李 萌，張 舒，胡澤兵，孫 權(quán)，徐麗群，張正祥，石 菲

(1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716099；2空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032)

航天實(shí)踐和地面研究已證實(shí)，失重和模擬失重可誘導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的固有免疫和特異性免疫均產(chǎn)生不利影響[1]。免疫系統(tǒng)是航天飛行中受影響最嚴(yán)重的系統(tǒng)之一。免疫功能的下降增加了航天員機(jī)體發(fā)生感染、腫瘤、過(guò)敏和自身免疫性疾病等的可能性[2]。目前，免疫功能下降的機(jī)制尚未被完全闡明，而免疫細(xì)胞對(duì)微重力環(huán)境異常敏感。重力的改變可以通過(guò)不同的機(jī)制影響免疫細(xì)胞的多個(gè)方面[3]。先天免疫細(xì)胞作為人體免疫防御的第一道防線，在識(shí)別和清除抗原異物、保護(hù)機(jī)體免受外界侵襲等方面發(fā)揮著重要作用[4]。巨噬細(xì)胞作為重要的先天免疫細(xì)胞，具有細(xì)胞吞噬、抗原呈遞和細(xì)胞因子分泌的功能，可影響炎癥反應(yīng)、組織重塑和修復(fù)，是先天免疫功能的主要執(zhí)行者[5]。但在航天失重環(huán)境下，巨噬細(xì)胞的功能變化特點(diǎn)研究一直沒有得到足夠重視。因此，本研究擬借助2D回轉(zhuǎn)器模擬失重生物效應(yīng)，探討模擬失重對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，為深化失重下人體免疫功能抑制機(jī)制研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠白血病病毒誘發(fā)的腫瘤巨噬細(xì)胞RAW264.7(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(以色列VivaCel公司)，2D回轉(zhuǎn)器(中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心)，Transwell小室(8 μm孔徑，美國(guó)康寧公司)，CCK-8試劑(西安米鼠生物公司)，EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒、結(jié)晶紫染液(上海碧云天公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 冷凍保存的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞在復(fù)蘇后，使用含有100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞放置于37 ℃恒溫箱，保持50 mL/L CO2濃度，并每日更換培養(yǎng)基1次。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時(shí)，使用細(xì)胞刮刀進(jìn)行傳代處理。選取復(fù)蘇后3～6代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞模擬失重實(shí)驗(yàn) 利用2D回轉(zhuǎn)器模擬失重環(huán)境，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將RAW264.7細(xì)胞接種于25 cm2專用回轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中，每瓶細(xì)胞密度為1×105，待細(xì)胞附著在瓶壁上后，用培養(yǎng)基灌滿培養(yǎng)瓶并加蓋密封塞，確保完全消除氣泡。接下來(lái)，在2D回轉(zhuǎn)器中放置培養(yǎng)瓶，以24 r/min的速度圍繞水平軸旋轉(zhuǎn)72 h，作為模擬失重組(SMG組)。對(duì)照組(NG組)置入同一環(huán)境中靜置培養(yǎng)相同時(shí)間，不進(jìn)行回轉(zhuǎn)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞活力 模擬失重72 h后，將SMG組和NG組細(xì)胞接種于96孔板后，將板置于37 ℃、50 mL/L CO2箱中，待細(xì)胞達(dá)到60%～70%后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定A450 nm值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 EdU染色法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖能力 在模擬失重72 h后，將SMG組和NG組細(xì)胞接種于經(jīng)高壓滅菌處理的細(xì)胞爬片6孔板中。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且貼壁后，向細(xì)胞中加入EdU試劑，孵育2 h。隨后，固定細(xì)胞并進(jìn)行30 min的破膜處理。接下來(lái)，根據(jù)說(shuō)明配置EdU反應(yīng)溶液，在避光條件下進(jìn)行30 min反應(yīng)。最后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染核、洗滌和封片處理。使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并隨機(jī)獲取5個(gè)視野，用ImageJ軟件計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的熒光圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在模擬失重72 h后，將SMG組和NG組的細(xì)胞接種于6孔板中，然后將其置于37 ℃、50 mL/L CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。直到細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在6孔板底畫一條橫線，然后在孔內(nèi)垂直橫線處用10 μL無(wú)菌槍頭劃痕。之后，輕柔地用無(wú)菌PBS洗去刮下的懸浮細(xì)胞，并加入無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、12 h后分別于倒置顯微鏡下觀察并拍照，然后用ImageJ軟件測(cè)量劃痕面積。

1.2.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將SMG組和NG組細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液后，分別加入到小室的上室中，加入培養(yǎng)基(無(wú)血清)于下室中。將小室放置在50 mL/L CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)12 h，然后取出小室，用PBS清洗干凈后，用棉簽擦干小室上層的內(nèi)面。用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞，將其保持在溶液中30 min后，用結(jié)晶紫染色30 min，然后用去離子水沖洗未遷移的細(xì)胞，并用棉簽擦去，待其自然干燥后，在顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 DCFH-DA熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量 模擬失重72 h后取SMG組和NG組細(xì)胞接種于6孔板，置37 ℃、50 mL/L CO2下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)試劑盒的要求，在適當(dāng)?shù)臈l件下于原位裝載探針，并使用無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶1 000比例稀釋。將細(xì)胞培養(yǎng)液清除后，加入1 mL稀釋后的DCFH-DA，將樣品放置在37 ℃、50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。處理完成后，使用無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行3次洗滌，以充分清除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，以防止液體熒光強(qiáng)度本底過(guò)高。使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 模擬失重對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖能力的影響

為了探究模擬失重是否影響巨噬細(xì)胞的增殖能力，將RAW264.7細(xì)胞置于2D回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)72 h后進(jìn)行檢測(cè)，EdU染色結(jié)果顯示，NG組EdU摻入RAW264.7細(xì)胞核的量更多(P<0.01，圖1A～B)；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于NG組，SMG組增殖能力減弱(P<0.05，圖1C)。上述結(jié)果均表明，模擬失重對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖能力具有抑制作用。

A：EdU法測(cè)定細(xì)胞增殖率(標(biāo)尺為20 μm)；B：EdU陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)圖(bP<0.01 vs NG組)；C：CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖速率(aP<0.05 vs NG組)。NG組：對(duì)照組；SMG組：模擬失重組。

2.2 模擬失重下RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)

為探究模擬失重是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞的遷移能力，將RAW264.7細(xì)胞置于2D回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)72 h后，分別通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(圖2A～B)和Transwell實(shí)驗(yàn)(圖2C～D)檢測(cè)模擬失重對(duì)其遷移能力的影響。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，與NG組相比，SMG組細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)(P<0.05)。

A：劃痕創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)；B：NG組和SMG組12 h的相對(duì)遷移率；C：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)；D：NG組和SMG組12 h的細(xì)胞遷移數(shù)。標(biāo)尺為100 μm。NG組：對(duì)照組；SMG組：模擬失重組。aP<0.05 vs NG組。

2.3 模擬失重抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌ROS

為探究模擬失重對(duì)巨噬細(xì)胞分泌ROS的影響，將RAW264.7細(xì)胞置于2D回轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)72 h后，探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：NG組綠色熒光標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞較多，且在視野中平均分布，而SMG組幾乎沒有綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞，視野內(nèi)只有極低量的熒光分布(圖3A)。對(duì)ROS陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行平均熒光強(qiáng)度計(jì)算，兩組存在顯著差異(P<0.01，圖3B)。

A：72 h模擬失重后DCFH-DA標(biāo)記情況(標(biāo)尺為20 μm)；B：細(xì)胞分泌ROS的平均熒光強(qiáng)度(bP<0.01 vs 對(duì)照組)。NG組：對(duì)照組；SMG組：模擬失重組。ROS：活性氧。

3 討論

既往研究顯示，航天飛行中和飛行后1周，航天員會(huì)出現(xiàn)感染性疾病，包括結(jié)膜炎、急性呼吸道感染、牙齒感染等，也曾有航天員在飛行中發(fā)生了正常情況下少見菌導(dǎo)致的尿路感染[6]。此外，航天飛行還會(huì)使航天員體內(nèi)潛伏的病毒再活化，它不僅可能造成包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的全身重要臟器出現(xiàn)功能性損傷，還增加了惡性腫瘤的發(fā)病概率[7]。因此，失重環(huán)境下機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)與控制逐漸成為航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。巨噬細(xì)胞是非特異性免疫中的一種重要細(xì)胞，它可以通過(guò)抗原提呈和釋放細(xì)胞因子來(lái)激活特異性免疫應(yīng)答，并在許多生理過(guò)程中發(fā)揮作用[8]。鑒于此，已有學(xué)者針對(duì)失重/模擬失重對(duì)巨噬細(xì)胞的影響開展了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞不僅對(duì)重力變化敏感，而且細(xì)胞功能會(huì)呈現(xiàn)出多種改變[9]。然而，由于各項(xiàng)研究使用的細(xì)胞來(lái)源、微重力模擬平臺(tái)以及實(shí)驗(yàn)變量之間存在差異，很難直接對(duì)既往研究結(jié)果進(jìn)行直接比較分析，且研究結(jié)果之間也存在結(jié)論不一致甚至是相互矛盾的情況[10]。因此，我們利用課題組長(zhǎng)期使用的2D回轉(zhuǎn)器細(xì)胞模擬失重模型，對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖、遷移、ROS分泌等基本生物學(xué)功能進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探究，期望為深化失重環(huán)境下航天員免疫功能改變的具體機(jī)制提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

巨噬細(xì)胞是先天免疫反應(yīng)中不可或缺的重要成員，在調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11-12]。它們積極參與免疫反應(yīng)的所有階段，從引發(fā)炎癥、觸發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，到清除細(xì)胞碎片和消解炎癥，其增殖的正常過(guò)程與在炎癥調(diào)控中發(fā)揮的功能密切相關(guān)[13-14]。重力改變對(duì)巨噬細(xì)胞增殖能力的影響說(shuō)法不一，ARMSTRONG等[15]研究曾報(bào)道在太空飛行6～7 d后小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞增殖增加，而HATTON等[16]則報(bào)道，與地面對(duì)照相比，太空飛行中U937細(xì)胞的增殖能力顯著降低。巨噬細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化頗為敏感，在航天飛行搭載實(shí)驗(yàn)中，由于受到飛行中振動(dòng)、噪聲、電磁、輻射等多種環(huán)境因素的影響，細(xì)胞的表現(xiàn)較地面實(shí)驗(yàn)更復(fù)雜多變。地面模擬失重效應(yīng)，可有效排除其他物理環(huán)境因素的影響，突出單一因素對(duì)細(xì)胞的干預(yù)效果。本研究中，我們采用2D回轉(zhuǎn)器培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，地面模擬失重72 h后，RAW264.7細(xì)胞的增殖受到顯著抑制。這一結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞對(duì)重力變化敏感，模擬失重對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用。

巨噬細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、傳播和消退過(guò)程中扮演重要角色，有研究顯示巨噬細(xì)胞遷移過(guò)程功能障礙與感染易感性增加有關(guān)[17]。因此，失重/微重力暴露是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞遷移，也受到研究者關(guān)注。現(xiàn)有報(bào)道大多聚焦于通過(guò)觀察巨噬細(xì)胞骨架和黏附分子等的變化，來(lái)間接推測(cè)其遷移能力的變化情況，例如：研究較多的是細(xì)胞粘附分子ICAM-1，TAUBER等[18]報(bào)道了在國(guó)際空間站上培養(yǎng)的原代人巨噬細(xì)胞ICAM-1表達(dá)減少，而PAULSEN等[19]報(bào)道在亞軌道飛行的微重力下，以及在回轉(zhuǎn)器模擬的微重力下，U937巨噬細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)增加。還有報(bào)道指出，微重力導(dǎo)致的ICAM-1表達(dá)改變是快速、可逆的，并與細(xì)胞骨架功能有關(guān)。細(xì)胞骨架對(duì)于保持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遷移和信號(hào)傳導(dǎo)等方面有著重要的功能，同時(shí)是巨噬細(xì)胞變形和遷移運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[20]。巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架的變化情況與失重/微重力暴露時(shí)間有關(guān)，短時(shí)失重/微重力作用下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變往往是一過(guò)性的，例如：在亞軌道飛行實(shí)驗(yàn)中，達(dá)到微重力的幾秒鐘內(nèi)，原代培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞細(xì)胞骨架發(fā)生變化，細(xì)胞核體積、表面積都增加，但在幾分鐘內(nèi)就會(huì)適應(yīng)并恢復(fù)到暴露前狀態(tài)[21]。而長(zhǎng)時(shí)間的失重/微重力暴露對(duì)巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響有所不同，用旋轉(zhuǎn)壁式回轉(zhuǎn)系統(tǒng)模擬失重培養(yǎng)U937巨噬細(xì)胞72 h，導(dǎo)致細(xì)胞骨架排布紊亂、肌動(dòng)蛋白表達(dá)減少，同時(shí)伴有細(xì)胞增殖能力減弱[22]。在上述研究中，研究者習(xí)慣于根據(jù)巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架系統(tǒng)的改變，來(lái)推測(cè)失重/微重力對(duì)其遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell小室實(shí)驗(yàn)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋庇^地展示模擬失重刺激后RAW264.7巨噬細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的變化特征，這是本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)之一。下一步可繼續(xù)分析檢測(cè)與巨噬細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)關(guān)聯(lián)密切的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，探究模擬失重致RAW264.7遷移能力增強(qiáng)的分子調(diào)控機(jī)制。

ROS是人體正常進(jìn)行有氧代謝時(shí)產(chǎn)生的一類物質(zhì)，它們含氧并且性質(zhì)活潑。在正常細(xì)胞中，ROS作為氧化代謝過(guò)程的副產(chǎn)物，處于一個(gè)動(dòng)態(tài)而穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，ROS的穩(wěn)態(tài)有助于維持健康細(xì)胞中的氧化還原平衡[23-24]。巨噬細(xì)胞中ROS的信號(hào)傳導(dǎo)和破壞特性可以驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)以及由炎癥引起的疾病。ROS濃度對(duì)巨噬細(xì)胞的極化產(chǎn)生明顯的影響，高濃度的ROS通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型(促炎性)極化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮促炎作用；而低濃度的ROS則能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞朝向M2型(抗炎性)極化[25-26]。因此巨噬細(xì)胞釋放ROS不僅是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵要素之一，也是抵抗微生物入侵人體的最重要屏障。在微重力條件下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的氧化爆發(fā)反應(yīng)受到抑制[18，27-29]。ADRIAN等[27]報(bào)告了在回轉(zhuǎn)模擬失重和拋物線飛行實(shí)驗(yàn)中，巨噬細(xì)胞分泌ROS減少，且在幾秒鐘內(nèi)可逆。THIEL等[29]也報(bào)道了在國(guó)際空間站上NR8383大鼠肺泡巨噬細(xì)胞ROS的立即抑制，而隨后快速適應(yīng)。已有的報(bào)道均提示微重力下ROS分泌減少導(dǎo)致巨噬細(xì)胞相關(guān)功能被抑制。本研究中我們將RAW264.7巨噬細(xì)胞置于2D回轉(zhuǎn)器模擬失重培養(yǎng)72 h，ROS釋放受到顯著抑制，與其他研究報(bào)道的結(jié)果相似。說(shuō)明失重/微重力可以影響巨噬細(xì)胞釋放ROS，從而增加機(jī)體對(duì)疾病的易感性。

巨噬細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫反應(yīng)的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，在免疫耐受、炎癥反應(yīng)、吞噬凋亡細(xì)胞等多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[30]。巨噬細(xì)胞功能障礙與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)回轉(zhuǎn)模擬失重影響了RAW264.7巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能，主要表現(xiàn)是細(xì)胞增殖和ROS分泌受到抑制，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。現(xiàn)階段失重/微重力對(duì)巨噬細(xì)胞的影響及其具體分子機(jī)制尚未被完全闡明，本文報(bào)道的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展和結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可以為進(jìn)一步深化失重環(huán)境下航天員免疫功能抑制機(jī)制研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。