吳丹丹 許敏敏 劉兆明 梁 靜 馬 引 李 峰 李 娟

（合肥戩谷生物科技有限公司，安徽合肥 230031）

水稻是我國三大主糧之一，水稻穩(wěn)產(chǎn)對我國糧食供應(yīng)和社會穩(wěn)定具有至關(guān)重要的作用。雜草為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的生物逆境之一，與蟲害、病害等共同危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。農(nóng)田雜草的發(fā)生不僅妨礙農(nóng)事操作，而且與作物爭奪土壤養(yǎng)分、光照、水分、空間等資源，滋生病蟲害，嚴重影響了全球糧食作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。除草劑是目前最主要的除草手段，具有高效、經(jīng)濟、省力的優(yōu)點，能有效防控雜草[2]。但是，雜草與農(nóng)作物共同生長在農(nóng)田中，除草劑使用不當(dāng)必然對農(nóng)作物造成一定傷害，極容易導(dǎo)致對除草劑敏感的作物死亡[3]。此外，稻田雜草抗藥性問題日趨嚴重，據(jù)統(tǒng)計，我國每年由雜草引起的水稻產(chǎn)量損失約1000 萬t[4]。因此，創(chuàng)制和利用具有除草劑抗性的水稻品種尤為重要，是降低雜草危害、防治稻田雜草最經(jīng)濟有效的措施。

乙酰輔酶A 羧化酶（ACCase）是催化脂肪酸從頭合成反應(yīng)中第一步的限速酶，在合適的條件下可以催化乙酰輔酶A 生成丙二酰單酰輔酶A[5]，是生物不可缺少的酶。乙酰輔酶A 羧化酶自1958 年被發(fā)現(xiàn)可以作為除草劑的靶標酶之后，得到了廣泛的應(yīng)用。以ACCase 作為靶標的除草劑，造成植物死亡的方式是抑制稗草等禾本科植物體內(nèi)的脂肪酸合成，而對闊葉作物安全無害[6]，且具有高效、低毒、對后茬作物安全等特點[7]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsACC基因某些位點的突變可以賦予其對ACCase 抑制劑類除草劑的抗性，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張保龍團隊通過篩選發(fā)現(xiàn)，水稻OsACC基因第1796、2015、2038、2052、2089、1796、1731、2276 位氨基酸發(fā)生突變，可對高效蓋草能、喹禾靈等除草劑產(chǎn)生抗性[8-10]。Xu 等[11]通過先導(dǎo)編輯方法結(jié)合抗性篩選獲得OsACC基因第2125 位氨基酸突變體。

甲磺酸乙酯（EMS，Ethyl methanesulfonate）作為效果顯著且負面影響小的化學(xué)誘變劑，被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建具有優(yōu)良性狀的水稻突變體[12-14]，在水稻抗除草劑資源創(chuàng)制及篩選中也起到至關(guān)重要的作用。王俊梅等[15]利用輻照和EMS 誘變84 份水稻材料，通過草甘膦的篩選獲得了5 份耐草甘膦水稻遺傳資源。廣東創(chuàng)新科研團隊通過化學(xué)誘變篩選方法研發(fā)出非轉(zhuǎn)基因抗除草劑材料潔田稻[16]。顧佳清等[17]利用EMS 處理粳稻品種中花11，從誘變的水稻群體中篩選出高產(chǎn)的突變體，經(jīng)過后代的純化，得到了可以直接推廣應(yīng)用的水稻突變新品系申化1 號。江群等[18]利用EMS 誘變水稻品種鎮(zhèn)糯19，創(chuàng)制出抗乙酰輔酶A 羧化酶抑制劑類除草劑種質(zhì)。陳天子等[19]以9311 為受體材料，利用EMS 誘變的方法創(chuàng)制出抗咪唑啉酮除草劑種質(zhì)。

本研究通過EMS 誘變水稻種子，然后通過植物組織培養(yǎng)的方法在培養(yǎng)基中添加ACCase 抑制劑類除草劑氟吡甲禾靈對愈傷組織進行篩選，并分化再生獲得了抗性植株，通過測序分析明確其突變類型并移栽大田自交收獲M2種子，之后在正季對M2種子進行大田抗性水平鑒定以及重要農(nóng)藝性狀鑒定，為水稻抗除草劑育種提供了新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑供試水稻材料R1010 由安徽未來種業(yè)有限公司提供，是已審定水稻品種未兩優(yōu)10號的父本，對本研究中所用除草劑高效蓋草能沒有抗性。所用試劑及除草劑相關(guān)信息見表1。

表1 本試驗所用試劑

1.2 水稻種子EMS 誘變、組織培養(yǎng)及抗除草劑突變體篩選取R1010 水稻種子50g，用清水浸泡2h，接著用5mg/mL 的EMS 水溶液浸泡14h，之后再用硫代硫酸鈉中和20min，誘變處理之后在無菌工作臺對種子進行消毒處理。先用75%乙醇消毒90s，用無菌水沖洗干凈之后，再用50%的84 消毒液振蕩消毒30min，用無菌水沖洗干凈接種于不加篩選劑的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并置于28℃培養(yǎng)室恒溫培養(yǎng)。每天保持18h 光照和6h 黑暗。培養(yǎng)20d之后，將長出來的愈傷組織轉(zhuǎn)移至加有除草劑氟吡甲禾靈（0.25g/L）的篩選培養(yǎng)基進行第1 輪抗性篩選，2 周后，將抗性小顆粒轉(zhuǎn)移至加有氟吡甲禾靈（0.5g/L）的篩選培養(yǎng)基進行第2 輪抗性篩選。第2輪抗性篩選2 周后，將篩選出來的抗性愈傷小顆粒轉(zhuǎn)移至加有氟吡甲禾靈（0.25g/L）的愈傷分化培養(yǎng)基，讓抗性愈傷組織再生成抗性植株。

1.3 抗除草劑突變體ACCase 基因的序列分析通過在國家水稻數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫輸入基因號LOC_Os05g22940，獲得ACCase基因的序列，并根據(jù)其保守序列在NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）在線設(shè)計特異性擴增引物，具體引物序列見表2。將再生的抗性單株生根培養(yǎng)，單株標號并取葉片，使用傳統(tǒng)CTAB 法[20]提取基因組DNA 并用已提取的基因組DNA 作為模板，用設(shè)計的引物加上KOD mix 分別擴增基因片段，之后用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測分析，并將條帶正確的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程有限公司進行測序。使用SnapGene 6.0.2 軟件分析測序結(jié)果，分析突變體與野生型的ACCase基因堿基差異并確定產(chǎn)生除草劑抗性的ACCase突變位點。

表2 ACCase 基因擴增引物序列

1.4 抗除草劑突變體的抗性水平鑒定及農(nóng)藝性狀調(diào)查經(jīng)過序列分析將確定突變位點的單株移栽大田并單株收獲得到M2種子，正季在安徽未來種業(yè)有限公司舒城水稻基地進行除草劑抗性水平鑒定試驗，5 月上旬播種，6 月上旬移栽，突變體和野生型材料R1010 分別移栽264 個單株，24 行，11列，行距0.27m，株距0.17m。對突變體和野生型材料R1010 噴施清水和3 個不同濃度的高效蓋草能：2 倍（60mL/667m2），4 倍（120mL/667m2），6 倍（180mL/667m2）。田間肥水使用參照常規(guī)大田管理。分別在除草劑噴施后的第21 天以及黃熟期對突變體及野生型材料R1010 進行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗除草劑突變體篩選用加有除草劑氟吡甲禾靈的培養(yǎng)基對5000 顆水稻愈傷組織進行篩選4 周后，非抗性愈傷組織基本停止生長并褐化甚至死亡，而只有25 顆抗性愈傷組織生長旺盛并長出很多鮮黃色的次生小顆粒。抗性愈傷組織在加有氟吡甲禾靈的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)分化培養(yǎng)，24 顆愈傷組織都褐化并停止生長，只有1 顆愈傷組織再生出新的抗性植株（R1010-W2125C），將抗性植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中直接生根壯苗，見圖1。

圖1 組織培養(yǎng)篩選抗性水稻突變體

2.2 突變體的ACCase 基因序列分析為確定唯一的一株抗性植株的突變位點以及突變類型，使用14 對引物對野生型材料R1010 以及突變體材料的ACCase基因分別進行擴增，都獲得了預(yù)期大小的片段（圖2）。

圖2 R1010 野生型和突變體中OsACC 基因的PCR 擴增結(jié)果

分別以野生型R1010 以及抗除草劑突變體的DNA 為模板擴增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)一代測序分析和比對，發(fā)現(xiàn)與野生型ACCase基因開放閱讀框（ORF）相比，突變體ACCase基因中存在一個點突變，其開放閱讀框的第6375 位堿基由G 突變成C，從而引起編碼的第2125 位氨基酸由色氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔▓D3）。

圖3 R1010 野生型和突變體中OsACC 基因序列的比對結(jié)果

2.3 M2 抗性水平鑒定及農(nóng)藝性狀調(diào)查野生型R1010 與抗除草劑突變體R1010-W2125C在不同濃度高效蓋草能噴施后表現(xiàn)出明顯差異，噴施除草劑3d 之后，野生型植株心葉開始死亡，到3 周左右整個植株逐步枯死，而突變體植株在4 種不同濃度的除草劑高效蓋草能噴施后依然生長旺盛，沒有藥害。

成熟期對野生型空白對照以及抗除草劑突變體進行農(nóng)藝性狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在株高、全生育期、抽穗期、有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實率等農(nóng)藝性狀上野生型空白對照與突變體無顯著差異（表3）。

表3 野生型R1010 及抗除草劑突變體R1010-W2125C 田間噴施不同濃度除草劑后的農(nóng)藝性狀

3 討論

近年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，水稻的生產(chǎn)模式正在發(fā)生巨大變革，水稻直播在生產(chǎn)中越來越普遍，伴隨直播而產(chǎn)生的稻田草害和雜草稻已成為制約水稻生產(chǎn)提質(zhì)增效的關(guān)鍵問題。為了緩解稻田草害問題，抗除草劑水稻新種質(zhì)的創(chuàng)制已成為迫切需求，各大高校和科研院所利用轉(zhuǎn)基因、物理化學(xué)誘變以及基因編輯等技術(shù)手段創(chuàng)制了一系列抗除草劑水稻種質(zhì)，針對的除草劑類型包括草甘膦、草銨膦、咪唑啉酮類等。其中，草甘膦和咪唑啉酮類除草劑抗性水稻種質(zhì)較多，草甘膦抗性水稻種質(zhì)主要依賴轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段，但是目前在我國仍然受到監(jiān)管，在生產(chǎn)應(yīng)用上受到限制?？惯溥蜻惓輨┧痉N質(zhì)多由物理化學(xué)誘變或者自然變異而來，可以推廣應(yīng)用，但是咪唑啉酮類除草劑在土壤中半衰期和殘留期長，過量使用易對后茬作物造成藥害，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[21]。芳氧苯氧丙酸酯類除草劑則兼有高效、低毒、對后茬作物安全等特點，但水稻不抗ACCase抑制劑類除草劑，該類藥物目前多在播種前作為田間封閉劑使用，且該類除草劑靶標位點單一，抗性雜草問題尤為嚴重。

本研究通過EMS 誘變水稻種子，并通過植物組織培養(yǎng)過程對誘變處理后的水稻種子進行愈傷誘導(dǎo)，之后用除草劑氟吡甲禾靈對愈傷組織進行3 次抗性篩選，獲得抗ACCase 抑制劑類除草劑水稻植株，通過對ACCase基因進行測序分析，發(fā)現(xiàn)是由于ACCase基因開放閱讀框的第6375 位堿基由G 突變成C 從而引起編碼的第2125 位氨基酸由色氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，使得ACCase 抑制劑類除草劑不能作用于ACCase 蛋白，因而植株表現(xiàn)出對相應(yīng)除草劑的抗性；后續(xù)通過對突變體M2材料進行抗性鑒定以及農(nóng)藝性狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該突變材料可以抗6倍濃度蓋草能乳油，且生長發(fā)育過程中農(nóng)藝性狀無顯著變化，為水稻機械化生產(chǎn)提供了種質(zhì)基礎(chǔ)。本研究首次使用植物組織培養(yǎng)對抗除草劑突變體進行篩選，不僅減少了大量的田間種植和篩選的工作量，且在一定程度上減少了溫度、天氣、病蟲害等外部條件因素的影響，極大地提高了篩選效率，后續(xù)還需要對該材料進行多濃度精準抗性鑒定，并與母本雜交進行配合力分析，培育抗ACCase 抑制劑類除草劑的水稻新品種。