞瘤良性分化或自發(fā)消退有關(guān),可為NB診療提供新的依據(jù)。

本研究只進行Q-PCR驗證HOXC9 mRNA水平的表達,收集的臨床數(shù)據(jù)時間較短,缺少生存分析。后續(xù)將進行蛋白質(zhì)水平驗證,進一步探索HOXC9的具體調(diào)控機制。