張俊飛，張 舒，石 菲，郭 顯，胡澤兵

(空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天生物動力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，陜西 西安 710032)

近年來，基于干細(xì)胞移植的再生醫(yī)學(xué)研究和組織工程研究的發(fā)展為臨床損傷修復(fù)類疾病的治療帶來了新的希望。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種典型的成體多能干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)等能力，因其獨特的生物學(xué)特性和良好的轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力成為干細(xì)胞療法的熱門種子細(xì)胞，在多種因衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)等方面受到廣泛關(guān)注[1]。但是，MSCs類細(xì)胞制品在臨床療效方面仍然存在一些問題，如長期體外擴(kuò)增時分化潛能降低、致瘤性升高、免疫調(diào)節(jié)能力降低[2-3]，移植后歸巢能力有限[4-5]等，這些問題極大地限制了其在細(xì)胞治療中的應(yīng)用和發(fā)展。在優(yōu)化MSCs體外培養(yǎng)條件時，研究人員發(fā)現(xiàn)改變MSCs的培養(yǎng)環(huán)境可使其生物學(xué)特性在一定范圍內(nèi)重塑[6]。其中，模擬微重力培養(yǎng)技術(shù)能夠在一定程度上維持MSCs的“干細(xì)胞特性”[7]，有望解決MSCs作為種子細(xì)胞在體外擴(kuò)增和臨床治療中遇到的難題?；谶@一現(xiàn)象，本文總結(jié)了模擬微重力培養(yǎng)技術(shù)對MSCs主要生物學(xué)特性的影響，并討論了其在體外擴(kuò)增中的保護(hù)效應(yīng)和潛在的臨床應(yīng)用前景。

1 MSCs在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用前景及問題

1.1 MSCs在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用優(yōu)勢

干細(xì)胞是具有自我復(fù)制、更新和多向分化潛能的一類細(xì)胞，其按照所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)。ESCs具有發(fā)育成人類所有細(xì)胞類型的潛能，但是其來源、獲取和研究受到倫理和法律限制，影響了其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[8]。在諸多ASCs中，MSCs憑借其良好的生物學(xué)特性，成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域較為理想的種子細(xì)胞類型[9]。MSCs屬于多能干細(xì)胞的一種，在骨髓、牙髓、胎盤、脂肪、皮膚等組織中均有發(fā)現(xiàn)，具有高度的自我更新能力、多向分化潛能，并且在體外培養(yǎng)至多代后仍能夠在一定程度上保持這種多向分化潛能。目前相關(guān)文獻(xiàn)均認(rèn)為身體的各部分間充質(zhì)內(nèi)均含有MSCs，其易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，且避免了法律倫理審查的要求，同時比其他ASCs有更大的分化潛能，在細(xì)胞替代治療和組織工程領(lǐng)域有較高的研究與應(yīng)用價值[10]。我國現(xiàn)行法律法規(guī)已經(jīng)允許使用MSCs進(jìn)行臨床研究[11]，相信未來其對我國再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展能夠提供更強(qiáng)大的助力。

1.2 MSCs在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用與問題

MSCs可通過歸巢、分泌一系列細(xì)胞因子和生長因子以及分泌外泌體等多種形式發(fā)揮造血功能、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)再生等生物學(xué)功能[12]，目前，已經(jīng)被多個臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛關(guān)注并展示出良好的轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。例如，在治療肺部疾病中使用MSCs治療已被證明可以改善肺功能[13]；MSCs可以改善各種代謝類疾病，如高血糖、高甘油三酯血癥、高血壓等[14]；在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，通過鞘內(nèi)MSCs給藥，其分泌的生長因子和趨化因子對治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病起到有益作用[15]；等等。但是，由于MSCs從體內(nèi)分離純化后的細(xì)胞量較少，無法滿足臨床應(yīng)用，必須經(jīng)過體外培養(yǎng)擴(kuò)增后才能達(dá)到干細(xì)胞移植所需要的細(xì)胞數(shù)量，體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)的差異容易導(dǎo)致MSCs類細(xì)胞制品在生物學(xué)特性上發(fā)生改變，影響了臨床應(yīng)用效果。有研究顯示，體外培養(yǎng)擴(kuò)增的MSCs有在受者體內(nèi)存活率低[16]、移植的MSCs歸巢數(shù)量較少、不能維持MSCs的干性和免疫調(diào)節(jié)功能[3]、細(xì)胞大量體外擴(kuò)增后出現(xiàn)衰老特征[17]等問題。因此，越來越多的目光聚焦到改變MSCs的培養(yǎng)環(huán)境從而改變其生物學(xué)特性上。模擬微重力培養(yǎng)技術(shù)是在地面采用特殊細(xì)胞培養(yǎng)裝置，如2D回轉(zhuǎn)器、隨機(jī)位置儀、旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)等，實現(xiàn)對細(xì)胞的多向轉(zhuǎn)動，使得細(xì)胞來不及感受重力矢量的影響以達(dá)到模擬太空微重力環(huán)境的目的[18]。已有研究表明，模擬微重力培養(yǎng)能夠影響細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，雖然因微重力模擬方法和實驗條件的差異而得到的實驗結(jié)果有所不同，但大部分結(jié)果顯示模擬微重力下培養(yǎng)的MSCs更有利于應(yīng)用到臨床治療中。

2 模擬微重力培養(yǎng)對MSCs歸巢能力的影響

歸巢能力是影響MSCs移植后治療效果的重要因素之一。MSCs歸巢，是指MSCs在目標(biāo)組織的脈管系統(tǒng)里被捕獲，隨后跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至目標(biāo)組織的過程。具體的過程可表述為：當(dāng)機(jī)體組織受到某種刺激時，一些“休眠”的MSCs被“喚醒”，MSCs表面表達(dá)不同細(xì)胞因子受體，其與相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞遷移，移動到損傷部位后，促進(jìn)損傷部位的細(xì)胞修復(fù)。歸巢是干細(xì)胞作用的初始環(huán)節(jié)，亦是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。干細(xì)胞移植一般可采取局部注射和全身注射。對于局部注射，MSCs主要通過促炎細(xì)胞因子梯度定向歸巢到損傷部位；對于全身注射，MSCs被施用于血液，然后經(jīng)歷類似于白細(xì)胞遷移的多步驟過程才能離開循環(huán)并移動到損傷部位，基本可分為3個過程：活化-動員(炎性細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子和生長因子，活化MSCs)、結(jié)合-滾動(MSCs與血管內(nèi)皮結(jié)合并滾動)、黏附-穿越(穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入靶組織)。

MSCs所表達(dá)的趨化因子受體、黏附分子及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)等都參與了其歸巢過程。研究顯示，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及其受體C-X-C基元受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)在MSCs歸巢的活化動員環(huán)節(jié)發(fā)揮著尤為重要的作用[19]。阻斷或沉默CXCR4表達(dá)可顯著抑制MSCs的遷移能力，過表達(dá)CXCR4可以增強(qiáng)MSCs的歸巢性[20]。在模擬微重力條件下培養(yǎng)大鼠骨髓來源的MSCs 7 d后發(fā)現(xiàn)，趨化因子受體CXCR4表達(dá)顯著升高，而SDF-1對表達(dá)CXCR4的MSCs趨化作用增強(qiáng)，將其移植到脊髓損傷模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，歸巢到損傷部位的MSCs明顯增多[21]。MMPs可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞基底膜并降解胞外基質(zhì)，在歸巢過程中促進(jìn)MSCs的遷移[22]。將人類間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem/stromal cells，hMSCs)在微重力環(huán)境中暴露10 d后，MMPs抑制劑TIMP1和TIMP3基因的表達(dá)下降[23-24]，而MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10、MMP14表達(dá)則顯著升高[24]，有利于降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，提高M(jìn)SCs的遷移能力。另一研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AD-MSCs)向成纖維細(xì)胞分化中，MMP1的表達(dá)上調(diào)，而模擬微重力環(huán)境可以促進(jìn)MMP1表達(dá)進(jìn)一步增加，這也印證了微重力環(huán)境對MMPs表達(dá)的影響[25]。雖然微重力對MSCs歸巢的各個環(huán)節(jié)呈現(xiàn)出不同的影響，但現(xiàn)有報道顯示微重力環(huán)境主要是通過增強(qiáng)遷移和侵入過程而促進(jìn)MSCs歸巢。

3 模擬微重力培養(yǎng)對MSCs免疫調(diào)節(jié)特性的影響

免疫調(diào)節(jié)能力是MSCs發(fā)揮治療作用的重要機(jī)制之一[26]，其可以通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞外囊泡等誘導(dǎo)免疫細(xì)胞功能發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子之間的平衡，形成組織修復(fù)所必需的細(xì)胞因子微環(huán)境。MSCs分泌的、參與免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性細(xì)胞因子主要包括：強(qiáng)效T輔助2型細(xì)胞(T helper 2 cell，Th2)因子、IFN-γ誘導(dǎo)蛋白IP-10、巨噬細(xì)胞趨化蛋白(macrophage chemoattractant protein，MCP)等[27]，這些可溶性細(xì)胞因子可以作用于多種免疫相關(guān)細(xì)胞，根據(jù)局部微環(huán)境中不同的炎性反應(yīng)進(jìn)程，MSCs表現(xiàn)出不同的分泌特征，從而發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用[28]。

研究表明，模擬微重力培養(yǎng)的MSCs可以通過抑制損傷部位的炎性反應(yīng)而促進(jìn)組織修復(fù)和功能恢復(fù)。OTSUKA等[29]將模擬微重力條件下培養(yǎng)的人顱骨來源的MSCs注射于創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦損傷部位的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達(dá)顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著升高，腦損傷部位的組織修復(fù)和小鼠運動功能得到改善。另有研究證實，模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)兩周后MSCs中趨化因子Th2和MCP-3表達(dá)下降，而炎癥與免疫抑制因子IL-10表達(dá)顯著增加[30]，這有利于增強(qiáng)MSCs的免疫抑制能力。但是，RATUSHNYY等[31]將AD-MSCs暴露在微重力環(huán)境48 h后觀察到，微重力本身不會引起炎癥相關(guān)的變化，但會對炎性因子TNF-α引發(fā)的炎性反應(yīng)減弱，這對MSCs的免疫抑制能力可能會起到負(fù)面影響。雖然，由于細(xì)胞來源和模擬微重力培養(yǎng)方法的不同導(dǎo)致研究結(jié)果存在差異，但從大多數(shù)研究來看，模擬微重力對MSCs免疫調(diào)節(jié)特性的影響，有利于其移植后降低排斥反應(yīng)，從而延長存活時間，使MSCs在免疫與炎癥相關(guān)疾病中具有更廣闊的應(yīng)用前景。

4 模擬微重力培養(yǎng)對MSCs致瘤性的影響

MSCs的臨床安全性一直是再生醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。由于人體組織中MSCs數(shù)量有限，所以需要離體擴(kuò)增以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞才能發(fā)揮治療功效，但大量擴(kuò)增會降低DNA聚合酶和DNA修復(fù)效能，從而可能導(dǎo)致細(xì)胞遺傳突變、表觀遺傳學(xué)改變、DNA損傷等[32-33]，這可能增加MSCs的惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險。盡管有風(fēng)險，但在正常情況下MSCs比誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和ESCs的不穩(wěn)定性和形成畸胎瘤的可能性更小[34]，且沒有表現(xiàn)出本質(zhì)上的致瘤性，從而成為MSCs應(yīng)用于臨床治療的優(yōu)勢之一。但是，模擬微重力環(huán)境改變了細(xì)胞的生長環(huán)境，是否會加大MSCs體外擴(kuò)增中的致瘤風(fēng)險需要進(jìn)一步研究評估。

在國際空間站進(jìn)行的一項研究顯示，對太空培養(yǎng)7 d和14 d的hMSCs進(jìn)行染色體、DNA損傷和致瘤性檢測，沒有發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化的證據(jù)[30]。KOAYKUL等[35]將hMSCs在微重力環(huán)境中培養(yǎng)15 d后，測得細(xì)胞黏附效率和生長率與正常重力下沒有顯著差異。但也有另一項研究報道，在微重力條件下培養(yǎng)的hMSCs的平均倍增時間比在自然重力條件下短1.5倍[36]。初步推測，未來將模擬微重力培養(yǎng)MSCs應(yīng)用于對臨床疾病的治療是可行且安全的，且可以通過這種方法來實現(xiàn)快速獲取大量MSCs的要求。微重力還能通過減少MSCs細(xì)胞骨架的收縮性而降低其增殖能力[37]，同時通過使細(xì)胞骨架纖維重組而增強(qiáng)了MSCs的分化潛能。因而從這個角度看，在微重力環(huán)境中培養(yǎng)的MSCs致瘤性可能會降低。但同時，有研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠骨髓MSCs在模擬微重力環(huán)境下暴露14 d，腫瘤發(fā)生特異性基因表達(dá)會上調(diào)[38]。因此，微重力環(huán)境對MSCs致瘤性的影響還需要進(jìn)一步的驗證。

5 模擬微重力培養(yǎng)對MSCs多向分化潛能的影響

MSCs是一種典型的多能干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化能力，在適宜的條件下，可以分化為多種類型細(xì)胞，但MSCs在體外增殖的傳代次數(shù)是有限的，傳代次數(shù)過多會導(dǎo)致MSCs進(jìn)入衰老狀態(tài)[39]，最終影響MSCs的生物學(xué)特性，使其多向分化能力與治療潛力減弱[40]。最近研究證實，老化是限制MSCs作為標(biāo)準(zhǔn)化臨床產(chǎn)品的功能和治療特性的重要因素[41]，這將對推進(jìn)MSCs在臨床上的應(yīng)用造成巨大阻礙。

早已有研究證明，模擬微重力條件可以維持MSCs的多向分化潛能，例如，將小鼠MSCs和hMSCs分別在正常重力與微重力條件下培養(yǎng)7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微重力培養(yǎng)組的MSCs維持未分化狀態(tài)，而正常重力培養(yǎng)組的MSCs則出現(xiàn)了分化；另一項實驗將hMSCs在模擬微重力條件下培養(yǎng)3 d也得到相同結(jié)論[36]，推測這是由于微重力減慢了細(xì)胞周期、降低細(xì)胞代謝及線粒體活性，這使得MSCs進(jìn)入了類似冬眠的狀態(tài)，從而維持未分化狀態(tài)并提高了存活率。在模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)15 d的hMSCs干性標(biāo)志物POU5F1和Nanog的表達(dá)高于在常規(guī)重力條件下生長的細(xì)胞，而在正常重力中的hMSCs多能水平逐漸下降。到第三代時，模擬微重力條件下培養(yǎng)的hMSCs中POU5F1和Nanog的相對表達(dá)量是正常重力條件下培養(yǎng)的hMSCs的2.3倍和2.1倍[35]。同時，在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下，微重力還能影響MSCs的分化傾向。模擬微重力會抑制MSCs向力敏感細(xì)胞(如成骨細(xì)胞)分化，促進(jìn)向力不敏感細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞)分化[42]。這是因為微重力環(huán)境導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架變化，從而抑制了轉(zhuǎn)錄共激活因子與PDZ結(jié)合基序(TAZ)的核聚集，而這一步驟對于MSCs的成骨分化是必不可少的。模擬微重力條件下，hMSCs不表達(dá)堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白和骨連接素等成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白，成骨分化因子Runx2被抑制，與軟骨形成相關(guān)的Ⅱ型膠原蛋白a1顯著降低[43]。有研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力可以促進(jìn)MSCs向神經(jīng)元的分化。與正常重力對照組相比，在微重力條件下，由AD-MSCs分化的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)更多微管相關(guān)蛋白-2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和突觸素蛋白，并且對細(xì)胞的生存能力未發(fā)現(xiàn)不利影響[44]。因此，推測用模擬微重力處理過的MSCs作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的材料，效果可能更佳。研究還發(fā)現(xiàn)，模擬微重力可通過抑制ERK/β-catenin信號通路抑制MSCs的表皮成纖維細(xì)胞分化[45]，真皮成纖維細(xì)胞可以參與受損皮膚的修復(fù)，推斷微重力條件可通過干預(yù)ERK/β-catenin信號通路來促進(jìn)MSCs修復(fù)皮膚損傷。因此，微重力可維持MSCs的分化潛能并調(diào)控其分化傾向。

6 結(jié)束語

干細(xì)胞移植是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向，而MSCs的諸多生物學(xué)特性符合干細(xì)胞療法和組織工程的應(yīng)用要求。但是，體外培養(yǎng)的MSCs生物學(xué)特性的變化為其在這一領(lǐng)域的應(yīng)用增加了不確定性，影響了其在臨床應(yīng)用的安全性和有效性。已有多項研究結(jié)果顯示，將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于不同微重力環(huán)境中能夠有效維持MSCs的生物學(xué)特性。盡管各國已開展多項模擬微重力培養(yǎng)MSCs的研究，但任何細(xì)微的差異都可能導(dǎo)致結(jié)果千差萬別，因此，將來還需制定更加科學(xué)合理的培養(yǎng)方案、創(chuàng)新技術(shù)儀器和更精準(zhǔn)的監(jiān)測體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境的方法[46]，闡明這些變化背后的機(jī)制，才能充分利用微重力培養(yǎng)的優(yōu)勢，使MSCs在臨床治療中取得更好的效果。