于志君，王李寶，史文軍，黎慧，胡潤豪，趙然，沈輝，管小平，萬夕和

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；3.伊犁悅?cè)簧鷳B(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，新疆 伊犁 835300）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）最早發(fā)現(xiàn)于泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）中，是寄生在對蝦肝小管上皮細胞內(nèi)[1-3]的微孢子蟲。近年來，EHP 感染南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）的報道越來越多，可引起南美白對蝦生長緩慢，規(guī)格不齊，嚴重影響南美白對蝦養(yǎng)殖效益。微孢子蟲含有一個由錨定盤、極質(zhì)體和單個極管組成的獨特侵染器官——極管[4]，侵染過程從孢子萌發(fā)開始，然后極管外翻彈出，刺穿宿主細胞膜，最后將孢原質(zhì)注射到靶細胞中[5]。極管作為一種獨特的侵染結(jié)構(gòu)，在EHP 感染宿主的過程中起到輸送孢原質(zhì)的重要作用。探究極管蛋白的生物學(xué)特性、挖掘潛在的極管蛋白類型對于分析蝦肝腸胞蟲入侵機制具有重要意義。1894 年，Thelohan 描述了微孢子蟲極管特點及其釋放過程[6]。目前已有6 種不同的極管蛋白（PTP1-PTP6）被鑒定為微孢子蟲極管的主要成分[7-11]?？寺『桶被岱治霰砻鳎紭O管總蛋白70%的PTP1 具有高強度的張力和彈性，有利于極管的彈出以及孢原質(zhì)的輸送[8,12]。雖然不同種屬微孢子蟲的PTP2 擁有差異較大的氨基酸序列，但它們具有相似的等電點、高含量的賴氨酸和高度保守的半胱氨酸位點[13]。利用免疫篩選技術(shù)從Encephalitozoon cuniculi cDNA 文庫中鑒定到了第三種極管蛋白（PTP3）。該蛋白可以與前兩種蛋白形成復(fù)合體相互作用。利用蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)篩選鑒定到第四個極管蛋白-PTP4。在篩選E.cuniculi 基因組序列時發(fā)現(xiàn)了編碼另外一個極管蛋白（PTP5）的基因。該基因與編碼PTP4 的基因序列相似，與PTP4 定位于同一個染色體形成了一個新的基因簇。最近，LV等[11]又在家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種可與宿主細胞表面結(jié)合的新的極管蛋白—PTP6。迄今為止，對于家蠶微孢子蟲極管蛋白的研究已經(jīng)非常成熟，鑒定了6 種極管蛋白。對于蝦肝腸胞蟲極管蛋白的研究鮮有報道，只鑒定到了一種極管蛋白-EHPPTP2 的序列。本研究通過克隆南美白對蝦蝦肝腸胞蟲極管蛋白3（EHPPTP3）基因，對其進行了生物信息學(xué)分析，通過原核表達獲得重組蛋白制備多抗，免疫熒光試驗驗證了EHPPTP3 的存在，為進一步探明極管蛋白在EHP 侵染宿主過程中的作用機制提供新的線索和思路，同時為EHP 的檢測以及蝦肝腸胞蟲病的預(yù)防和治療提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

EHP-NMB2019011 株（實驗室命名）從江蘇如東患病南美白對蝦中分離獲得，原核表達載體選用蘇州強耀生物科技有限公司的pET-28a（+），超敏型辣根過氧化氫酶DAB 顯色試劑盒和總RNA 快速提取試劑盒購自TaKaRa 公司，蛋白質(zhì)Marker 和相關(guān)免疫熒光染料購自賽默飛（Thermofisher）公司。其他試劑參照LV 等所用試劑[11-14]。

1.2 總RNA 提取和cDNA 第一鏈合成

使用總RNA 快速提取試劑盒提取樣品總RNA；再使用cDNA 第一鏈合成試劑盒（上海生工）進行反轉(zhuǎn)錄，所制得cDNA 于-20 ℃儲存，為后續(xù)PTP3 基因克隆備用。

1.3 PTP3 基因克隆

1.3.1 PTP3 基因cDNA中間片段克隆及RACE 實驗

以蝦肝腸胞蟲全基因組（GenBank 登錄號：GCA_023079535.1）[15]中A0755 基因中630～4 000 bp序列為模板，設(shè)計PTP3 核心序列引物MF/MR（表1）進行中間片段克隆。產(chǎn)物經(jīng)測序驗證后，按照孫金秋等（2020）所述方法[16]，設(shè)計特異性引物用于5’端和3’端的RACE 實驗（表1）。反應(yīng)完成后，進行電泳驗證，克隆測序以及序列拼接，獲得PTP3 基因的完整序列。

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used in the experiment

1.3.2 PTP3 基因核心區(qū)段的克隆及原核表達

以PTP3 核心序列的部分區(qū)段（909 bp）為模板，使用Primer 5 軟件設(shè)計克隆引物（PTP3F/R）構(gòu)建PTP3 原核表達載體，所得產(chǎn)物于4 ℃保存。然后用BamH I、Xho I 和pET28a 進行雙酶切和載體構(gòu)建，并進行感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化和陽性克隆檢測[17]，送上海生工測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫和不同的軟件（表2）對EHP PTP3相關(guān)數(shù)據(jù)進行不同層次的生物信息學(xué)分析。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Tab.2 Bioinformatics analysis software

1.5 EHP PTP3 基因編碼蛋白誘導(dǎo)表達及純化

取重組載體pET28a-PTP3 轉(zhuǎn)化入Rosetta（DE3）感受態(tài)中，結(jié)合李孝良等[18]方法挑取單克隆進行后續(xù)誘導(dǎo)表達純化。利用LB 培養(yǎng)基和ITPG 進行誘導(dǎo)表達，并通過破菌緩沖液和NTA 層析柱進行超聲破菌和純化。最后利用凝膠電泳檢測所收集的不同組別的成分，合并符合目標蛋白的成分并進行超濾濃縮。

1.6 多克隆抗體制備

純化的原核表達PTP3 蛋白作為免疫抗原，分裝保存于4 ℃。第1 d，混合Freund adjuvant 和抗原（1 mL∶1 mL），乳化后注射到頸后部位，免疫2 只新西蘭白兔。按照2 周時間間隔進行4 次免疫，每次免疫完成后第10 d 從兔耳緣靜脈采集1 mL 血液，檢測效價。經(jīng)檢測確認后，再采兔頸動脈全血靜置過夜后，離心（4 ℃，10 000 r/min）30 min 取多抗血清，分裝并在-20 ℃下保存。

1.7 抗體效價測定

用碳酸鹽包被緩沖液（CBS）將EHPPTP3 蛋白（抗原）稀釋至1 μg/mL，以每孔100 μL 的量加入酶標板，4 ℃過夜。24 h 后丟棄涂層溶液，在每孔加入200 μL 密封溶液（5%脫脂奶粉），37 ℃放置90 min。按照ELISA 試劑盒的操作步驟進行實驗，最后加入終止液：每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，終止反應(yīng)。參照李孝良等[17]用酶標儀和比對公式計算出該抗體效價。

1.8 Western blotting 分析

分別取經(jīng)PCR 檢測驗證[5]后的感染EHP 和未感染EHP 的南美白對蝦肝胰腺組織、純化的EHP孢子懸液（1 mL）。用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，5 000 r/min 離心5 min，棄上清[18]。重懸沉淀后（400 μL PBS），加入Sigma 酸洗玻璃珠0.4 g（425～600 μm）和適量蛋白酶抑制劑PMSF，4 800 r/min 破碎6 次，每次60 s。用0.125 mol/L Tris-HCl，5%SDS，50%甘油和5%β-巰基乙醇配制適量的樣品緩沖液，取300 μL 充分混勻并在4 ℃孵育6 h。離心10 min（4 ℃，12 000 r/min）所得上清就是EHP 總蛋白[19,20]。通過電泳（12%SDS-PAGE）把總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用3%BSA 室溫封閉1 h，按1∶15 000 稀釋（V∶V）的PTP3 抗血清與PVDF 膜在4 ℃孵育過夜[16]。PBST 洗滌產(chǎn)物3 次后，利用超敏型HRP DAB 試劑盒進行顯色反應(yīng)。

1.9 免疫熒光實驗

用載玻片把感染EHP 的蝦肝胰腺組織固定，用磷酸鹽緩沖溶液（1×PBS）清洗3 次（5 min/次）；滴加封閉液覆蓋組織，放入37 ℃水浴箱，封閉45 min；把封閉液小心倒出并加入一抗（EHP 多抗）4 ℃過夜；重復(fù)洗滌一抗3 次后避光孵熒光二抗，AlexaFlour488 和Cy3 按照1∶400 稀釋標記二抗后，室溫避光孵育2 h；最后洗去二抗，避光封片，記錄實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 EHPPTP3 鑒定及序列結(jié)構(gòu)特征分析

2.1.1 目的基因鑒定

克隆得到的EHPPTP3 序列全長為4 030 bp，CDS 區(qū)長度為3 390 bp，兩端均存在UTR。其中，5’UTR 長度為345 bp，3’UTR 長度為294 bp。將此序列提交至NCBI 進行Blastx，比對出1 個EHPPTP3的氨基酸序列（GenBank 登錄號：OQS53455.1）。將此序列上傳至GenBank 獲得登錄號為ON206665。

2.1.2 序列比對分析

將獲取的序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的3 個不同種屬PTP3 序列（蝦肝腸胞蟲PTP3，GenBank 登錄號：OQS53455.1；兔腦炎微孢子蟲PTP3，GenBank 登錄號：AGW15357.1 和家蠶微孢子蟲PTP3，GenBank登錄號：AEF33802.1）進行多序列比對。結(jié)果顯示，EHPPTP3 與蝦肝腸胞蟲PTP3 序列相似度（identity percent）極高，為97.95%；與其他微孢子蟲PTP3 之間的氨基酸序列相似度較低，均低于21%（圖1-A）；通過NCBI 的Batch CD-Search 工具，發(fā)現(xiàn)其中家蠶微孢子蟲PTP3（GenBank 登錄號：AEF 33802.1）存在保守結(jié)構(gòu)域。后續(xù)從NCBI 數(shù)據(jù)庫中選擇多個不同種屬PTP3 序列，采用Neighbor-joining 法來構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，建樹的bootstrap 取值為1 000 個重復(fù)。進化樹結(jié)果顯示，EHPPTP3 與蝦肝腸胞蟲PTP3 序列聚為一支，再次印證了本研究中的EHPPTP3 與OQS53455.1 親緣關(guān)系較近，而與其他微孢子蟲PTP3 親緣關(guān)系較遠（圖1-B）。

圖1 氨基酸序列比對（A）和系統(tǒng)發(fā)育樹（B）Fig.1 Amino acid sequence alignment（A）and phylogenetic tree（B）

2.1.3 編碼氨基酸序列的N-糖基化位點和磷酸化位點以及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

EHPPTP3 由1 130 個氨基酸組成，預(yù)測分子質(zhì)量為125 kD，等電點為4.84，無信號肽區(qū)域。預(yù)測具有13 個潛在的N-糖基化位點和558 個O-糖基化位點（圖2）。

圖2 EHPPTP3 蛋白的N-糖基化位點預(yù)測Fig.2 Prediction of N-glycosylation site in EHPPTP3 protein

磷酸化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸磷酸化位點分別有71 個、37 個和9 個（圖3）。

圖3 EHPPTP3 蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.3 Phosphorylation site prediction of EHPPTP3 protein

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，α 螺旋占41.77%，延伸鏈占12.48%，無規(guī)卷曲占39.29%，而β 轉(zhuǎn)角占6.46%。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，EHPPTP3 主要有α 螺旋和無規(guī)卷曲，結(jié)構(gòu)較為簡單（圖4）。

圖4 EHPPTP3 蛋白序列的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Tertiary structure prediction of EHPPTP3 protein sequence

2.2 PTP3 的克隆與原核表達載體的鑒定

用PCR 方式克隆EHPPTP 基因的部分片段，獲得一條符合預(yù)期目標的909 bp 條帶，預(yù)測蛋白分子量為33.5 kD（圖5）。參考李孝良等（2017）方法[17]，將pET28a 與擴增產(chǎn)物連接，進行原核表達載體的鑒定。測序比對結(jié)果表明，未出現(xiàn)堿基突變，原核表達載體構(gòu)建成功。

圖5 pET28a 質(zhì)粒雙酶切圖及重組質(zhì)粒pET28a-PTP3 的酶切產(chǎn)物圖Fig.5 Electrophoretogram of double enzyme digestion of pET28a and double enzyme digestion analysis of pET28a-PTP3 recombinant plasmid

2.3 EHPPTP3 基因蛋白的誘導(dǎo)表達、純化與鑒定

SDS-PAGE 檢測經(jīng)超聲波處理和誘導(dǎo)表達的菌體（0.5 mmol/L ITPG 20 ℃誘導(dǎo)12 h）上清液和沉淀。上清液中含有接近目標蛋白質(zhì)大小的條帶（圖6），說明EHPPTP3 蛋白的存在形式主要為可溶性物質(zhì)。

圖6 EHPPTP3 蛋白表達的SDS-PAGE 檢測Fig.6 SDS-PAGE detection of expression of EHPPTP3 protein

對EHPPTP3 蛋白進行大量誘導(dǎo)表達，超聲波破碎、離心后，選擇上清液，利用NTA 層析柱純化目的蛋白。咪唑濃度梯度洗脫后，挑取高純度部分合并，超濾濃縮。最終獲得高純度PTP3 蛋白，大小約43 kD，符合理論值（圖7）。Western blot（WB）檢測后確定純化蛋白為目的PTP3 蛋白（圖8）。

圖7 不同咪唑濃度下EHPPTP3 蛋白表達的SDS-PAGE檢測Fig.7 SDS-PAGE detection of expression of EHPPTP3 protein in different imidazole concentrations

圖8 純化蛋白的WB 檢測Fig.8 Western blot analysis of purified protein

2.4 EHPPTP3 多克隆抗體的驗證

免疫印跡法驗證PTP3 多抗的特異性結(jié)果顯示，被EHP 感染組織和純化到的EHP 孢子懸液中與健康組織相比均獲得更為明顯的PTP3 目標條帶（圖9），說明制備的PTP3 多抗特異性良好。

圖9 EHPPTP3 多克隆抗體驗證Fig.9 Verification of EHPPTP3 polyclonal antibody

2.5 免疫熒光試驗

為驗證EHPPTP3 是否為蝦肝腸胞蟲極管蛋白，將感染EHP 的蝦肝胰腺組織固定封閉加入一抗二抗孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用EHPPTP3 多克隆抗體開展的免疫熒光試驗成功捕獲了肝腸胞蟲在侵染過程中極管的彈出狀態(tài)，離EHP 頂端不遠處存在強紅色熒光分布（圖10）。EHPPTP3 多抗特異性識別極管表面的抗原表明可引起免疫反應(yīng)。該結(jié)果證實EHPPTP3 天然蛋白在蝦肝腸胞蟲彈出的極管上真實存在，是新鑒定出的蝦肝腸胞蟲極管蛋白，確認了EHPPTP3 的存在。

3 討論

EHP 主要寄生在南美白對蝦、斑節(jié)對蝦等肝胰腺中，盡管它并非致命性病原，但傳染性很強，可在蝦池中通過水平傳播和垂直傳播，導(dǎo)致對蝦生長滯緩，經(jīng)濟損失嚴重[21-24]。EHP 屬于腸胞蟲科，與畢氏腸微孢子蟲的Small Subunit rRNA 基因有84%的一致性[1]。和其他微孢子蟲一樣，EHP 生活史也涉及感染性孢子的萌發(fā)、增殖和成熟、釋放[21,25]。在孢子萌發(fā)階段，EHP 產(chǎn)生單核的0.7 μm×1.1 μm 卵圓形孢子母細胞，孢子內(nèi)含4～6 圈極絲等其他結(jié)構(gòu)[1]。在一定的環(huán)境刺激下，極絲可被擠壓彈出，此時其為極管。

極管作為獨特的侵染器官，可以把孢原質(zhì)透過細胞膜傳遞到宿主細胞[26]。本文對于EHPPTP3 的研究，可以更好地分析極管蛋白的組成以及進一步探索微孢子蟲的感染機制。目前已經(jīng)報道有6 種不同的極管蛋白（PTP1-PTP6）被鑒定為微孢子蟲極管的主要成分[7-11]。其中，Peuvel 等[10]利用免疫篩選技術(shù)從Encephalitozoon cuniculi cDNA 文庫中鑒定到了第三種極管蛋白（PTP3），而本文則通過同源性比對篩選到了蝦肝腸胞蟲極管蛋白3 的序列，利用序列分析和定位特征初步鑒定了蝦肝腸胞蟲極管蛋白3。

3.1 EHPPTP3 的序列特征

序列特征分析表明，本研究獲得的極管蛋白3與王禮君[27]所鑒定的EHPPTP2 相似，具有高比例的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點，可以變構(gòu)蛋白質(zhì)以及激活蛋白的活力；不同的是：該極管蛋白3 不具有N 端信號肽，其或許并不發(fā)揮引導(dǎo)蛋白質(zhì)的功能，因為蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的運輸往往需要信號肽的指引。本研究中的PTP3 具有較多的酪氨酸磷酸化位點，與Peuvel 等[10]篩選到的Encephalitozoon cuniculi PTP3 相同。它的功能是變構(gòu)并激活蛋白，更重要的是提供一個結(jié)構(gòu)基因，以促進和其他蛋白質(zhì)相互作用而形成多蛋白復(fù)合體[28,29]。該蛋白的氨基酸數(shù)目為1 130 個，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為125 kD，磷酸化位點等方面均符合極管蛋白3 的保守特征。值得注意的是，該蛋白具有許多潛在的糖基化位點，作為一種最常見的蛋白翻譯后修飾，這些位點的糖基化可以讓一些多肽改變構(gòu)象，也可使蛋白增強穩(wěn)定性。因此本文推測，該蛋白是蝦肝腸胞蟲極管蛋白3，且或許可與PTP1-2 形成復(fù)合體，并發(fā)生相互作用。

3.2 EHPPTP3 的定位特征

Western blot 實驗結(jié)果表明，制備的PTP3 多克隆抗體可以在被EHP 感染組織和純化到的EHP 孢子懸液中表達，產(chǎn)生陽性條帶，具有良好的特異性（圖9）。定位特征分析表明，利用制備的EHPPTP3多克隆抗體進一步開展的免疫熒光試驗，成功捕獲了肝腸胞蟲在侵染過程中極管的彈出狀態(tài)（圖10），表明了EHPPTP3 多抗可以特異地識別極管表面的抗原并與之發(fā)生免疫反應(yīng)，揭示了極管蛋白3 定位于EHP 的整根極管上（紅色熒光），證明它是在EHP 上鑒定出的一種新的極管蛋白——蝦肝腸胞蟲極管蛋白3（EHPPTP3），為EHP 的檢測以及蝦肝腸胞蟲病的預(yù)防和治療提供新的靶標。

3.3 結(jié)論

本研究通過同源性比對發(fā)現(xiàn)了南美白對蝦肝腸胞蟲極管蛋白3 的序列，并利用相關(guān)生信分析軟件分析了其序列，闡述了其分子量、氨基酸組成、信號肽、糖基化和磷酸化位點等特征?？寺〉搅薖TP3基因，成功構(gòu)建了PTP3 的原核表達載體pET28a-PTP3，通過誘導(dǎo)表達和純化獲得了大量PTP3 蛋白，并通過免疫新西蘭白兔制備了特異性較好的PTP3多克隆抗體；利用SDS-PAGE 和Western blot 實驗分析了目的基因原核表達蛋白的表達特征，驗證了PTP3 多克隆抗體的特異性。利用EHPPTP3 多克隆抗體開展免疫熒光試驗，成功捕獲肝腸胞蟲在侵染過程中極管的彈出狀態(tài)，揭示PTP3 在南美白對蝦肝腸胞蟲上的定位特征。綜合以上PTP3 的序列特征，蛋白表達特征，多抗特異性以及定位特征證實PTP3 即為EHP 極管蛋白3（EHPPTP3），是蝦肝腸胞蟲中鑒定出的一種新的極管蛋白。