張朋杰,盧俊文,張憲臣,李勇,黃碧嘉,曾苑嫦,盧柏淇

(中山海關(guān)技術(shù)中心,廣東 中山,528403)

雙酰胺類殺蟲(chóng)劑作為魚(yú)尼汀受體調(diào)節(jié)劑,通過(guò)破壞鈣離子通道影響害蟲(chóng)肌肉收縮,導(dǎo)致行動(dòng)受阻,進(jìn)而使得害蟲(chóng)死亡,具有作用機(jī)理獨(dú)特、殺蟲(chóng)活性強(qiáng)以及殺蟲(chóng)譜廣的特點(diǎn)[1];雙酰胺類農(nóng)藥在土壤中的殘留期較長(zhǎng),移動(dòng)性也較強(qiáng),長(zhǎng)期大量施用可能會(huì)產(chǎn)生富集作用,氟苯蟲(chóng)酰胺及其脫碘代謝物會(huì)對(duì)水生無(wú)脊椎動(dòng)物造成急性和慢性風(fēng)險(xiǎn),威脅到水生食物鏈 (尤其魚(yú)類),硫蟲(chóng)酰胺和環(huán)溴蟲(chóng)酰胺對(duì)魚(yú)類和藻類高毒,該類農(nóng)藥可能對(duì)水生生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅[2];雙酰肼類殺蟲(chóng)劑屬蛻皮激素類似物,主要通過(guò)誘導(dǎo)昆蟲(chóng)提前蛻皮,發(fā)育成熟不完全,抑制其進(jìn)食來(lái)達(dá)到滅殺作用,具有用藥量少、選擇性高等特點(diǎn)[3];甲氧蟲(chóng)酰肼在使用初期被普遍認(rèn)為對(duì)人畜毒性較低且對(duì)環(huán)境安全,在世界范圍內(nèi)被迅速推廣,然而隨著甲氧蟲(chóng)酰肼大量廣泛使用,越來(lái)越多的研究證明其具有殘效期長(zhǎng)、且毒性較高、對(duì)地下水和水生生物具有極高的毒性風(fēng)險(xiǎn)[4]。由于這兩類農(nóng)藥在防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和城市衛(wèi)生害蟲(chóng)上得到廣泛應(yīng)用,這些農(nóng)藥的殘留會(huì)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)的飼料、水體、土壤造成污染,從而在動(dòng)物體內(nèi)積累,進(jìn)一步影響人類的身體健康,因此關(guān)注動(dòng)物產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留很有必要。為保障食品安全各國(guó)對(duì)農(nóng)藥殘留實(shí)施嚴(yán)格的監(jiān)控,如日本肯定列表規(guī)定雞肉中最大殘留甲氧蟲(chóng)酰肼0.01 mg/kg、蟲(chóng)酰肼0.02 mg/kg;歐盟規(guī)定雞肉中氯蟲(chóng)苯甲酰胺、環(huán)丙蟲(chóng)酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、甲氧蟲(chóng)酰肼最大殘留0.01 mg/kg,蟲(chóng)酰肼最大殘留0.02 mg/kg;我國(guó)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定禽肉中最大殘留氯蟲(chóng)苯甲酰胺0.01 mg/kg,溴氰蟲(chóng)酰胺、蟲(chóng)酰肼最大殘留0.02 mg/kg。

當(dāng)前測(cè)定雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥殘留量的方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-13],檢測(cè)以蔬菜、水果、油料為主,僅有少量報(bào)道是關(guān)于動(dòng)物源性食品的[14-15];同時(shí)檢測(cè)雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥的研究報(bào)道較少,目前僅涉及溴蟲(chóng)氟苯雙酰胺、氯氟氰蟲(chóng)酰胺、四唑蟲(chóng)酰胺[16-18]。超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high-resolution mass spectrometry, UPLC-Q-Orbitrap HRMS)具有分辨率高、定性定量能力好的優(yōu)點(diǎn)[19-21],可用目標(biāo)物母離子精確質(zhì)量數(shù)的豐度值直接定量,避免低分辨質(zhì)譜易受基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽(yáng)性的現(xiàn)象,近年來(lái)在檢測(cè)工作中得到快速應(yīng)用。本研究結(jié)合分散凈化技術(shù),用UPLC-Q-Orbitrap HRMS建立同時(shí)測(cè)定雞肉中8種雙酰胺類和5種雙酰肼類農(nóng)藥的殘留分析方法,擴(kuò)大了可同時(shí)檢測(cè)農(nóng)藥的數(shù)量,方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、精確的特點(diǎn),在5、10、50 μg/kg 3個(gè)不同加標(biāo)水平下的平均回收率為90.1%～117.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～8.6%,檢出限為0.2～1.0 μg/kg,可為雞肉中雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥殘留的例行檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(色譜純),Merch公司;無(wú)水硫酸鎂(色譜純),上海麥克林公司;乙酸銨、PSA、C18、石墨化碳黑(graphitized carbon black, GCB)、陶瓷子(長(zhǎng)2 cm×直徑1 cm)、0.22 μm微孔濾膜,上海安譜公司;氯化鈉(分析純),廣州化學(xué)試劑廠。

標(biāo)準(zhǔn)品：溴蟲(chóng)氟苯雙酰胺、氯氟氰蟲(chóng)酰胺、環(huán)丙蟲(chóng)酰胺、四唑蟲(chóng)酰胺、環(huán)蟲(chóng)酰肼(純度≥95%),德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司;氯蟲(chóng)苯甲酰胺、溴氰蟲(chóng)酰胺、氟苯蟲(chóng)酰胺、四氯蟲(chóng)酰胺、甲氧蟲(chóng)酰肼、蟲(chóng)酰肼、抑食肼、呋喃蟲(chóng)酰肼(質(zhì)量濃度1 mg/mL),上海安譜公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取約5 mg(精確至0.01 mg)固體農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈溶解并定容至5 mL,制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,液體標(biāo)準(zhǔn)品直接開(kāi)瓶作為儲(chǔ)備液,于-18 ℃保存。混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈稀釋配成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于-18 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀、UltiMate3000超高效液相色譜,Thermo公司;3-16KL臺(tái)式冷凍離心機(jī)、CP255D電子天平,賽多利斯公司;超純水系統(tǒng),Millipore公司;渦旋振蕩器,IKA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm);流動(dòng)相：乙腈(A)和0.002 mol/L乙酸銨溶液(B);梯度洗脫程序：0～1 min,10% A～40% A,1～8 min,40% A～90% A,8～10 min,保持90% A,10～10.1 min,90% A～10% A;10.1～12 min,保持10% A。流速：0.3 mL/min;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

離子源噴霧電壓為3.2 kV,毛細(xì)管溫度為320 ℃,鞘氣流速為40 L/min,輔助氣流速為10 L/min,輔助氣加熱溫度為350 ℃。掃描模式為Full scan/dd-MS2,采集范圍為100～800 Da,全掃描分辨率為70 000 FWHM,據(jù)依賴子離子掃描分辨率為17 500 FWHM,質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

表1 雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息Table 1 Retention times and mass parameters of diamide and dihydrazide pesticides

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水渦旋振蕩30 s,使樣品充分分散,再加入10 mL 1%(體積分?jǐn)?shù),下同)醋酸乙腈,振蕩提取2 min;加入4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉和1顆陶瓷子立即搖散,振蕩1 min,在4 ℃下以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min;定量吸取3 mL上清液至內(nèi)含450 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg C18和100 mg PSA的離心管中,渦旋混勻1 min;4 200 r/min離心5 min,吸取上清液過(guò)微孔濾膜,上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

與三重四極桿低分辨質(zhì)譜分辨力不足僅能將離子質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后1位、易受m/z近似離子干擾不同,四極桿靜電場(chǎng)軌道阱的高分辨率能夠?qū)㈦x子質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后5位,質(zhì)譜峰寬顯著小于三重四極桿低分辨質(zhì)譜,可區(qū)分相同質(zhì)量數(shù)的不同離子,分辨能力強(qiáng)。高分辨質(zhì)譜的Full scan/dd-MS2掃描模式可每次對(duì)一個(gè)母離子的所有碎片離子進(jìn)行全掃描,監(jiān)測(cè)精度高、圖譜信息全,定性準(zhǔn)確度高,且無(wú)需事先對(duì)目標(biāo)物逐個(gè)確定離子對(duì)和優(yōu)化碰撞能量。對(duì)質(zhì)量濃度為100 ng/mL的雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在m/z100～800內(nèi)用高分辨質(zhì)譜的Full scan/dd-MS2掃描模式進(jìn)行正負(fù)離子掃描,一級(jí)全掃描(full scan)分辨率為70 000 FWHM,數(shù)據(jù)依賴掃描(dd-MS2)分辨率為17 500 FWHM,13種農(nóng)藥母離子精確質(zhì)量數(shù)的實(shí)測(cè)值與理論值誤差均在4.04×10-6范圍內(nèi),質(zhì)量誤差、信號(hào)強(qiáng)度和信噪比詳見(jiàn)表1。以各農(nóng)藥母離子精確質(zhì)量數(shù)建立目標(biāo)列表,當(dāng)一級(jí)全掃描過(guò)程中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)列表中的離子信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)預(yù)設(shè)值時(shí)觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴掃描,獲得二級(jí)碎片全掃描信息。選擇一級(jí)全掃描的母離子作為定量離子,選擇2個(gè)具有代表性的二級(jí)碎片離子作為定性離子。通過(guò)上述質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化和篩選建立包括農(nóng)藥名稱、分子式、離子形式、保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)及特征碎片離子質(zhì)譜掃描數(shù)據(jù)庫(kù),詳見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

選擇3款色譜柱考察對(duì)13種農(nóng)藥的分離效果,Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm)色譜柱的填料具有實(shí)心核和多孔層的特點(diǎn),能夠限制化合物的擴(kuò)散距離,提高分離速度,Waters Atlantis T3 (150 mm×2.1 mm, 3 μm) 色譜柱對(duì)極性化合物保留能力強(qiáng),在水流動(dòng)相中性能穩(wěn)定,低pH條件下色譜柱壽命長(zhǎng),Ultra AQ C18(100 mm×2.1 mm, 3 μm) 色譜柱適合極性大的化合物,其鍵合技術(shù)能夠減弱由于硅羥基封閉不完全而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象。有機(jī)相選擇乙腈,水相選擇水、0.05%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液、0.002 mol/L乙酸銨溶液。結(jié)果表明,低濃度的甲酸、乙酸銨可以有效改善色譜峰的分離度和靈敏度,對(duì)負(fù)離子化合物的響應(yīng)值抑制較小,當(dāng)使用乙腈和0.002 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí),13種農(nóng)藥均可取得較好的響應(yīng)值;在相同的梯度洗脫條件下,同分異構(gòu)體化合物環(huán)蟲(chóng)酰肼、呋喃蟲(chóng)酰胺(m/z395.23292)在Waters Atlantis T3、Agilent Poroshell 120 EC-C18上的分離效果要優(yōu)于Ultra AQ C18,在3款色譜柱上的分離度依次為1.97、1.93、1.31;13種農(nóng)藥中除了四氯蟲(chóng)酰胺、呋喃蟲(chóng)酰肼、抑食肼之外,其他農(nóng)藥在Agilent Poroshell 120 EC-C18上的離子響應(yīng)強(qiáng)度均優(yōu)于Waters Atlantis T3。因此,從分離度和離子響應(yīng)強(qiáng)度綜合考慮,選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18為本研究使用的色譜柱(圖1)。

a-正離子色譜圖;b-負(fù)離子色譜圖圖1 雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥的正、負(fù)離子色譜圖

圖2 不同吸附劑組合對(duì)農(nóng)藥回收率的影響

2.3 提取凈化方法的優(yōu)化

2.3.1 萃取劑的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈、1%甲酸-乙腈、1%醋酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%醋酸-乙腈5種提取溶劑對(duì)雙酰胺類和雙酰肼類化合物的提取效果,添加量為10 μg/kg的空白雞肉樣品分別按照實(shí)驗(yàn)方法處理,13種農(nóng)藥的回收率為：乙腈89.5%～99.2%、1%甲酸-乙腈為85.6%～107.4%、1%醋酸-乙腈為94.3%～106.5%、0.1%甲酸-乙腈為85.7%～96.5%、0.1%醋酸-乙腈為89.7%～102.2%,1%醋酸-乙腈的提取效率總體情況最好,因此采用1%醋酸-乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 水化量的優(yōu)化

由于乙腈具有一定的沉淀蛋白作用,直接加入會(huì)導(dǎo)致雞肉有一定程度結(jié)塊,不利于農(nóng)藥的充分提取,加入一定量的水使其充分分散后再進(jìn)行有機(jī)溶劑提取可提高萃取效率。在10 μg/kg 的添加水平下,在雞肉中分別加入1、3、5、7 mL水,渦旋振蕩30 s,然后分別按照實(shí)驗(yàn)方法處理上機(jī)測(cè)定,通過(guò)回收率對(duì)比以確定適合雞肉的最優(yōu)水化量。結(jié)果表明,加入1 mL水時(shí),四氯蟲(chóng)酰胺的回收率為83.3%,低于其他3種情況;當(dāng)加水量為3、5、7 mL時(shí),結(jié)果差異性并不顯著,13種農(nóng)藥的回收率依次為92.2%～103.9%、92.9%～105.0%、92.1%～103.6%,5 mL的數(shù)據(jù)略微優(yōu)于3 mL和7 mL的數(shù)據(jù),因此研究采取5 mL作為加水量。

2.3.3 萃取鹽包的選擇

萃取鹽包的加入可以起到鹽析、調(diào)節(jié)pH作用,能夠提高萃取的效率,常見(jiàn)的萃取鹽有硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉等,在10 μg/kg 的添加水平下,按照方案1：4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉;方案2：6 g硫酸鎂和2 g氯化鈉;方案3：6 g硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉;方案4：4 g硫酸鎂、1 g 氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉,來(lái)探究適合雞肉的最優(yōu)萃取鹽包組成。結(jié)果表明,在加入鹽包后方案1、3的放熱高于方案2、4;各方案農(nóng)藥的回收率分別是：方案1為96.8%～108.0%、方案2為92.4%～103.8%、方案3為91.3%～102.2%、方案4為89.1%～99.3%,方案1各農(nóng)藥的回收率是4個(gè)方案中最好的,僅有環(huán)蟲(chóng)酰肼、四唑蟲(chóng)酰肼的回收率出現(xiàn)低于其他方案的情況,所以采用方案1作為本研究的萃取鹽包。

2.3.4 凈化條件的優(yōu)化

通過(guò)分散吸附的方式使吸附劑與樣品中的基質(zhì)雜質(zhì)相互作用以達(dá)到凈化效果,常用的吸附劑有PSA、C18、GCB等。PSA常用來(lái)吸附色素、糖和脂肪酸等極性基質(zhì)成分;C18是非極性吸附劑,能夠吸附非極性干擾物,如蛋白、脂質(zhì)物質(zhì)等。研究在除水劑無(wú)水硫酸鎂用量為450 mg時(shí),PSA、C18、GCB不同使用量的凈化效果,設(shè)計(jì)8種吸附劑組合,組合1：100 mg PSA+50 mg C18;組合2：100 mg PSA+100 mg C18;組合3：100 mg PSA+150 mg C18;組合4：50 mg PSA+100 mg C18;組合5：150 mg PSA+100 mg C18;組合6：100 mg PSA+50 mg C18+5 mg GCB;組合7：100 mg PSA+50 mg C18+10 mg GCB;組合8：100 mg PSA+50 mg C18+15 mg GCB,以陰性雞肉樣品加標(biāo)量10 μg/kg考察凈化效果。對(duì)比組合1～5的加標(biāo)回收率,組合1的回收率優(yōu)于其他組合;在組合1的基礎(chǔ)上分別加入5、10、15 mg GCB,凈化后溶液顏色變得更加清澈,但與組合1相比多數(shù)農(nóng)藥的回收率均有所下降,推測(cè)是GCB的平面結(jié)構(gòu)在吸附色素的同時(shí)對(duì)具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的雙酰胺類、雙酰肼類農(nóng)藥也有一定程度的吸附的原因,因此本研究采用450 mg無(wú)水硫酸鎂、100 mg PSA和50 mg C18為最終的凈化劑組合。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限

吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用空白基質(zhì)溶液稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用高分辨質(zhì)譜測(cè)定。以定量離子峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,13種農(nóng)藥的線性范圍和相關(guān)系數(shù)詳見(jiàn)表2。高分辨質(zhì)譜的基線噪音極低,不能用傳統(tǒng)的信噪比計(jì)算檢出限,本文用空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,直至儀器能檢出最低濃度情況下連續(xù)測(cè)試10次,計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),以3s作為方法的檢出限,13種農(nóng)藥的檢出限為0.2 ～1.0 μg/kg,詳見(jiàn)表2。

表2 13種農(nóng)藥的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度(n=6)Table 2 Linear ranges, linear equation, correlation coefficient, LOD, spiked recoveries, and RSD of 13 pesticides(n=6)

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在陰性雞肉樣品中添加5、10、50 μg/kg三個(gè)濃度水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),每個(gè)水平測(cè)試6次,測(cè)得13種農(nóng)藥加標(biāo)平均回收率為90.1%～117.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.2%～8.6%(表2),符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中檢測(cè)方法確認(rèn)技術(shù)要求中關(guān)于回收率、精密度的要求。

2.4.3 實(shí)際樣品測(cè)定

收集市場(chǎng)和超市上不同品種的雞肉20批次,利用本方法進(jìn)行測(cè)定,未檢出雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)色譜質(zhì)譜條件、提取試劑、水化量、萃取鹽包以及凈化劑組成的優(yōu)化,本文建立了一種同時(shí)測(cè)定雞肉中雙酰胺類和雙酰肼類農(nóng)藥的超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜方法,方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高的特點(diǎn),其方法靈敏度、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、準(zhǔn)確度及精密度等均滿足國(guó)內(nèi)外法規(guī)對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求,為雞肉中雙酰胺類、雙酰肼類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供了新方法,為監(jiān)管部門的例行檢測(cè)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供了技術(shù)支撐。