陳麗珍，楊雷，許錦文

1. 上海中醫(yī)藥大學，上海 201203；2. 浦江縣中醫(yī)院內(nèi)二科，浙江 浦江 322200

射血分數(shù)保留型心衰（HFPEF）已成為心力衰竭的主要形式，隨著人口的老齡化以及肥胖、糖尿病和高血壓患病率的增加，其患病率正在迅速增長[1]。心室重塑和舒張功能障礙是HFPEF 的標志，其特征是左心室肥大，硬度升高和充盈壓增加，微血管內(nèi)皮炎癥也是影響HFPEF 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制。HFPEF 患者的心功能和生活質(zhì)量嚴重受損，而且目前缺乏可以有效降低其發(fā)病率或死亡率的治療方法[2]。淫羊藿苷（ICA）是中藥淫羊藿的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、心臟保護等多種藥理作用[3]。ICA 通過抑制氧化應(yīng)激誘導的炎癥、細胞凋亡，顯著改善異丙腎上腺素誘導Wistar 大鼠的心力衰竭[4]。ICA 通過Apelin/Sirt3 途徑預防線粒體功能障礙，從而減弱糖尿病心肌病的發(fā)展[5]。ICA 通過調(diào)節(jié)CD147/MMP-9 通路影響心肌梗死后的心臟重塑[6]。 研究表明， 一氧化氮（NO）- 環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）-蛋白激酶G（PKG）是心臟功能的重要調(diào)節(jié)通路，HFPEF 患者的心肌勻漿中cGMP 含量和PKG生物活性顯著降低，HFPEF 大鼠中檢測到NOcGMP-PKG 途徑的缺乏，抑制該信號通路可參與HFPEF 的進展[7-8]。NO-cGMP-PKG 通路下調(diào)可能歸因于冠狀動脈微血管內(nèi)皮炎癥激活和亞硝化/氧化應(yīng)激引起的心肌NO 生物利用度降低[9]。但ICA 通過調(diào)節(jié)NO-cGMP-PKG 信號通路對HFPEF 大鼠炎癥和心室重塑的影響尚不清楚。因此，本研究探討ICA 對HFPEF 大鼠炎癥和心室重塑的影響及其作用的分子機制，以期為臨床治療HFPEF 提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級雄性SD 大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可編號：SCXK（滬）2020-0004，8～10 周齡，體質(zhì)量200～210 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)溫度22 ℃，濕度55%～60%，12 h光暗循環(huán)。不禁水食。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準（PZSHTCM210618001）。

1.2 主要試劑與儀器淫羊藿苷（J36861），上海金穗生物科技有限公司；醋酸脫氧皮質(zhì)酮（DOCA，貨號：30856），上海貝萬塔生物科技有限公司；亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME，貨號：BLL-Bytd0133），上海佰利萊生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號：G1120-100）、活性氧（ROS）試劑盒（貨號：CA1410），北京Solarbio 公司；蛋白提取試劑盒（貨號：KALANG），上?？道噬锟萍加邢薰?；IL-6、IL-1β（E-EL-R0896c、E-EL-R0012c）、TNF-α（貨號：E-EL-R2856c）、cGMP（E-EL-0083c）ELISA 試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；NO 測定試劑盒（A013-2-1），南京建成；兔源一抗PKG（ab90502）、eNOS（ab300071）、iNOS（ab178945）、sGCα（ab154841）、GAPDH（ab9485）抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（ab6721），美國Abcam公司；多功能全自動酶標儀（HBS-ScanX），南京德鐵實驗設(shè)備有限公司；光學顯微鏡（CX31），日本奧林巴斯公司；小動物超聲系統(tǒng)（Vevo 3100LT），加拿大FUJIFILM 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物建模、分組和給藥麻醉并固定大鼠后，手術(shù)縫合線結(jié)扎整個腎動靜脈及輸尿管，剪去腎臟，給1%鹽水飲用、同時皮下注射DOCA（25 mg/kg，4 d/次），自由飲食。4 周后檢測大鼠心功能，射血分數(shù)（EF）大于50%且左室舒張期充盈速度比值（E/A）降低，則表明HFPEF 大鼠模型構(gòu)建成功[10]。將造模成功的大鼠隨機分為Model 組、ICA 低、中、高劑量組、抑制劑組，隨機選取12 只未行手術(shù)的大鼠作為control 組，ICA 低、中、高劑量組大鼠灌胃1、5、10 mg/kg 的ICA[4]，抑制劑組大鼠灌胃10 mg/kg 的ICA 和0.5g/kg 的一氧化氮合酶（NOS）抑制劑-亞硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）[11]，control 組和Model 組灌胃等量的生理鹽水，每天1 次，連續(xù)6 周。

1.3.2 大鼠心功能的檢測給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，用小動物超聲系統(tǒng)檢測大鼠左室射血分數(shù)（LVEF）、左室縮短分數(shù)（LVFS）、左心室前/后壁厚度（LVAM/LVPW）、左心室舒張末期內(nèi)徑/收縮末期內(nèi)徑（LVEDD/LVESD）、二尖瓣舒張早期/舒張晚期血流速度最大峰值（E/A）。

1.3.3 血流動力學檢測腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，暴露左頸總動脈并插入導管至左心室腔，記錄左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末期壓力（LVEDP）及左室壓力最大上升或下降速率（+dp/dt max、-dp/dt max）。

1.3.4 HE 染色每組處死6 只大鼠，收集心臟，部分心肌組織在多聚甲醛（4%）固定過夜后，蔗糖梯度脫水，石蠟包埋后切片（3 μm）。切片經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟和水化，隨后進行HE 染色，最后在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.5 NO、ROS、cGMP、IL-6、IL-1β、TNF-α水平檢測將大鼠心肌組織制成勻漿后，離心后取上清，根據(jù)試劑盒檢測大鼠心肌組織中NO、ROS、cGMP、IL-6、IL-1β、TNF-α 含量。

1.3.6 免疫熒光染色大鼠心肌組織經(jīng)脫水、包埋切片、脫蠟、山羊血清封閉、PBS 漂洗后加入CD31一抗抗體，4 ℃避光孵育過夜，加入生物素標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗室溫下避光孵育1 h，經(jīng)PBS 洗滌、DAPI 避光復染5 min、封片，熒光顯微鏡觀察并拍攝照片。Image J 軟件計算CD31 平均熒光強度。

1.3.7 PKG、eNOS、iNOS、sGCα 蛋白表達檢測提取大鼠心肌組織蛋白，定量后進行電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h，再分別加入PKG（1∶1 000）、eNOS（1∶2 000）、iNOS（1∶2 000）、sGCα（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶2 000）室溫孵育90 min。Image J 軟件分析計算蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 9.0 軟件進行分析。計量資料以（±s）表示。多組間的比較用單因素方差分析，SNK-q檢驗用于組間的比較。組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能比較見圖1、表1。與control組比較，Model 組大鼠LVEF、LVFS、E/A 降低，LVAM、LVPW、LVEDD、LVESD 升高（P＜0.05）；與Model 組比較，ICA 低、中、高劑量組大鼠LVEF、 LVFS、 E/A 升 高 ， LVAM、 LVPW、LVEDD、LVESD 降低，其中ICA 高劑量組變化更顯著（P＜0.05）；與ICA 高劑量組比較，抑制劑組大鼠LVEF、 LVFS、 E/A 降 低 ， LVAM、 LVPW、LVEDD、LVESD 升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

注：①與control 組比較，P＜0.05；②與Model 組比較，P＜0.05；③與ICA 低劑量組比較，P＜0.05；④與ICA 中劑量組比較，P＜0.05；⑤與ICA 高劑量組比較，P＜0.05

組 別control 組Model 組ICA 低劑量組ICA 中劑量組ICA 高劑量組抑制劑組鼠數(shù)666666 LVEF（%）80.34±5.17 54.68±3.21①60.24±4.13②67.89±4.62②③74.38±4.87②③④59.25±3.53⑤LVFS（%）36.84±2.87 17.14±1.05①21.13±1.37②26.87±1.25②③33.48±1.57②③④20.14±1.16⑤LVAM（mm）3.05±0.13 3.94±0.16①3.65±0.14②3.34±0.13②③3.10±0.11②③④3.82±0.15⑤LVPW（mm）3.12±0.21 4.17±0.23①3.85±0.19②3.74±0.20②③3.21±0.18②③④3.82±0.19⑤LVEDD（mm）5.08±0.65 8.89±0.73①7.82±0.64②6.74±0.57②③5.62±0.41②③④7.73±0.65⑤LVESD（mm）3.12±0.21 7.83±0.56①6.54±0.43②5.32±0.37②③4.10±0.28②③④6.47±0.46⑤E/A 1.68±0.12 1.03±0.09①1.26±0.11②1.54±0.13②③1.67±0.10②③④1.14±0.09⑤

2.2 各組大鼠血流動力學指標比較見表2。與control 組比較，Model 組大鼠LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max 降低，LVEDP 升高（P＜0.05）；與Model組比較，ICA 低、中、高劑量組大鼠LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max 升高，LVEDP 降低，其中ICA 高劑量組變化更顯著（P＜0.05）；與ICA 高劑量組比較，抑制劑組大鼠LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max 降低，LVEDP 升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血流動力學指標比較（±s）

表2 各組大鼠血流動力學指標比較（±s）

注：①與control 組比較，P＜0.05；②與Model 組比較，P＜0.05；③與ICA 低劑量組比較，P＜0.05；④與ICA 中劑量組比較，P＜0.05；⑤與ICA 高劑量組比較，P＜0.05 1 mm Hg≈0.133 kPa

組 別control 組Model 組ICA 低劑量組ICA 中劑量組ICA 高劑量組抑制劑組鼠數(shù)666666 LVSP（mm Hg）133.89±10.74 81.52±6.19①90.38±7.42②102.63±7.85②③117.49±8.92②③④93.68±8.15⑤LVEDP（mm Hg）6.73±1.08 19.24±1.96①15.87±1.43②11.49±1.25②③7.38±1.04②③④16.28±1.72⑤+dp/dt max（mm Hg/s）4 325.61±187.96 2 715.48±154.62①3 128.93±162.48②3 652.17±175.63②③4 219.87±183.52②③④3 259.84±170.32⑤-dp/dt max（mm Hg/s）4 251.27±196.38 2 541.39±175.42①2 997.86±182.15②3 526.94±186.73②③4 138.72±194.29②③④3 107.58±179.46⑤

2.3 各組大鼠心肌組織HE 染色圖見圖2。control組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，細胞排列緊密有序、細胞核清晰；Model 組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)受損嚴重，細胞排列松散混亂、充血明顯、有炎性細胞浸潤現(xiàn)象；ICA 低、中、高劑量組與Model 組比較，大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)受損減輕，細胞排列較有序、充血及炎性細胞浸潤相對減輕，ICA 高劑量大鼠心肌組織病理改變最為明顯；抑制劑組與ICA 高劑量組比較，大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)受損加重、細胞排列相對松散、充血及炎性細胞浸潤加重。

圖2 各組大鼠心肌組織HE 染色圖（×200）

2.4 各組大鼠心肌組織中NO、cGMP、ROS 水平比較見表3。與control 組比較，Model 組大鼠心肌組織中NO、cGMP 水平降低，ROS 水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，ICA 低、中、高劑量組大鼠心肌組織中NO、cGMP 水平升高，ROS 水平降低，其中ICA 高劑量組變化更顯著（P＜0.05）；與ICA 高劑量組比較，抑制劑組大鼠心肌組織中NO、cGMP 水平降低，ROS 水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠心肌組織中NO、cGMP、ROS 水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織中NO、cGMP、ROS 水平比較（±s）

注：①與control 組比較，P＜0.05；②與Model 組比較，P＜0.05；③與ICA 低劑量組比較，P＜0.05；④與ICA 中劑量組比較，P＜0.05；⑤與ICA 高劑量組比較，P＜0.05

組 別control 組Model 組ICA 低劑量組ICA 中劑量組ICA 高劑量組抑制劑組鼠數(shù)666666 NO（μmol/mL）39.68±2.05 12.37±1.13①17.46±1.24②23.39±1.53②③32.51±1.85②③④18.37±1.46⑤cGMP（pmol/mL）45.68±3.27 19.46±1.48①25.73±1.63②31.52±2.41②③38.29±3.16②③④27.15±1.74⑤ROS（ng/mL）45.13±2.57 87.45±5.39①76.61±4.65②63.27±3.79②③49.85±3.24②③④75.89±4.68⑤

2.5 各組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較見表4。與control 組比較，Model 組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，ICA 低、中、高劑量組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低，其中ICA 高劑量組變化更顯著（P＜0.05）；與ICA 高劑量組比較，抑制劑組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較（±s）

注：①與control 組比較，P＜0.05；②與Model 組比較，P＜0.05；③與ICA 低劑量組比較，P＜0.05；④與ICA 中劑量組比較，P＜0.05；⑤與ICA 高劑量組比較，P＜0.05

組 別control 組Model 組ICA 低劑量組ICA 中劑量組ICA 高劑量組抑制劑組鼠數(shù)666666 IL-6（pg/mL）70.58±8.41 348.92±17.86①281.78±15.39②212.29±13.76②③113.62±11.94②③④293.15±16.24⑤IL-1β（pg/mL）101.52±12.14 486.73±22.38①389.65±21.46②302.47±19.83②③160.49±17.98②③④375.48±20.95⑤TNF-α（pg/mL）51.29±6.38 292.82±16.21①230.74±13.48②154.81±14.07②③72.54±9.26②③④218.42±12.73⑤

2.6 各組大鼠CD31 表達比較見圖3、表5。與control 組比較，Model 組大鼠心肌組織中CD31 表達水平降低（P＜0.05）；與Model 組比較，ICA 低、中、高劑量組大鼠心肌組織中CD31 表達水平升高，其中ICA 高劑量組變化更顯著（P＜0.05）；與ICA 高劑量組比較，抑制劑組大鼠心肌組織中CD31 表達水平降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠CD31 表達比較（±s）

表5 各組大鼠CD31 表達比較（±s）

注：①與control 組比較，P＜0.05；②與Model 組比較，P＜0.05；③與ICA 低劑量組比較，P＜0.05；④與ICA 中劑量組比較，P＜0.05；⑤與ICA 高劑量組比較，P＜0.05

組 別control 組Model 組ICA 低劑量組ICA 中劑量組ICA 高劑量組抑制劑組鼠數(shù)666666 CD31（平均熒光強度）21.48±1.67 3.25±0.68①7.83±0.92②12.96±1.28②19.21±1.57②③④5.23±0.64⑤

圖3 各組大鼠免疫熒光檢測CD31 的表達

2.7 各組大鼠心肌組織中PKG、eNOS、iNOS、sGCα 蛋白表達比較見圖4、表6。與control 組比較，Model 組大鼠心肌組織中PKG、eNOS、sGCα 蛋白表達水平降低，iNOS 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與Model 組比較，ICA 低、中、高劑量組大鼠心肌組織中PKG、eNOS、sGCα 蛋白表達水平升高，iNOS 蛋白表達水平降低，其中ICA 高劑量組變化更顯著（P＜0.05）；與ICA 高劑量組比較，抑制劑組大鼠心肌組織中PKG、eNOS、sGCα 蛋白表達水平降低，iNOS 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。

表6 各組大鼠心肌組織中PKG、eNOS、iNOS、sGCα 蛋白表達比較（±s）

表6 各組大鼠心肌組織中PKG、eNOS、iNOS、sGCα 蛋白表達比較（±s）

注：①與control 組比較，P＜0.05；②與Model 組比較，P＜0.05；③與ICA 低劑量組比較，P＜0.05；④與ICA 中劑量組比較，P＜0.05；⑤與ICA 高劑量組比較，P＜0.05

組 別control 組Model 組ICA 低劑量組ICA 中劑量組ICA 高劑量組抑制劑組鼠數(shù)666666 PKG 1.83±0.19 0.35±0.04①0.68±0.07②1.21±0.13②③1.65±0.15②③④0.72±0.09⑤eNOS 1.49±0.11 0.32±0.05①0.67±0.08②1.08±0.10②③1.35±0.12②③④0.70±0.08⑤iNOS 0.24±0.03 1.78±0.14①1.30±0.11②0.84±0.09②③0.35±0.04②③④1.16±0.10⑤sGCα 1.67±0.18 0.29±0.03①0.60±0.07②0.94±0.08②③1.42±0.13②③④0.37±0.04⑤

圖4 Western blot 檢測PKG、eNOS、iNOS、sGCα 蛋白表達

3 討論

HFPEF 的特征是嚴重的左心室收縮和舒張僵硬、左心室充盈壓升高、動脈順應(yīng)性降低、左心房高壓、肺靜脈瘀血和微血管功能障礙等[12]。內(nèi)皮炎癥、心室重塑與HFPEF 的發(fā)展密切相關(guān)，但潛在機制尚不清楚。

心室重塑是影響HFPEF 患者心臟功能和預后的重要病理生理機制。本研究采用皮下注射DOCA 建立HFPEF 大鼠模型并對其研究發(fā)現(xiàn)，Model 組大鼠LVAM、LVPW、LVEDD、LVESD、LVEDP 升高，LVEF、LVFS、E/A、LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max降低，Model 組大鼠出現(xiàn)左心室肥厚、心室增大、心室舒張功能障礙，提示，HFPEF 大鼠模型構(gòu)建成功。近年來，安全有效的中藥成分逐漸進入人們的視野，是治療HFPEF 的一個方向。ICA 具有良好的心臟保護作用。ICA 通過激活sirtuin-1/FOXO1 信號來保護心肌細胞免受缺血/再灌注誘導的氧化應(yīng)激損傷[13]。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的ICA 以劑量依賴性方式抑制大鼠的心臟重塑[6]。Song YH 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ICA通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 軸和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9 的活性并減少心肌凋亡，顯著改善異丙腎上腺素誘導的充血性心力衰竭大鼠心功能障礙和心肌重塑。鹿角方能改善慢性心力衰竭患者的心臟功能，而ICA 是鹿角方的主要活性成分[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，ICA 能降低LVAM、LVPW、LVEDD、LVESD、LVEDP，升高LVEF、LVFS、E/A、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dt max，ICA 可顯著改善HFPEF 大鼠的心臟功能及心室重塑。

微血管內(nèi)皮炎癥可能是HFPEF 的關(guān)鍵分子機制。促炎細胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）已被證明可以刺激微血管內(nèi)皮細胞中ROS 的產(chǎn)生。ROS 的過量產(chǎn)生導致NO 生物利用度降低，從而降低鄰近心肌細胞中cGMP 以及PKG 的濃度[16]。NO 可由eNOS 催化L-精氨酸生成，通過血管外擴散到血管平滑肌細胞中，可與其受體結(jié)合，促進sGC-cGMP-PKG 通路的活性，引起血管平滑肌松弛和血管舒張。抑制NO-cGMP-PKG 通路可能會增加舒張期的被動張力、心肌肥大和僵硬，導致舒張功能障礙，因此，NO-cGMP-PKG 通路介導微血管內(nèi)皮炎癥在HFPEF的治療中具有重要價值[17]。研究表明，達格列凈（鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白2 抑制劑）可以通過抑制主動脈交感神經(jīng)張力和調(diào)節(jié)NO-cGMP-PKG 通路來降低炎癥反應(yīng)，并逆轉(zhuǎn)HFPEF 期間的左心室重塑[18]。在心肌中，激活的NO-cGMP-PKG 通路通常具有抗肥大、抗纖維化和血管生成作用，從而抑制心臟重塑。iNOS 是內(nèi)皮功能障礙和血管炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，CD31 是血管內(nèi)皮細胞分化的標志物，HFPEF 小鼠心肌組織中iNOS 上調(diào)表達，CD31 下調(diào)表達[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在HFPEF 大鼠心肌組織中，IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS 炎性因子與氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS 水平顯著升高，NO、cGMP 水平、CD31 及PKG、eNOS、sGCα 蛋白表達水平顯著降低，ICA 可降低IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS 炎癥因子水平，升高NO、cGMP 水平、CD31、PKG、eNOS、sGCα 表達，改善微血管內(nèi)皮炎癥。L-NAME 作為NOS 的抑制劑，會引起內(nèi)皮功能障礙及炎癥反應(yīng)[20]。在本研究中，L-NAME 抑制NO-cGMP-PKG 通路激活的同時，顯著逆轉(zhuǎn)ICA 對炎癥反應(yīng)的抑制作用，減輕對心臟功能及心室重塑的改善作用。提示，ICA 可能通過激活NO-cGMP-PKG 通路，減輕炎癥反應(yīng)、改善心室重塑。

綜上所述，ICA 可能通過激活NO-cGMP-PKG通路，減輕炎癥反應(yīng)、改善心室重塑。本研究為治療HFPEF 提供了理論和藥物參考。然而本研究尚存在不足之處，僅驗證NO-cGMP-PKG 信號通路，未對其他靶點、途徑進行驗證，后續(xù)研究將會進一步明確ICA 在HFPEF 中的作用機理。