汪晨媛 王珊珊 王賽楠 邵戈 曹佳頤 熊海燕 胡屹

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是最嚴重的肺外結(jié)核,也是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核[1-2]。雖然TBM患者例數(shù)僅占全球結(jié)核病患者例數(shù)的1%,但其病死率可高達30%～40%,且中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥風險較高[3]。

TBM的早期發(fā)現(xiàn)可有效降低病死率和致殘率,阻斷疾病傳播。TBM的臨床表現(xiàn)通常為發(fā)熱、頭痛、易怒、頸部僵硬和嘔吐[4],但這些癥狀往往并不典型。世界衛(wèi)生組織(WHO)和我國已廣泛推廣快速分子檢測方法用于結(jié)核病的篩查和防控[5-6]。但目前常用的快速篩查技術(shù)對于TBM的早期發(fā)現(xiàn)仍有一定不足,而傳統(tǒng)的涂片和培養(yǎng)方法也存在耗時較長、培陽率低等問題。因此,總體上TBM的診斷及時性、準確性有待改善,這也直接影響到患者的疾病進程和臨床治療[7]。此外,部分TBM患者癥狀具有一定隱匿性,存在長期接受不正確治療、病情延誤、反復就醫(yī)等情況,不僅增加患者死亡風險,還可造成更多耐藥菌株的出現(xiàn)和在社區(qū)和醫(yī)院內(nèi)傳播,形成嚴重的社會公共衛(wèi)生風險。TBM患者根據(jù)臨床相關(guān)病例定義分為確診TBM、很可能TBM和可能TBM[5]。除確診TBM患者涂片或培養(yǎng)的結(jié)果明確外,另兩類TBM患者早期發(fā)現(xiàn)往往較難,主要因患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌載量較低。因此,完善TBM的快速篩查技術(shù)具有較高的臨床和公共衛(wèi)生意義,當前亟需完善簡單易行的診斷技術(shù),特別是可用于早期發(fā)現(xiàn)很可能和可能TBM的篩查技術(shù)。

由于TBM患者的血腦屏障通透性增加,其腦脊液成分可能發(fā)生改變[8]。因此,一些特定腦脊液生化和代謝指標可能對于TBM患者的輔助診斷具有一定價值[9],從而提高很可能和可能TBM患者早期篩查技術(shù)的準確性[10]?，F(xiàn)有關(guān)肺外結(jié)核快速篩查的研究主要集中于對各類快速診斷技術(shù)的效果評估[8],如顯微鏡檢查、核酸擴增技術(shù)、γ-干擾素釋放試驗等,但尚缺乏考慮生化指標輔助快速篩查的相關(guān)文獻報告。本研究針對多地TBM疑似患者,回顧性收集患者資料,通過代謝組學分析,篩選差異代謝物質(zhì),結(jié)合多指標提高疾病的診斷準確性,有助于及早發(fā)現(xiàn)患者,采取早期針對性治療和防控措施,降低患者的死亡率、致殘率及控制結(jié)核病的進一步傳播。

對象和方法

一、研究對象

采用回顧性研究方法,利用2011—2019年在江蘇省蘇州市、四川省自貢市和貴州省貴陽市的結(jié)核病定點醫(yī)療機構(gòu)數(shù)據(jù)實施。收集研究期間上述定點機構(gòu)登記的21 736例結(jié)核病患者,其中有1種或多種臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、頭痛、煩躁、嘔吐、頸部僵硬、意識改變、嗜睡或局部神經(jīng)損傷)的疑似TBM患者共521例。根據(jù)納入排除標準,排除127例入院時無明確診斷的患者、9例有嚴重凝血功能障礙的患者和2例妊娠期患者,最終共納入383例研究對象。

根據(jù)臨床相關(guān)病例定義[5],在383例研究對象中隨機抽取100例臨床診斷TBM患者(包括69例確診TBM患者和31例很可能或可能TBM患者;TBM組),并按年齡、性別1∶1配對抽取100例非TBM患者(包括病毒性腦膜炎32例、細菌性腦膜炎33例和隱球菌性腦膜炎35例;非TBM組)為對照,共計200例。篩選流程見圖1。

注 TBM:結(jié)核性胸膜炎

二、納入和排除標準

1.納入標準:(1)患者初診疑似TBM;(2)HIV陰性;(3)知情同意。

2.排除標準:(1)入院時無明確診斷;(2)有嚴重的凝血功能障礙;(3)有明顯的腰椎穿刺禁忌證;(4)妊娠。

根據(jù)臨床相關(guān)病例定義[5],本研究將TBM的診斷分類確定如下:(1)確診TBM(69例):為獲得結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)微生物學或核酸擴增試驗陽性證據(jù);(2)很可能TBM(9例):為缺乏顱內(nèi)病原學診斷依據(jù)下,臨床上出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、易激惹、腦膜刺激征、抽搐、局灶性神經(jīng)損傷、意識狀態(tài)改變中的1項或多項表現(xiàn),診斷評分≥12分(有腦影像學檢查)或≥10分(無腦影像學檢查),腦影像學或腦脊液至少2分;(3)可能TBM(22例):診斷評分為6～11分(有腦影像學資料)或6～9分(無腦影像學資料);(4)非TBM(100例):未被診斷為上述幾類TBM的患者,經(jīng)其他非結(jié)核源性病原體檢測,確定為非結(jié)核性腦膜炎。

三、研究設(shè)計

對所有納入對象開始抗結(jié)核治療前,采集腦脊液樣本-80 ℃凍存,分別進行生化檢測和GeneXpert MTB/RIF檢測。檢測腦脊液白細胞計數(shù)、乳酸、蛋白總量、腺苷脫氨酶、葡萄糖等生化指標。生化檢測均按照標準檢驗流程操作,并進行質(zhì)量控制。對患者腦脊液樣本以高效液相色譜法分離代謝物并檢測。高效液相色譜由研究者統(tǒng)一送檢,且檢測過程設(shè)置質(zhì)控樣本。將200例研究對象數(shù)據(jù)作為訓練集,在此200例之外的183例納入對象中隨機抽取30例作為驗證集。以非TBM組為對照,在訓練集中通過機器學習方法篩選出具有潛在診斷價值的生化指標或代謝物指標,并對這些指標對于TBM的快速識別效能在驗證集中進行評估。本研究已獲得復旦大學公共衛(wèi)生倫理委員會批準(IRB#2015-11-0568)。所有研究對象均知情同意。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料呈偏態(tài)分布,以“中位數(shù)(四分位數(shù))M(Q1,Q3)”描述,組間差異的比較采用Mann-WhitneyU檢驗;計數(shù)資料以“構(gòu)成比/百分率(%)”描述,組間差異的比較采用卡方檢驗。使用SIMCA軟件,運用偏正交最小二乘判別法分析(OPLS-DA)計算各代謝物質(zhì)液相色譜峰面積在兩組間的差異,通過獨立樣本非參數(shù)檢驗、OPLS-DA模型變量權(quán)重(variable important in projection)和代謝物組間表達量的差異倍數(shù)(fold change)進行判別分析,獲取可靠的代謝物組間差異。根據(jù)受試者工作特征曲線計算上述代謝物水平,用于以臨床病例定義為參考標準的各類型TBM檢測的敏感度和特異度及約登指數(shù)。

進一步使用Salford Predictive Modeler v8.0軟件導入生化指標(腦脊液白細胞計數(shù)、乳酸、蛋白總量、腺苷脫氨酶、葡萄糖)和上一步篩選的代謝物指標進行機器學習,構(gòu)建決策樹模型(Boosted-CART),明確潛在篩查指標及其cut-off值。為抑制過擬合,對boosted-CART進行剪枝形成以主要指標變量為分枝節(jié)點、指標取值能較好區(qū)分TBM樣本和非TBM患者樣本的最終模型[11]。根據(jù)模型中的指標取值,通過AUC評估特定生化和代謝物指標對于很可能和可能TBM的檢出效果。提升效果指標驗證公式如下:

其中,Z:統(tǒng)計檢驗值;SE:標準誤;AUC:曲線下面積;NORMSDIST:返回標準正態(tài)累積分布函數(shù)。

結(jié) 果

一、一般特征

200例納入的研究對象中,共有100例臨床診斷TBM患者(TBM組)和100例非TBM患者(非TBM組)。TBM組和非TBM組在性別、年齡、地區(qū)分布的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05),見表1。

表1 研究對象的一般特征

二、特征代謝物篩選

根據(jù)模型得分散點圖判斷,兩組樣本組間差距大,組內(nèi)重復性較好,區(qū)分明顯。模型經(jīng)隨機置換檢驗可知,能夠較好解釋兩組樣本之間的差異,且具有良好的穩(wěn)健性,不存在過擬合。

經(jīng)過檢測,最終獲得95個TBM腦脊液代謝物結(jié)果,98個非TBM腦脊液代謝物結(jié)果,共計193個腦脊液代謝物結(jié)果。在SIMCA軟件中分析代謝物結(jié)果的出峰面積,經(jīng)OPLS-DA,共篩選出6種代謝物(L-異亮氨酸、β-丙氨酸、L-谷氨酰胺、黃嘌呤、D-丙氨酸、L-賴氨酸)在TBM患者的腦脊液中呈上調(diào)趨勢,含量高于非TBM組(圖2,3),差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001),且AUC值均在0.7～0.9之間,見表2。

表2 結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液代謝差異物質(zhì)檢出表現(xiàn)

注 0:非結(jié)核性胸膜炎組;1:結(jié)核性胸膜炎組;紅色表示該物質(zhì)表達較高,藍色表示該物質(zhì)表達較低

注 0:非結(jié)核性胸膜炎組;1:結(jié)核性胸膜炎組;紅色表示該物質(zhì)表達較高,藍色表示該物質(zhì)表達較低

三、提高敏感度的指標篩選及篩查表現(xiàn)

將訓練集對象的生化指標和6種代謝差異物(L-異亮氨酸、β-丙氨酸、L-谷氨酰胺、黃嘌呤、D-丙氨酸、L-賴氨酸)指標導入機器學習boosted-CART模型。最終生成的樹狀模型中,代謝物指標中的L-谷氨酰胺和生化指標中的腦脊液葡萄糖被選擇為特征指標,其cut-off值分別為607.06 mmol/L(L-谷氨酰胺)和60.03 mg/dl(葡萄糖),見圖4。

圖4 boosted-CART模型選擇特征指標及其cut-off值

在驗證集30例患者中,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L可識別出9例(50.0%)TBM,AUC值為0.750(95%CI:0.577～0.923)。L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和腦脊液葡萄糖>60.03 mg/dl聯(lián)用可識別出10例(55.6%)TBM,AUC值為0.778(95%CI:0.612～0.943),但相較于L-谷氨酰胺提升不明顯(Z=0.230,P>0.05)。對于確診的TBM患者,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L可識別出5例(41.7%)TBM,AUC值為0.917(95%CI:0.734～1.000)。L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和腦脊液葡萄糖>60.03 mg/dl聯(lián)用并不能識別出更多的患者。對于很可能和可能TBM患者,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L可識別出4例(66.7%)TBM,AUC值為0.667(95%CI:0.444～0.889)。L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和腦脊液葡萄糖>60.03 mg/dl聯(lián)用可識別出5例(83.3%)TBM,AUC值為0.708(95%CI:0.494～0.923),但相較于L-谷氨酰胺提升不明顯(Z=0.261,P>0.05)。具體見表3。

表3 L-谷氨酰胺和腦脊液葡萄糖用于篩查結(jié)核性腦膜炎的表現(xiàn)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn),葡萄糖和L-谷氨酰胺聯(lián)用可明顯提高TBM檢出的敏感度,有利于快速識別潛在患者,特別是既往難以發(fā)現(xiàn)的很可能和可能TBM患者,以利于早診早治、改善預后和控制結(jié)核病(特別是耐藥菌株)在社區(qū)和醫(yī)院內(nèi)進一步傳播。

高葡萄糖和高L-谷氨酰胺等生化和代謝物指標的變化可能與TBM的進展與代謝改變有關(guān)。持續(xù)代謝紊亂的后果是葡萄糖代謝失控,快速使用葡萄糖導致糖酵解增加,表明存在較高的能量需求。在受影響的腦細胞中,存在從有氧代謝到無氧代謝的轉(zhuǎn)變[12]?；颊吣X脊液中,結(jié)核分枝桿菌的生長需要更多葡萄糖來應對能量消耗[13],可能使初期腦脊液葡萄糖水平明顯升高。此外,神經(jīng)系統(tǒng)免疫細胞在對抗結(jié)核分枝桿菌感染的過程中被大量激活,從而需要更高的腦脊液葡萄糖水平以支持其活動[14]。但隨著疾病發(fā)展,患者腦脊液葡萄糖含量逐步降低,最終甚至低于一般水平。

罹患TBM會對患者氨基酸代謝產(chǎn)生較大影響,故關(guān)注腦脊液中氨基酸代謝過程的改變情況,可以在一定程度上提示腦部病變的可能。TBM患者腦脊液谷氨酰胺的升高可能來源于谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)遭到破壞,此過程可能因星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元轉(zhuǎn)運體功能的降低導致[14],提示炎癥對中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在影響。另一種可能的機制是,血腦屏障功能降低或改變導致血腦屏障通透性改變,如谷氨酸通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體[15]和改變腦內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白的表達來誘導血腦屏障通透性變化[16]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),通過L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L和腦脊液葡萄糖>60.03 mg/dl可識別更多潛在的TBM患者。前期已有研究指出,腦脊液葡萄糖對于TBM的輔助診斷有一定的指示作用[17]。南非一項研究采用>33 mg/dl的腦脊液葡萄糖水平,診斷敏感度達到91.49%[14]。本研究中,對于很可能和可能TBM患者,L-谷氨酰胺>607.06 mmol/L聯(lián)用高于60.03 mg/dl腦脊液葡萄糖水平可將敏感度大幅提高至83.3%,顯示出更好的篩查效果。通過本研究發(fā)現(xiàn)的生化和代謝物等檢測,可在檢測復雜度和成本均可接受的前提下,大幅提高TBM,特別是既往較難發(fā)現(xiàn)的很可能和可能TBM的篩查敏感度,改善診斷的時效性和準確性,也有利于快速鑒別診斷TBM患者并開展早期治療和隔離管控措施,具有較好的可操作性、臨床價值和公共衛(wèi)生意義。

綜上所述,腦脊液葡萄糖和L-谷氨酰胺都在不同程度上提高了TBM的檢出敏感度,尤其對于傳統(tǒng)診斷方法難以發(fā)現(xiàn)的早期病例,兩者聯(lián)用能進一步提高TBM的敏感度,雖提升不夠明顯(P>0.05),但相較于傳統(tǒng)診斷方法10%～60%的敏感度[18],兩者都具有一定優(yōu)勢。本研究旨在通過提高TBM早期發(fā)現(xiàn)和檢出,降低疾病的致死率和致殘率。隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展,未來可將這些生化和代謝物指標納入更先進的診斷平臺,以提高檢測的敏感度和特異度。此外,進一步的研究應探討這些生化指標與TBM病理生理過程的關(guān)系,以深入了解疾病機制。

本研究存在一定局限性。若考慮個體遺傳背景、環(huán)境因素和疾病嚴重程度,則本研究結(jié)論的外推需要納入更多患者及不同疾病階段患者。另外,本研究對照組為非TBM患者,故研究結(jié)果僅適用于鑒別診斷,不適用于一般人群篩查。此外,本研究暫未考慮可能造成腦脊液葡萄糖改變的其他潛在因素,以及患者感染特征、就診時間和共病情況等的影響。未來應擴大樣本量,特別是不同疾病階段的患者,以增強結(jié)論的代表性和外推性。進一步研究疾病機制,了解影響腦脊液代謝物的其他潛在因素。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻汪晨媛:論文構(gòu)思、方法驗證、形式分析、初稿寫作、可視化呈現(xiàn);王珊珊:審核與編輯寫作;王賽楠和邵戈:可視化呈現(xiàn);曹佳頤和熊海燕:項目管理;胡屹:數(shù)據(jù)管理、項目管理、審核與編輯寫作