張俊飛，郭 莉，騫愛(ài)榮，黃勇平，張 舒，張 茹

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，陜西 西安710032；2空軍第九八六醫(yī)院第三門(mén)診部，陜西 西安 710068；3西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072；4中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所，昆蟲(chóng)發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

空間微重力環(huán)境對(duì)航天員身體健康造成嚴(yán)重的威脅[1-3]。家蠶胚胎被認(rèn)為是探索空間生命科學(xué)的理想材料，因?yàn)樗哂畜w積小、繁殖率高、遺傳背景清晰、胚胎期生命活動(dòng)活躍等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空間環(huán)境對(duì)家蠶的孵化和發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生了顯著影響。例如，美國(guó)亞特蘭蒂斯號(hào)航天飛機(jī)搭載的家蠶解滯育的蠶卵在空間中未孵化率較高，未完成胚胎逆轉(zhuǎn)的比例是地面組的2倍[6]。俄羅斯衛(wèi)星搭載的家蠶空間實(shí)驗(yàn)顯示，飛行組的蠶卵孵化時(shí)間和交配蠶蛾的產(chǎn)卵時(shí)間均提前了2～3 d[7]。我國(guó)第12顆返回式衛(wèi)星成功搭載家蠶非滯育卵進(jìn)行軌道飛行8 d，飛行組的胚胎孵化提前2 d，返回地面后，幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間縮短了7 d。2016年，我國(guó)首顆微重力科學(xué)實(shí)驗(yàn)衛(wèi)星搭載家蠶卵空間飛行12 d，結(jié)果顯示胚胎基因表達(dá)受到影響，返回地面后，幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間縮短了3 d[4]。然而，航天飛行耗資巨大、空間環(huán)境復(fù)雜多變、不易控制。因此，地面模擬研究成為研究空間生物科學(xué)的重要選擇，具有低成本、小占地面積、易操作和多實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)的優(yōu)勢(shì)。三維回轉(zhuǎn)器，又稱(chēng)隨機(jī)定位儀，是研究地面模擬失重效應(yīng)的設(shè)備。它包含兩個(gè)相互垂直的轉(zhuǎn)軸，可以隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)內(nèi)框和外框。在一個(gè)回轉(zhuǎn)周期內(nèi)，物體受到的重力矢量和為零，從而模擬失重生物效應(yīng)[8]。研究表明，三維回轉(zhuǎn)器可以影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，如通過(guò)改變卵母細(xì)胞骨架進(jìn)而影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位與功能[9]，降低成骨細(xì)胞分化能力[10]，增加乳腺癌細(xì)胞外囊泡的釋放并改變細(xì)胞間粘附因子的表達(dá)[11-12]。然而地面模擬微重力環(huán)境對(duì)家蠶胚胎發(fā)育的影響及其作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究采用三維回轉(zhuǎn)器模擬空間微重力環(huán)境，研究其對(duì)家蠶胚胎發(fā)育和基因表達(dá)的影響，為空間基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶品系是中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供的非滯育Nistari品系；隨機(jī)定位儀(中國(guó)科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心)；回轉(zhuǎn)控制器(中國(guó)科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心)；RevertAid First Strand cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；DNA消化酶試劑盒(日本Takara公司)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix(日本Toyobo公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR擴(kuò)增儀、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；垂直板電泳槽、變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 雌雄蠶蛾交配6 h后，雌蛾產(chǎn)卵。蠶卵產(chǎn)下12 h后，置于三維回轉(zhuǎn)器上連續(xù)回轉(zhuǎn)11 d，作為回轉(zhuǎn)組，溫度維持在21 ℃。對(duì)照組則是不進(jìn)行回轉(zhuǎn)處理的同批次家蠶卵。我們從對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組中分別隨機(jī)選取了50粒家蠶胚胎樣本和30頭蟻蠶樣本進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。

1.2.2 RNA提取 準(zhǔn)備取材工具，包括剪刀、鑷子、冰盒、進(jìn)口離心管和預(yù)冷的4 ℃離心機(jī)。將500 μL的TRIzol放入滅菌離心管中，并將家蠶胚胎或蟻蠶放入管中，標(biāo)記樣品名稱(chēng)。使用研磨棒研磨組織，將其靜置在室溫下5 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)入新的滅菌離心管，棄去沉淀。加入100 μL三氯甲烷，輕輕搖晃，然后12 000 r/min離心15 min。取上清液進(jìn)入新的離心管，加入等體積的異丙醇和1/10醋酸鈉，輕輕搖晃，冰上靜置10 min，然后12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，取沉淀晾干，加入50 μL的無(wú)酶水。使用DNA消化酶試劑盒消化RNA提取液中的DNA。最后，純化RNA，將消化完DNA的RNA溶解液中加入150 μL無(wú)酶水+200 μL酚氯仿，然后12 000 r/min離心15 min。取上清液進(jìn)入新的離心管，加入上清液1/10體積的醋酸鈉和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，放置在-80 ℃下30 min，然后12 000 r/min離心15 min。去掉上清液，加入1 000 μL的750 mL/L乙醇，然后12 000 r/min離心5 min以洗去雜質(zhì)，洗滌過(guò)程重復(fù)3次。晾干沉淀，加入50 μL的無(wú)酶水，測(cè)量濃度，并進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3 RNA-seq測(cè)序 為了檢測(cè)三維回轉(zhuǎn)對(duì)家蠶胚胎基因表達(dá)的影響，我們從對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組分別隨機(jī)選取家蠶胚胎(發(fā)育第5日)和剛孵化蟻蠶進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序。通過(guò)上述方法提取總RNA，并確保RNA完整性后，送至美吉生物公司進(jìn)行RNA測(cè)序和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，其目的是分析模擬失重環(huán)境對(duì)家蠶胚胎基因表達(dá)和通路的影響。RNA-seq分析的參考基因組來(lái)自家蠶EST數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/index.cgi)。

1.2.4 qRT-PCR qRT-PCR使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。以上述cDNA產(chǎn)物為模板，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含：10 μL的SYBR；0.5 μL的上游引物；0.5 μL的下游引物；2 μL的cDNA模板；7 μL的超純水。PCR反應(yīng)程序包含：95 ℃預(yù)熱1.5 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，循環(huán)是95 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。qRT-PCR中使用的引物序列如表1所示。另一個(gè)引物對(duì)RP49(正向)和RP49(反向)(表1)被用作內(nèi)參[13]。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 三維隨機(jī)回轉(zhuǎn)模擬失重使家蠶胚胎發(fā)育提前

利用三維回轉(zhuǎn)器對(duì)家蠶胚胎樣本進(jìn)行失重效應(yīng)的模擬?；剞D(zhuǎn)組的家蠶胚胎在回轉(zhuǎn)器上連續(xù)回轉(zhuǎn)11 d，溫度保持在21 ℃。對(duì)照組則為未回轉(zhuǎn)的同時(shí)期家蠶胚胎(圖1A)。在蠶胚胎發(fā)育的第10日，回轉(zhuǎn)組的蠶胚胎開(kāi)始點(diǎn)青，而對(duì)照組沒(méi)有發(fā)生變化。第11日，對(duì)照組的蠶胚胎也開(kāi)始點(diǎn)青。第12日，回轉(zhuǎn)組的胚胎開(kāi)始孵化，而對(duì)照組沒(méi)有發(fā)生變化(圖1B)。通過(guò)三維回轉(zhuǎn)模擬失重效應(yīng)，我們觀察到回轉(zhuǎn)組的家蠶胚胎比對(duì)照組發(fā)育提前。這說(shuō)明模擬失重對(duì)家蠶胚胎的發(fā)育產(chǎn)生了顯著影響。

A：三維回轉(zhuǎn)器對(duì)家蠶胚胎樣本進(jìn)行失重效應(yīng)的模擬；B：對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組胚胎發(fā)育照片。

2.2 RNA-seq分析差異表達(dá)基因

為了研究模擬失重對(duì)家蠶胚胎發(fā)育的影響機(jī)制，提取對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎(發(fā)育第5日)，以及剛孵化的蟻蠶的總RNA。隨后，對(duì)提取的樣本進(jìn)行RNA-seq分析。測(cè)序完成并經(jīng)過(guò)質(zhì)控后，對(duì)照組胚胎的測(cè)序讀段數(shù)量為52 750 876，回轉(zhuǎn)組胚胎為43 404 750。對(duì)照組蟻蠶的測(cè)序讀段數(shù)量為41 858 620，回轉(zhuǎn)組蟻蠶為58 435 660(表2)。同時(shí)，對(duì)照組胚胎的測(cè)序綜合質(zhì)量值為96.72%，回轉(zhuǎn)組胚胎為96.81%。對(duì)照組蟻蠶的測(cè)序綜合質(zhì)量值為95.85%，回轉(zhuǎn)組蟻蠶為97.07%(表2)。將質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)，即clean data(reads)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，獲得能定位到基因組上的測(cè)序數(shù)據(jù)，用于后續(xù)分析。值得注意的是，四組樣品的數(shù)據(jù)定位率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于合格值70%(表3)。以上數(shù)據(jù)提示轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成功且數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。

表2 樣品質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

表3 clean reads與參考基因組的比對(duì)結(jié)果情況統(tǒng)計(jì)

差異表達(dá)基因篩選的條件：兩個(gè)樣本間顯著差異的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)篩選閾值Padjust<0.005，且兩個(gè)樣本中轉(zhuǎn)錄本表達(dá)倍數(shù)大于2，即FC>2。在家蠶胚胎對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組之間，發(fā)現(xiàn)1 247個(gè)顯著差異表達(dá)的基因，其中1 047個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，200個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖2A)。在家蠶對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組蟻蠶之間，發(fā)現(xiàn)4 993個(gè)顯著差異表達(dá)的基因，其中3 533個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 460個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖2B)。隨著家蠶胚胎在失重環(huán)境中暴露的時(shí)間延長(zhǎng)，差異表達(dá)的基因數(shù)量也會(huì)增加。

A：對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎發(fā)育第5日差異表達(dá)基因；B：對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異表達(dá)基因。

2.3 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步研究模擬失重對(duì)家蠶胚胎和蟻蠶基因表達(dá)的影響，我們進(jìn)行了GO和KEGG通路的富集分析。在GO功能注釋分析中，差異基因被歸為30個(gè)條目中，包含3個(gè)生物過(guò)程，8個(gè)細(xì)胞成分和9個(gè)分子功能。在篩選的胚胎期差異基因中，生物過(guò)程中催化活性富集的基因數(shù)量最多(151個(gè))，細(xì)胞成分中膜結(jié)構(gòu)富集的基因數(shù)量最多(95個(gè))，分子功能中代謝過(guò)程富集的基因數(shù)量最多(134個(gè)，圖3)。此外，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，回轉(zhuǎn)組胚胎相對(duì)于對(duì)照組胚胎，表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因主要富集于核糖體和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路，這提示模擬失重可能通過(guò)這些信號(hào)通路影響家蠶胚胎發(fā)育。

圖3 胚胎發(fā)育第5日對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎差異基因的GO功能注釋分析

此外，在蟻蠶期篩選的差異基因中，生物過(guò)程中催化活性通路的富集數(shù)量最多(742個(gè))；細(xì)胞成分中膜結(jié)構(gòu)通路的富集數(shù)量最多(489個(gè))；分子功能中代謝過(guò)程的富集數(shù)量最多(691個(gè)，圖4)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，回轉(zhuǎn)組蟻蠶相對(duì)于對(duì)照組蟻蠶，表達(dá)顯著變化的基因主要富集于多個(gè)代謝相關(guān)通路，包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解代謝，果糖和甘露糖的代謝，脂肪酸的降解，鞘脂信號(hào)通路等。除此之外，還富集于黏著斑、緊密連接等通路(表4)。這些結(jié)果提示隨著家蠶胚胎回轉(zhuǎn)時(shí)間的延長(zhǎng)，差異基因及其富集的通路數(shù)量也隨之增加。

圖4 對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異基因的GO功能注釋分析

表4 對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異基因的KEGG通路富集分析

2.4 差異表達(dá)基因的體外驗(yàn)證

通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組家蠶胚胎中篩選出的差異顯著基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，回轉(zhuǎn)組胚胎中有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、突觸囊泡糖蛋白2B、蛻皮甾體激酶22、組蛋白H1、卵巢絲氨酸蛋白酶異構(gòu)體1、嗅覺(jué)受體16、保幼激素環(huán)氧化物水解酶樣蛋白1、線粒體心磷脂水解酶同工酶x2以及生殖細(xì)胞發(fā)育必需的nanos-M基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著升高(圖5)。以上結(jié)果表明，模擬失重可能通過(guò)調(diào)控上述基因的表達(dá)促進(jìn)早期家蠶胚胎的發(fā)育。

圖5 模擬失重下家蠶胚胎相關(guān)基因的表達(dá)變化(bP<0.01)

qRT-PCR驗(yàn)證對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶中表達(dá)顯著上調(diào)的基因(A)與下調(diào)的基因(B)。aP<0.05，bP<0.01。

此外，我們也利用qRT-PCR驗(yàn)證了篩選出的對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組蟻蠶差異顯著基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，回轉(zhuǎn)組蟻蠶中葛老素2抗菌肽、肌醇加氧酶、胰蛋白酶、造血表達(dá)同源盒蛋白、膽固醇-25-羥化酶、toll樣受體、氨肽酶N、甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、脂多糖誘發(fā)腫瘤壞死因子α同族體、糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶前體基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著升高(圖6A)。然而，表皮蛋白R(shí)R2、膠原蛋白α-1、msta多效蛋白樣蛋白、膠原蛋白和鈣結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平顯著降低(圖6B)。以上結(jié)果暗示，模擬失重可能通過(guò)促進(jìn)或抑制上述基因的表達(dá)促使蟻蠶孵化時(shí)間提前。

3 討論

本研究使用三維隨機(jī)回轉(zhuǎn)器模擬失重環(huán)境處理家蠶胚胎，發(fā)現(xiàn)模擬失重使家蠶胚胎發(fā)育提前。RNA-seq分析結(jié)果顯示，模擬失重影響了家蠶胚胎中期和蟻蠶期基因的表達(dá)。隨著在失重環(huán)境中暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，差異表達(dá)基因的數(shù)量以及這些基因所參與的富集通路數(shù)量也呈遞增趨勢(shì)。

目前，我國(guó)的空間站已經(jīng)完成建造，并進(jìn)入應(yīng)用與發(fā)展階段。隨著航天員在軌時(shí)間的增加，他們所面臨的環(huán)境也變得更加復(fù)雜，包括輻射、失重、振動(dòng)噪聲和晝夜節(jié)律的變化等。其中，失重作為一個(gè)重要的影響因素對(duì)航天員的身心健康產(chǎn)生影響[1-3]。然而，由于空間飛行實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)少，在軌航天員數(shù)量有限，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相對(duì)較少，無(wú)法滿(mǎn)足對(duì)失重生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行深入研究的需求。因此，地面模擬失重研究成為一種重要的選擇。在空間生物學(xué)領(lǐng)域，已經(jīng)應(yīng)用了多種地面模擬失重的研究方法，包括頭低位臥床、后肢尾懸吊、水下模擬失重、回轉(zhuǎn)模擬器、抗磁懸浮超導(dǎo)磁體、飛機(jī)拋物線飛行等[14-19]。而三維隨機(jī)回轉(zhuǎn)器具有占用空間小，能夠長(zhǎng)時(shí)間模擬失重環(huán)境的優(yōu)勢(shì)。因此，本研究選擇采用三維隨機(jī)回轉(zhuǎn)器模擬失重。

家蠶胚胎是進(jìn)行空間搭載和地面模擬失重實(shí)驗(yàn)的理想材料。家蠶胚胎在發(fā)育階段細(xì)胞不斷增殖和分化，形成各種器官，并且基因表達(dá)活躍，這些遺傳信息可以反映整個(gè)家蠶生命過(guò)程。此外，家蠶具有很高的繁殖率，一只雌蛾可以產(chǎn)卵約400粒，這為實(shí)驗(yàn)提供了大量的胚胎材料。家蠶胚胎的孵化周期為10 d，在此期間它們不需要進(jìn)食，為實(shí)驗(yàn)的連續(xù)開(kāi)展提供了便利。家蠶的遺傳背景清晰，早在2004年就已完成了家蠶全基因組測(cè)序[20]，為后續(xù)的遺傳分子實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，家蠶胚胎具有許多優(yōu)點(diǎn)，使其成為實(shí)驗(yàn)研究的理想材料。根據(jù)俄羅斯第10號(hào)生物衛(wèi)星搭載中國(guó)蠶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飛行組蠶卵的孵化時(shí)間比對(duì)照組早2～3 d，且航天飛行中滯育卵的孵化率高于對(duì)照組[7]。地面抗磁懸浮超導(dǎo)磁體模擬失重環(huán)境處理家蠶胚胎的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胚胎的孵化時(shí)間比正常蠶卵縮短了約3 d[21]。本研究發(fā)現(xiàn)三維回轉(zhuǎn)模擬失重環(huán)境處理家蠶胚胎導(dǎo)致胚胎發(fā)育時(shí)間比對(duì)照組縮短。這些研究結(jié)果一致表明，失重處理能夠縮短家蠶胚胎的發(fā)育時(shí)間。然而，失重對(duì)家蠶胚胎發(fā)育影響的潛在分子機(jī)制尚不明確。

本研究分別對(duì)家蠶胚胎中期和孵化期的對(duì)照組和回轉(zhuǎn)組(模擬失重環(huán)境)樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果顯示，隨著失重環(huán)境處理時(shí)間的延長(zhǎng)，差異表達(dá)基因數(shù)量增加，并且影響到更多的蛋白通路。這表明失重環(huán)境對(duì)家蠶胚胎的影響與處理時(shí)間呈正相關(guān)，而且在較長(zhǎng)時(shí)間的處理下，影響的生物過(guò)程和通路范圍更廣泛。根據(jù)KEGG通路富集分析的結(jié)果，模擬失重對(duì)家蠶胚胎發(fā)育中期的核糖體和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)通路產(chǎn)生影響。這兩個(gè)通路是相互關(guān)聯(lián)的，并在蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用[22]。因此，模擬失重可能會(huì)通過(guò)影響家蠶胚胎中期的蛋白質(zhì)合成途徑來(lái)促進(jìn)胚胎發(fā)育。利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)模擬失重導(dǎo)致家蠶胚胎相關(guān)基因表達(dá)顯著增加。其中一些基因包括有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和突觸囊泡糖蛋白2B基因，它們參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能[23]。另外，蛻皮甾體22激酶和保幼激素環(huán)氧化物水解酶樣蛋白1參與蛻皮功能的調(diào)控[24]，卵巢絲氨酸蛋白酶異構(gòu)體1和nanos-M參與性別調(diào)控[25]，線粒體心磷脂水解酶同工酶x2參與代謝調(diào)控[26]，嗅覺(jué)受體16參與嗅覺(jué)調(diào)控[27]。綜合KEGG通路富集分析和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示模擬失重通過(guò)調(diào)控早期家蠶胚胎中離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛻皮、性別、代謝和嗅覺(jué)關(guān)鍵基因的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)合成來(lái)影響家蠶胚胎發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們更好地理解模擬失重對(duì)生物體發(fā)育過(guò)程的影響機(jī)制。

對(duì)照組與回轉(zhuǎn)組孵化的蟻蠶進(jìn)行的KEGG通路富集分析顯示，模擬失重處理后孵化的蟻蠶中代謝通路發(fā)生了顯著變化。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，模擬失重導(dǎo)致蟻蠶中氨肽酶N和膽固醇-25-羥化酶的表達(dá)顯著增加。氨肽酶N主要負(fù)責(zé)從蛋白質(zhì)或肽段的N端逐個(gè)去除氨基酸殘基，從而產(chǎn)生較短的肽段或游離氨基酸。這些肽段和游離氨基酸可以被其他酶和代謝途徑利用，參與能量產(chǎn)生、氨基酸代謝和新的蛋白質(zhì)合成等生物過(guò)程[28]。膽固醇-25-羥化酶則催化膽固醇的羥化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為25-羥基膽固醇，在膽固醇和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[29]。這表明模擬失重可能通過(guò)調(diào)控家蠶胚胎末期氨肽酶N和25-羥基膽固醇基因的表達(dá)，影響家蠶的氨基酸和脂質(zhì)代謝，從而最終影響胚胎發(fā)育。此外，模擬失重還導(dǎo)致孵化的蟻蠶中緊密連接和粘著斑通路發(fā)生了顯著變化。模擬失重引起了蟻蠶中糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶前體和胰蛋白酶的表達(dá)顯著增加。糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶參與了蛋白酶活化受體和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的激活過(guò)程，并調(diào)節(jié)了緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)，從而維持腸上皮屏障功能的穩(wěn)態(tài)[30]。而緊密連接位于相鄰細(xì)胞間隙的頂端側(cè)面，具有封閉細(xì)胞間隙，保持滲透性和維持細(xì)胞極性的功能[31]。另外，胰蛋白酶和糜蛋白酶在皮膚角質(zhì)脫落過(guò)程中降解細(xì)胞間的粘附分子，促進(jìn)皮膚細(xì)胞的脫落[32]。這提示模擬失重可能通過(guò)促進(jìn)家蠶胚胎末期糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的表達(dá)，調(diào)控家蠶胚胎末期細(xì)胞的極性、滲透性和細(xì)胞粘附性，最終加速胚胎發(fā)育。

然而，目前對(duì)于模擬失重環(huán)境影響家蠶胚胎發(fā)育的具體分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探究。盡管如此，我們相信本研究中對(duì)模擬失重環(huán)境對(duì)家蠶胚胎發(fā)育的影響以及基因表達(dá)特征的分析，將為空間生物學(xué)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。