王小亮，曹 歡，王 姝，呂曉楠，王靜波，張 文，王 澎，徐立蒲

(北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176)

碘泡蟲是黏孢子蟲中最大的類群，全世界已報(bào)道的有850余種，中國記錄的有320多種，其中寄生于鯽(C.arassius)的碘泡蟲最多，有50余種[3]。碘泡蟲可寄生于魚類和兩棲類的各類組織中，有些種具有宿主或組織特異性，在寄主組織大量寄生時(shí)可引起嚴(yán)重的疾病。以往對碘泡蟲的研究主要圍繞其在經(jīng)濟(jì)魚類的危害，分析碘泡蟲的寄生部位，描述造成的癥狀，并通過形態(tài)學(xué)特征對其進(jìn)行分類研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，分子鑒定方法為碘泡蟲的分類鑒定提供了重要補(bǔ)充，并為碘泡蟲的中間宿主生活階段研究和新種的發(fā)現(xiàn)提供了便捷方法。已報(bào)道的感染金魚的碘泡蟲種類有異樣碘泡蟲(M.diversus)[4]、洪湖碘泡蟲(M.honghuensis)[5]、晶殼縫碘泡蟲(M.lentisuturalis)[6]、卡特碘泡蟲(M.cultus)[6]、紅河碘泡蟲(M.hoabinhensis)[7]、吳李碘泡蟲(M.wulii)[8]和關(guān)橋碘泡蟲(M.gua-nqiaoensis)[9]等。2021年9月，在北京市通州區(qū)相鄰的兩家觀賞魚養(yǎng)殖場發(fā)生孢子蟲病，感染部位分別為肝胰臟和肌肉。為鑒定病原種類，通過采集樣品，利用形態(tài)學(xué)特征和18S rDNA等方法進(jìn)行鑒定，明確金魚所感染的孢子蟲種類，旨在豐富金魚孢子蟲病的資料。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)金魚

2021年9月，取北京市通州區(qū)兩家相鄰觀賞魚養(yǎng)殖場的發(fā)病金魚樣品，其中一家金魚品種名稱為鎏金，病魚頭背部呈瘤狀隆起，樣品編號為BTXD210907；另一家金魚品種名稱為草金魚，腹部膨大，樣品編號為BTXL210907。病魚體長均約10 cm、體質(zhì)量約40 g，采樣時(shí)水溫約21 ℃、溶解氧濃度為7.5 mg/L、pH為8.1。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和保存

樣品(BTXD210907和BTXL210907)金魚解剖后，肉眼觀察各組織白色包囊存在的情況，然后制作鰓絲、肌肉瘤狀隆起組織、肝胰臟、腎、脾、性腺等組織的水封片進(jìn)行孢子蟲鏡檢。觀察到孢子蟲的樣品組織，BTXD210907樣品取肌肉瘤狀隆起流出液及周邊肌肉組織；BTXL210907樣品取肝胰臟組織，勻漿后添加95%乙醇進(jìn)行固定，固定后的樣品組織均于-20 ℃保存。

1.2.2 孢子蟲形態(tài)學(xué)觀察和形狀測量

取95%乙醇固定的樣品(BTXD210907和BTXL210907)，制作水封片，置于ZEISS AxioLab.A1顯微鏡下觀察孢子蟲形態(tài)，采用ZEN 2.3圖像軟件拍照，測量孢子蟲長(Spore length，SL)、孢子蟲寬(Spore width，SW)、孢子蟲厚度(Sporozoite thickness，ST)、極囊長(Polar capsule length，PCL)、極囊寬(Polar capsule width，PCW)，以及確定極絲圈數(shù)(Polar filament coil，PFC)，每個樣品測量20個蟲體。

1.2.3 孢子蟲18S rDNA的克隆與測序

1)DNA提取

分別取95%乙醇固定的樣品(BTXD210907和BTXL210907)20 μL，用500 μL超純水充分沖洗，再以5 000 r/min離心5 min，舍棄上清液，重復(fù)3次。采用DNeasy Blood &Tissue Kit (Qiagen，德國)試劑盒，按照說明書抽提基因組DNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)PCR擴(kuò)增

用于擴(kuò)增18S rDNA的引物參考Andree K B等[10]設(shè)計(jì)的碘泡蟲屬的通用引物For：5’-CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT-3’、Rev：5’-CCAGGACATCTTAGGGCATCACAGA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR反應(yīng)體系組成：2×Taq PCR Mix 25 μL、25 μmol/L上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測定。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

將測序樣品(BTXD210907和BTXL210907)的18S rDNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得基因登錄號。同時(shí)，將兩條序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，從中選取與所獲序列同源性較高的同種蟲的18S rDNA基因序列，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得相關(guān)屬的18S rDNA序列，利用MEGA 4.0、鄰位連接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)集1 000次。以武漢單極蟲的18S rDNA序列為外源序列。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品(BTXD210907和BTXL210907)的孢子蟲長、寬和極囊長、寬的測量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析兩樣品之間及大、小極囊之間的差異，以P<0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚臨床癥狀

發(fā)病金魚均出現(xiàn)不攝食、打蔫、離群獨(dú)游等行為特征。發(fā)病的鎏金(BTXD210907)頭背部兩側(cè)有一對瘤狀大囊泡(圖1A)，剪開后流出白色黏稠液，肌肉組織糜爛成糊狀，制備的組織水浸片鏡下可見包囊和大量的孢子蟲(圖2)；肝胰臟部分呈白色，取該組織制作水浸片，在顯微鏡下可見包囊和大量孢子蟲；其他組織未見包囊和孢子蟲。發(fā)病的草金魚(BTXL210907)腹部膨大，解剖后見肝胰臟呈灰白色、體積嚴(yán)重增大(圖1B)，制備的組織水浸片鏡下可見有包囊和大量孢子蟲(圖3)，鰓和其他內(nèi)臟組織未見包囊和孢子蟲。

2.2 孢子蟲形態(tài)特征分析

在顯微鏡下觀察樣品孢子蟲，可見孢子蟲殼面觀呈梨形，前端略尖，后端鈍圓；擁有2個大小略有差異的極囊，位于蟲體前端，呈“八”字形排列(圖4)。樣品BTXD210907的孢子蟲平均長為(17.58±0.85)μm、平均寬為(11.02±0.58)μm、平均厚為(8.68±0.42)μm，大極囊平均長為(8.82±0.48)μm、平均寬為(3.88±0.27)μm，小極囊平均長為(8.35±0.48)μm、平均寬為(3.83±0.25)μm，極絲圈數(shù)為7～9圈；樣品BTXL210907的孢子蟲平均長為(18.09±0.54)μm、平均寬為(11.82±0.44)μm、平均厚為(8.82±0.52)μm，大極囊平均長為(8.25±0.16)μm、平均寬為(3.92±0.26)μm，小極囊平均長為(7.95±0.31)μm、平均寬為(3.53±0.26)μm，極絲圈數(shù)為7～9圈(表1)。經(jīng)單因素方差分析兩樣品的孢子蟲在蟲體長、蟲體寬、極囊長和極囊寬上的差異均不顯著(P>0.05)，同一樣品的大極囊長和寬與小極囊的差異均也不顯著(P>0.05)。

表1 感染金魚組織的孢子蟲形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of Myxobolus spp. isolated from diseased goldfish

注：A為光學(xué)顯微鏡下孢子蟲的形態(tài)(1 000×)；B為單孢子經(jīng)數(shù)碼放大的形態(tài)。Notes:A.Spore morphology under a light microscope(1 000×);B.A spore magnified by a digital zoom.

2.3 孢子蟲18S rDNA基因分析

將樣品(BTXD210907和BTXL210907)測序的孢子蟲18S rDNA片段提交至GenBank，獲得的登錄號分別為OR133488和OR133489。經(jīng)Blast同源性檢索，兩株孢子蟲18S rDNA 序列與吳李碘泡蟲的同源性最高，達(dá)99%以上；與塔形碘泡蟲(M.pyramidis)的同源性約94%；與洪湖碘泡蟲和瓶囊碘泡蟲(M.ampullicapsulatus)的同源性約92%。系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示，兩株孢子蟲均與吳李碘泡蟲聚為一枝，如圖5所示。因此，確認(rèn)北京市通州區(qū)兩家相鄰觀賞魚養(yǎng)殖場的金魚發(fā)生的孢子蟲病的病原為吳李碘泡蟲。

3 討論

3.1 碘泡蟲的形態(tài)特征與分類鑒定

碘泡蟲種類繁多、種間結(jié)構(gòu)相似，孢子蟲的形態(tài)特征與寄生組織專一性易受到寄生宿主品種不同和環(huán)境差異的影響。在沒有分子生物學(xué)數(shù)據(jù)佐證的前提下，僅依靠形態(tài)學(xué)特征、寄生宿主或寄生部位以及發(fā)病癥狀，不足以確診病原。例如，先前的研究認(rèn)為寄生于中國金魚鰓和肝胰臟的吳李碘泡蟲、寄生于異育銀鯽的關(guān)橋碘泡蟲以及寄生于日本金魚鰓的碘泡蟲未定種形態(tài)特征相同，但因宿主或寄生部位的不同而被定為3個不同的種。隨后，2009年Zhang J Y等[9]通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)證實(shí)三者均為吳李碘泡蟲。本研究中寄生于金魚肌肉的孢子蟲和寄生于金魚肝胰臟的孢子蟲與Zhang J Y等[9]報(bào)道的吳李碘泡蟲的形態(tài)特征相似，與日本金魚(C.auratusauratus)肝胰臟來源株[9]、湖北異育銀鯽(C.auratusgibelio)肝胰臟來源株[9]和重慶鯽(C.auratusauratus)鰓來源株[11]在形態(tài)度量上存在一定的差異(表2)。因此，還應(yīng)考慮利用分子生物學(xué)技術(shù)等分類方法進(jìn)行佐證[12]，必要時(shí)分子生物學(xué)方法需同時(shí)采用多個基因[13]。本研究中，兩株孢子蟲的18S rDNA序列均與吳李碘泡蟲的同源，相似性達(dá)99%以上；構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，其與吳李碘泡蟲聚為一枝，因此結(jié)合形態(tài)特征，可以確定這兩株孢子蟲均為吳李碘泡蟲。2019年，楊承忠等[11]通過比較長江流域吳李碘泡蟲的三大地理株系，發(fā)現(xiàn)各地理株系在形態(tài)量度上存在一定的差異，但從分子水平上看，均為種內(nèi)水平的形態(tài)變異，認(rèn)為吳李碘泡蟲的種內(nèi)形態(tài)度量差異可能與地理環(huán)境、宿主種類及感染部位有關(guān)。本文也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

3.2 吳李碘泡蟲的寄生部位

已有學(xué)者證實(shí)吳李碘泡蟲可寄生于金魚的鰓、肝、肝胰臟、脾和腹腔[9]。本次從樣品BTXD210907金魚的背部肌肉檢測到吳李碘泡蟲，其系統(tǒng)發(fā)育樹與已報(bào)道的肝胰臟寄生株聚為一枝，而鰓寄生株(GenBank登錄號為MH920541和MH920542)在另一枝；同時(shí)，在該樣品的肝胰臟也檢測到蟲株，而肝胰臟的位置在空間上與頭背部肌肉較近。這表明寄生于金魚肌肉的吳李碘泡蟲可能是寄生于其肝胰臟的蟲株不斷適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果。結(jié)合已報(bào)道的吳李碘泡蟲在金魚的寄生部位，進(jìn)一步說明吳李碘泡蟲不具有寄生組織專一性的特點(diǎn)。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道，碘泡蟲屬的其他種也可寄生于金魚肌肉，如Caffara M等[6]發(fā)現(xiàn)晶殼縫碘泡蟲可寄生于金魚頭背部肌肉并形成瘤狀泡；Chinh N N等[7]在野生金魚的軀干肌肉中檢測出紅河碘泡蟲。但至今未見吳李碘泡蟲寄生于鯽或金魚肌肉的報(bào)道，因此本文發(fā)現(xiàn)的吳李碘泡蟲寄生于金魚肌肉屬首次報(bào)道，這豐富了吳李碘泡蟲在金魚寄生部位的數(shù)據(jù)資料。

4 碘泡蟲的防治建議

在碘泡蟲防治方面，碘泡蟲等黏孢子蟲類的體表被有幾丁質(zhì)殼片，藥物不易滲透，耐藥力很強(qiáng)，因此目前還未發(fā)現(xiàn)治療黏孢子蟲病的特效藥物。陳昌福等[14]曾分別試驗(yàn)了有效成分為阿苯達(dá)唑、地克珠利、敵百蟲、鹽酸氯苯胍、左旋咪唑、檳榔粉、百部粉和孢蟲凈等商品藥物對異育銀鯽黏孢子蟲的治療效果，但沒有一種藥物對治療有效。本文采用國家許可水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用的地克珠利進(jìn)行治療，拌餌用藥每月連用7 d，持續(xù)半年，并配合及時(shí)撈走病魚等措施，取得較好的效果。高志鵬[15]分別采用桉樹油、鹽酸氯苯胍、敵百蟲、青蒿素、牛至油、百里香酚、香芹酚進(jìn)行體外殺滅洪湖碘泡蟲試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桉樹油、青蒿素、敵百蟲對洪湖碘泡蟲的存活率沒有影響，鹽酸氯苯胍具有一定的殺滅作用，牛至油及其兩種主要成分香芹酚和百里香酚都具有較好的殺蟲效果，其中以香芹酚殺蟲效果最好，這為快速治療孢子蟲病提供了可能。