鄧 平 ,吳 敏* ,林 丁 ,趙 英 ,陸海嬌 ,岑 英

(1 玉林師范學(xué)院 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西高校亞熱帶生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西玉林 537000;2 中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院,長(zhǎng)沙 410004)

喀斯特(巖溶)地質(zhì)在中國(guó)分布廣、面積大,約占全國(guó)國(guó)土面積的1/7,是中國(guó)四大生態(tài)環(huán)境脆弱區(qū)之一,而廣西桂西北喀斯特地區(qū)巖石裸露面積達(dá)8.95萬(wàn)km2,是中國(guó)乃至世界亞熱帶巖溶典型區(qū)[1]。桂西北喀斯特地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候區(qū),存在土層淺薄,基巖裸露,大氣降水入滲系數(shù)大,漏失嚴(yán)重,形成下雨澇害、天晴干旱的季節(jié)性干旱特征[1-2]。由于降水的急劇滲漏形成干濕頻繁交替,造成該地區(qū)植物需短時(shí)間能對(duì)干旱-復(fù)水做出形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理變化響應(yīng);但目前對(duì)該地區(qū)植物的研究多集中在其旱期的耐旱策略和機(jī)制方面,忽略了其旱后恢復(fù)力和適應(yīng)性的研究,而這不僅是評(píng)價(jià)該地區(qū)植物耐旱性的重要指標(biāo)[3-4],也是影響該地區(qū)植被恢復(fù)與造林成敗的關(guān)鍵因素。

在干旱環(huán)境下,植物的光合能力反映植物生長(zhǎng)受抑制的程度,也可以衡量植物受干旱環(huán)境脅迫影響的差異性[5]。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)是研究植物光合作用的內(nèi)在探針,通過(guò)研究葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化過(guò)程,能快速、精準(zhǔn)、無(wú)傷害地反映植物對(duì)光能的吸收和利用狀況,進(jìn)一步了解干旱脅迫對(duì)植物光合作用影響的程度[6]。此外,葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會(huì)直接或間接影響植物光合作用,在干旱環(huán)境下,氣孔、表皮厚度及其覆蓋物能減少蒸騰,而葉肉作為進(jìn)行光合作用的主要部位,其柵欄組織和海綿組織厚度變化會(huì)直接影響葉片的光合效率[7]。研究表明,在輕度或短期干旱環(huán)境下,一些植物葉片氣孔密度增大,有利于短時(shí)間內(nèi)充分利用有效水分進(jìn)行光合作用,同時(shí)氣孔密度大也有助于光合作用和散熱;另一些植物則降低氣孔密度、關(guān)閉氣孔、減小蒸騰作用,進(jìn)而影響植物光合作用中光能電子傳遞和轉(zhuǎn)換、光合磷酸化及暗反應(yīng)等一系列過(guò)程[8]。但隨著干旱程度加劇或時(shí)間的延長(zhǎng),植物葉肉細(xì)胞膜損傷、光合酶活性受干擾,使植物光合速率顯著下降,光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)受到不可逆破壞和損傷,造成植物生長(zhǎng)發(fā)育受抑制甚至死亡[9-10]。在旱后復(fù)水恢復(fù)過(guò)程中,植物能否迅速?gòu)浹a(bǔ)干旱脅迫造成的損傷快速恢復(fù),是其對(duì)干旱環(huán)境適應(yīng)性的重要表現(xiàn)[11]。研究表明,旱后復(fù)水能夠使植物的生理功能得到恢復(fù),可在一定程度上彌補(bǔ)干旱對(duì)植物造成的傷害。其中,耐旱性強(qiáng)的植物旱后復(fù)水恢復(fù)快,其水分狀況能夠在24 h內(nèi)得到恢復(fù),提高植物光合速率并使其生長(zhǎng)加速;但干旱后復(fù)水對(duì)植物生長(zhǎng)上的補(bǔ)償通常是有限的,其生長(zhǎng)的恢復(fù)程度可能與復(fù)水前干旱的脅迫程度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)[12-13]。因此,同時(shí)進(jìn)行不同強(qiáng)度干旱脅迫及其旱后復(fù)水處理,考察植物光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及葉片解剖結(jié)構(gòu)變化的特征,才能夠較為全面地了解植物對(duì)干旱環(huán)境適應(yīng)機(jī)制,科學(xué)評(píng)價(jià)其耐旱性。

青岡櫟(Cyclobalanopsis glauca)為殼斗科青岡屬常綠闊葉樹(shù)種,是喀斯特地區(qū)常綠落葉闊葉混交林常見(jiàn)樹(shù)種之一,對(duì)喀斯特生境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性,是亞熱帶喀斯特石漠化地區(qū)進(jìn)行造林或植被恢復(fù)時(shí)選用的主要樹(shù)種之一[14]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn),喀斯特地區(qū)的青岡櫟天然林和人工林雖結(jié)實(shí)量大,但由于生境土層淺薄、基巖裸露、干旱以及暫時(shí)性水濕環(huán)境交替,導(dǎo)致種子萌發(fā)率低,幼苗定居困難,影響種群自然更新。迄今,關(guān)于喀斯特干旱脅迫環(huán)境下青岡櫟研究主要集中于苗期的生長(zhǎng)、水分參數(shù)、抗氧化酶活性、葉綠素含量、熒光及光合參數(shù)等生理特性方面[15-18],忽略了對(duì)其旱后恢復(fù)能力的研究,而這卻是深入了解其對(duì)喀斯特干濕交替生境適應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵內(nèi)容。因此,本研究通過(guò)盆栽控水試驗(yàn)?zāi)M喀斯特野外干濕條件,測(cè)定分析不同強(qiáng)度干旱脅迫及其復(fù)水后青岡櫟幼苗葉片的光合生理、葉綠素?zé)晒馓匦约叭~片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律,探討青岡櫟幼苗對(duì)土壤水分變化的反應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制,為這一地區(qū)的植被恢復(fù)和人工造林提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年11月中旬,自桂林喀斯特地貌雁山區(qū)大埠鄉(xiāng)甘棠村后山、陽(yáng)朔縣葡萄鎮(zhèn)軛頭、白沙鎮(zhèn)富里灣和高田鎮(zhèn)白溝、碑頭“風(fēng)水山”的青岡櫟天然林(24°40′-25°40′N,110°9′-110°42′E)采集青岡櫟種子,在實(shí)驗(yàn)室選出健康飽滿大小相似的種子陰干后,在4℃低溫沙藏備用。

整個(gè)試驗(yàn)在廣西玉林師范學(xué)院玻璃溫室大棚中(22°64′N,110°14′E)進(jìn)行,晝夜溫度分別為28℃和20℃,白天光強(qiáng)為600～800μmol/(m2·s),相對(duì)濕度保持在(70±3.5)%。2017年3 月初,將青岡櫟播種于黑色育苗袋中(高21 cm,直徑21 cm),播種土由泥炭土和珍珠巖按照1∶1體積比(V∶V)混合而成,每袋播種5粒種子,共30盆。待青岡櫟幼苗出現(xiàn)2～3片真葉,平均株高為10 cm 時(shí),移栽到塑料桶中(高44 cm、上下內(nèi)口徑分別為35 cm 和30 cm),每桶2株,共40桶。為了模擬采種地喀斯特土層結(jié)構(gòu),塑料桶中的土壤分別裝入巖石層和混合土層。其中,下層為巖石層即碎石層(厚18 cm,重9.5 kg);上層為混合土層包括采種地收集的棕色石灰土、河床細(xì)沙、腐殖質(zhì),按照1∶1∶1比例(V∶V∶V)混合,且田間最大持水量為28.6%,p H 值為7.42,土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀含量分別為43.89,2.23,0.72,8.97 g/kg,經(jīng)過(guò)烘干(80℃)到恒重,每桶均裝入等量的混合土15.4 kg。為保證幼苗健康生長(zhǎng),育苗與緩苗期的土壤含水率維持在23.4%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

WP4-T 露點(diǎn)水勢(shì)儀(Decagon Devices,Inc.,Hopkins,USA)實(shí)測(cè)結(jié)果表明,野外青岡櫟采種地0-20 cm 土壤水勢(shì)為(-0.1)(在雨季降雨后土壤水勢(shì))～(-1.5)MPa(在旱季萎蔫點(diǎn)土壤水勢(shì)),再依據(jù)青岡櫟種子干旱脅迫萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[19],將本試驗(yàn)干旱脅迫土壤水勢(shì)范圍設(shè)定為4個(gè)梯度:-0.1 MPa(對(duì)照,CK)、-0.5 MPa(輕度干旱,LD)、-0.9 MPa(中度干旱,MD)和-1.5 MPa(重度干旱,SD)。

在干旱脅迫處理前,使用WP4-T露點(diǎn)水勢(shì)儀測(cè)定試驗(yàn)土壤樣品的水勢(shì),并通過(guò)烘干稱重法測(cè)定相應(yīng)的土壤含水量;然后,建立試驗(yàn)土壤水勢(shì)與含水量的回歸關(guān)系,繪制土壤水分特征曲線;最后,根據(jù)該曲線,計(jì)算出土壤水勢(shì)為-0.1,-0.5,-0.9,-1.5 MPa時(shí)的土壤含水量分別為23.4%、19.3%、15.2%和11.1%,并在干旱-復(fù)水試驗(yàn)期通過(guò)稱重法控制干旱梯度[20]。

2017年6月15日,待幼苗生長(zhǎng)至7～8片葉,株高達(dá)(15.90±1.13)cm 時(shí),開(kāi)始停止?jié)菜?0 d左右,待各桶土壤水分通過(guò)蒸發(fā)下降至預(yù)設(shè)的4個(gè)水分梯度,開(kāi)始干旱脅迫試驗(yàn)。整個(gè)干旱處理試驗(yàn)持續(xù)60 d,復(fù)水處理7 d(使其土壤含水量達(dá)到23.4%);每個(gè)處理10桶(共20株),并隨機(jī)將其分成2組,其中5桶(共10株)用于復(fù)水試驗(yàn)。每盆隔天18:00稱重,將損失的水分重新補(bǔ)充到土壤中使其達(dá)到相應(yīng)的干旱梯度(稱重控制干旱與復(fù)水梯度時(shí),忽略幼苗重量)。在第60天和第67天分別對(duì)各處理下青岡櫟葉片水分狀況、光合氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 光合氣體交換參數(shù)

測(cè)定于9:00—12:00進(jìn)行,隨機(jī)選取每個(gè)處理每盆青岡櫟幼苗中上部3枚成熟葉片,即每個(gè)處理共計(jì)15 枚葉片(15 個(gè)重復(fù)),使用便攜式光合儀(3051D,中國(guó)浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司)測(cè)定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)和田間CO2濃度(Ca),并計(jì)算植株葉片氣孔限制值(L s=1-Ci/Ca)和瞬時(shí)水分利用(WUE=Pn/Tr)[21]。測(cè)定系統(tǒng)采用開(kāi)放式氣路,自然光源,光合有效輻射為600～800μmol/(m2·s),室內(nèi)CO2濃度為370～480μL/L,空氣相對(duì)濕度為65%～73%,葉片溫度控制為21～23℃[16]。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

選取測(cè)定光合氣體交換參數(shù)時(shí)的相同葉片,每處理15 個(gè)重復(fù),采用美國(guó)OPTI-SCIENCES OS-30p+快速植物脅迫測(cè)量?jī)x測(cè)定,葉片暗適應(yīng)30 min后,再照射飽和脈沖光[12 000μmol/(m2·s)],直接從系統(tǒng)獲得初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)以及潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)。

1.3.3 葉片相對(duì)含水率和水勢(shì)

采集每個(gè)處理完成光合和熒光參數(shù)測(cè)定的6枚葉片,分別用于葉片相對(duì)含水率與葉片水勢(shì)的測(cè)定,各指標(biāo)每處理3次重復(fù)。其中,葉片相對(duì)含水率測(cè)定時(shí),首先測(cè)定葉片鮮質(zhì)量,然后將葉片浸泡在純凈水中24 h測(cè)定飽和鮮質(zhì)量,最后放置在烘箱中于70℃下烘烤48 h后測(cè)定葉片干質(zhì)量;據(jù)此計(jì)算葉片相對(duì)含水率[(葉片鮮質(zhì)量-葉片干質(zhì)量)/(葉片飽和鮮質(zhì)量-葉片干質(zhì)量)×100%][22]。葉片水勢(shì)測(cè)定使用壓力室法(1505D-EXP,PMS Instrument Company,Albany,USA)。

1.3.4 葉片光學(xué)解剖結(jié)構(gòu)觀測(cè)

次日上午10:00迅速?gòu)臏y(cè)定完水分狀況后剩余的,且測(cè)定過(guò)光合、葉綠素?zé)晒獾娜~片中每個(gè)梯度各取6枚葉片分別用于氣孔和葉片解剖結(jié)構(gòu)觀測(cè),各指標(biāo)(氣孔和葉片解剖結(jié)構(gòu))每處理各3 枚葉片(3次重復(fù))。(1)氣孔形態(tài)觀察:葉片氣孔取樣先用脫脂棉蘸酒精輕輕擦拭干凈其表皮灰塵,用無(wú)色透明指甲油印跡法取上下葉片表皮中部的氣孔;待指甲油晾干后,采集面積10 mm×15 mm 的氣孔印跡樣品制成臨時(shí)裝片,制好的裝片用數(shù)碼光學(xué)顯微鏡(Lecia DM2500)觀測(cè)拍照記錄氣孔形態(tài)特征。(2)氣孔密度觀測(cè):每個(gè)處理各制9個(gè)臨時(shí)裝片于數(shù)碼光學(xué)顯微鏡下拍照觀測(cè);每個(gè)裝片隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野拍攝圖像保存,每個(gè)處理共計(jì)27 張圖片[23];最后使用圖形分析軟件Image-J分別測(cè)量計(jì)算氣孔密度。(3)葉片解剖結(jié)構(gòu)觀測(cè):每個(gè)處理3枚葉片清洗后沿主脈橫切,切塊約5 cm×5 cm 后用FAA 固定,乙醇和二甲苯系列脫水,石蠟包埋,番紅-固綠染色,中性樹(shù)膠封片;切片在數(shù)碼光學(xué)顯微鏡(Lecia DM2500)下觀測(cè)并拍照,通過(guò)圖形分析軟件Image-J測(cè)量葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、主葉脈厚度和導(dǎo)管直徑,并計(jì)算柵海比(柵欄組織組織/海綿組織厚度);每個(gè)處理收集取30個(gè)圖片測(cè)定統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較檢驗(yàn)不同強(qiáng)度干旱脅迫間和復(fù)水后不同干旱脅迫間各指標(biāo)差異顯著性(α=0.05);采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析在相同干旱脅迫強(qiáng)度下復(fù)水前后各指標(biāo)的差異顯著性(α=0.05)。利用Origin 9.0軟件繪圖。圖表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱復(fù)水對(duì)青岡櫟幼苗葉片相對(duì)含水率和水勢(shì)的影響

圖1顯示,隨干旱脅迫加劇,青岡櫟幼苗葉片相對(duì)含水率和水勢(shì)均大幅度顯著下降(P<0.05);其中,輕度、中度和重度脅迫下葉片相對(duì)含水率分別比對(duì)照顯著減少了13.52%、23.59%和40.38%,葉片水勢(shì)則分別比對(duì)照顯著降低了118.25%、290.62%和411.64%。

CK.對(duì)照(-0.1 MPa);LD.輕度干旱(-0.5 MPa);MD.中度干旱(-0.9 MPa);SD.重度干旱(-1.5 MPa);不同小寫(xiě)字母表示復(fù)水前或者復(fù)水后各干旱脅迫處理間差異顯著(P<0.05);*和**分別表示相同干旱脅迫強(qiáng)度下復(fù)水前后差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01),ns表示無(wú)顯著差異(P>0.05)。下同。圖1 干旱脅迫和復(fù)水后青岡櫟幼苗葉片相對(duì)含水率和水勢(shì)的變化CK,control(-0.1 MPa).LD,mild drought(-0.5 MPa).MD,moderate drought(-0.9 MPa).SD,severe drought(-1.5 MPa).Different normal letters indicate significant difference among drought stress treatments before or after rehydration at 0.05 level.Stars*and**indicate significant difference between before and after rehydration in the same drought stress intensity at 0.05(P<0.05)and 0.01(P<0.01)level,respectively.ns indicates no significant difference at 0.05 level(P>0.05).The same as below.Fig.1 The changes of leaf relative water content and water potential of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

復(fù)水后,各干旱脅迫處理葉片相對(duì)含水率和水勢(shì)均比其復(fù)水前顯著提高(P<0.05),但僅輕度脅迫復(fù)水后葉片相對(duì)含水率和水勢(shì)均恢復(fù)到對(duì)照水平,中度和重度脅迫處理仍顯著低于對(duì)照。

2.2 干旱復(fù)水對(duì)青岡櫟幼苗葉片光合參數(shù)和瞬時(shí)水分利用率的影響

圖2顯示,隨干旱脅迫加劇,青岡櫟幼苗葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)均逐漸降低,氣孔限制值(Ls)則逐漸提高,而瞬時(shí)水分利用效率(WUE)則先升后降。其中,葉片Pn、Tr、Gs、Ci和Ls在輕度干旱脅迫下均與對(duì)照無(wú)顯著差異,在中度干旱脅迫下除Ci外均與對(duì)照差異顯著,在重度干旱脅迫下均與對(duì)照有顯著差異;而葉片WUE 在輕度和中度干旱脅迫下均與對(duì)照無(wú)顯著差異,但重度干旱脅迫下葉片WUE比對(duì)照顯著降低了24.83%。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理的Pn、Tr、Gs、Ci和WUE 均比其復(fù)水前不同程度增加,而Ls均比其復(fù)水前不同程度減少,且輕度和中度脅迫復(fù)水前后變幅大多達(dá)到顯著水平(P<0.05)。同時(shí),在復(fù)水后,葉片Pn、Tr、Gs、Ci、Ls和WUE在各干旱脅迫處理間仍存在顯著差異(P<0.05)。其中,在輕度脅迫復(fù)水后,葉片Pn、Gs、Ci和WUE均比對(duì)照有不同程度增加,而Tr和Ls不同程度降低,但僅Pn比對(duì)照顯著提高了19.93%,其余指標(biāo)變化均未達(dá)到顯著水平;在中度脅迫復(fù)水后,除Ls比對(duì)照顯著增加外,其余指標(biāo)均與對(duì)照無(wú)顯著差異;在重度脅迫復(fù)水后,葉片Ls比對(duì)照顯著增加109.23%,Pn、Tr分別比對(duì)照顯著降低41.06%和29.27%,其余指標(biāo)也不同程度降低,但降幅未達(dá)到顯著水平。

圖2 干旱脅迫和復(fù)水后青岡櫟幼苗葉片光合參數(shù)和瞬時(shí)水分利用效率的變化Fig.2 The changes of photosynthetic parameters and instantaneous water use efficiency of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

2.3 干旱復(fù)水對(duì)青岡櫟幼苗葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

圖3 顯示,隨干旱脅迫加劇,葉片初始熒光(Fo)持續(xù)升高,而最大熒光(Fm)持續(xù)降低,且中度和重度干旱脅迫與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理的Fo均比其復(fù)水前降低,但均未達(dá)到顯著水平,而Fm均比其復(fù)水前顯著或極顯著增加;與對(duì)照相比,復(fù)水后各干旱脅迫處理葉片F(xiàn)o和Fm均不同程度增加,輕度脅迫復(fù)水后的Fm顯著增加6.27%,中度脅迫復(fù)水后的Fo和Fm分別顯著增加6.53%和5.63%,重度脅迫復(fù)水后的Fo顯著增加10.88%(P<0.05)。

圖3 干旱脅迫和復(fù)水后青岡櫟幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化Fig.3 The changes of chlorophyll fluorescence parameters of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

圖3還顯示,隨干旱脅迫加劇,葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)均逐漸降低,且中度和重度干旱脅迫與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理的Fv/Fm和Fv/Fo均比其復(fù)水前不同程度提高,輕度脅迫復(fù)水后的Fv/Fm比其復(fù)水前顯著增加6.38%(P<0.05),中度和重度脅迫復(fù)水后的Fv/Fo分別極顯著增加30.42%和31.50%(P<0.01);復(fù)水后各干旱脅迫處理的Fv/Fm和Fv/Fo均與相應(yīng)對(duì)照間無(wú)顯著差異。

2.4 干旱復(fù)水對(duì)青岡櫟幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 葉片氣孔特征參數(shù)

青岡櫟幼苗葉片為異面葉,由緊密排列的上表皮細(xì)胞、柵欄組織、疏松的海綿組織和下表皮細(xì)胞、表皮毛構(gòu)成,葉脈粗大向下隆起。氣孔集中分布在葉片下表皮,且下表皮有表皮毛覆蓋(圖4)。

St.氣孔器;Eh.表皮毛;A1.對(duì)照;A2.輕度干旱脅迫;A3.中度干旱脅迫;A4.重度干旱脅迫;B1.復(fù)水后對(duì)照;B2.復(fù)水后輕度干旱脅迫;B3.復(fù)水后中度干旱脅迫;B4.復(fù)水后重度干旱脅迫。下同。標(biāo)尺=40μm。圖4 干旱脅迫和復(fù)水后青岡櫟幼苗葉片下表皮氣孔St,stomata.Eh,epidermal hair.A1.Contrast.A2.Mild drought stress.A3.Moderate drought stress.A4.Severe drought stress.B1.Rehydration control.B2.Mild drought stress after rehydration.B3.Moderate drought stress after rehydration.B4.Severe drought stress after rehydration.The same as below.Bar=40μm.Fig.4 The leaf stomata on the lower epidermis of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

表1顯示,隨干旱脅迫加劇,葉片氣孔器長(zhǎng)度、寬度及氣孔開(kāi)口面積均逐漸減小,而氣孔密度大幅度增加,且氣孔開(kāi)口面積和氣孔密度在各干旱脅迫處理下均與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。在復(fù)水后,輕度、中度和重度干旱脅迫處理氣孔器長(zhǎng)度、寬度(除中度脅迫復(fù)水后)、開(kāi)口面積和密度均比其復(fù)水前不同程度增加,但僅氣孔開(kāi)口面積分別極顯著增加66.34%、128.78%、196.74%(P<0.01),其余氣孔指標(biāo)復(fù)水前后變化均未達(dá)到顯著水平。與對(duì)照相比,復(fù)水后輕度脅迫處理僅氣孔器密度顯著增加6.07%,復(fù)水后中度脅迫處理氣孔器寬度和開(kāi)口面積仍分別顯著減少7.45%和26.59%,氣孔密度則顯著增加13.96%,復(fù)水后重度脅迫處理氣孔器長(zhǎng)度、寬度、開(kāi)口面積分別顯著降低11.14%、8.90%和46.76%,氣孔密度顯著增加22.13%。

2.4.2 葉片顯微結(jié)構(gòu)

圖5和表2顯示,各干旱脅迫處理葉片厚度均比對(duì)照不同程度增加,但僅中度干旱脅迫下顯著增加7.49%(P<0.05)。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理的葉片厚度均比其復(fù)水前不同程度增加,但僅重度脅迫復(fù)水后葉片厚度比復(fù)水前顯著增加5.93%(P<0.05)。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理下的葉片厚度均仍高于對(duì)照,但僅中度和重度脅迫復(fù)水后葉片厚度分別比對(duì)照顯著增加9.46%和7.24%(P<0.05)。

U-ep.上表皮;L-ep.下表皮;Pal.柵欄組織;Sp.海綿組織。標(biāo)尺=50μm。圖5 干旱脅迫和復(fù)水后青岡櫟幼苗葉片肉結(jié)構(gòu)U-ep,upper Epidermis.L-ep,lower-epidermis.Pal,palisade tissue.Sp,sponge tissue.Bar=50μm.Fig.5 Structure of the leaf mesophyll cells of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

同時(shí),隨干旱脅迫加劇,葉片上下表皮厚度均顯著增加(P<0.05),且上表皮厚度增加更快,輕度、中度和重度脅迫下上表皮厚度分別比對(duì)照增加36.53%、56.95%和97.20%。在復(fù)水后,各干旱脅迫下的上下表皮厚度均比其復(fù)水前不同程度減少,但減幅均未達(dá)到顯著水平(圖5 和表2)。在復(fù)水后,葉片上下表皮厚度在各干旱脅迫處理間仍差異顯著,輕度脅迫復(fù)水后葉片上下表皮厚度均與對(duì)照無(wú)顯著差異,中度脅迫復(fù)水后僅葉片上表皮厚度比對(duì)照顯著增加25.00%,重度脅迫復(fù)水后葉片上下表皮厚度分別比對(duì)照顯著增加66.64%和66.23%(P<0.05)。

另外,隨干旱脅迫加劇,葉片海綿組織厚度逐漸顯著減小,降幅為10.16%～16.86%;柵欄組織厚度在輕度和中度脅迫下分別比對(duì)照顯著增加7.74%、13.81%,在重度干旱脅迫下稍有降低;柵海比在各干旱處理下均比對(duì)照不同程度增加,但僅在中度干旱脅迫下達(dá)到顯著水平(P<0.05),增幅達(dá)37.23%(圖5和表2)。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理的柵欄組織和海綿組織厚度以及重度脅迫的柵海比均比復(fù)水前不同程度增加,而輕度、中度脅迫復(fù)水后柵海比均比復(fù)水前降低,但僅中度和重度脅迫復(fù)水后海綿組織厚度與復(fù)水前差異顯著(P<0.05),其余指標(biāo)復(fù)水前后變化差異不顯著。在復(fù)水后,柵欄、海綿組織厚度和柵海比在各處理間及其與對(duì)照間均差異不顯著。

此外,由圖6和表2可知,葉片主葉脈厚度在各處理間差異極顯著(P<0.05),在輕度和中度脅迫下分別比對(duì)照顯著增加5.61%和10.33%,在重度脅迫下則比對(duì)照顯著減少15.15%;隨干旱脅迫加劇,葉脈導(dǎo)管直徑有不同程度增加,但各處理間差異不顯著。在復(fù)水后,各干旱脅迫處理主葉脈厚度和導(dǎo)管直徑均比其復(fù)水前不同程度增加,且各脅迫處理復(fù)水后主葉脈厚度增幅均達(dá)極顯著水平(P<0.01),輕度和中度脅迫復(fù)水后葉脈導(dǎo)管直徑增幅也均比達(dá)顯著水平(P<0.05)。

Xc.木質(zhì)部導(dǎo)管。標(biāo)尺=100μm。圖6 干旱脅迫和復(fù)水青岡櫟幼苗葉脈結(jié)構(gòu)Xc,xylem conduit.Bar=100μm.Fig.6 Structure of the leaf main vein of C.glauca seedlings under drought stress and rehydration

在復(fù)水后,主葉脈厚度和葉脈導(dǎo)管直徑在輕度脅迫復(fù)水后分別比對(duì)照顯著增加10.17% 和17.80%,在中度脅迫復(fù)水后分別比對(duì)照組顯著增加15.21%和20.51%,在重度脅迫復(fù)水后,主葉脈厚度比對(duì)照減少,葉脈導(dǎo)管直徑比對(duì)照增加,但均與對(duì)照差異不顯著。

3 討論

本研究結(jié)果顯示青岡櫟幼苗通過(guò)降低葉水勢(shì)、關(guān)閉氣孔、降低蒸騰、改變?nèi)~片形態(tài)結(jié)構(gòu)等一系列結(jié)構(gòu)和生理機(jī)制來(lái)適應(yīng)干旱脅迫,在經(jīng)受適度干旱后復(fù)水可在光合作用、水分利用、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、氣孔開(kāi)口面積等生理活動(dòng)中產(chǎn)生補(bǔ)償效應(yīng),迅速恢復(fù)生長(zhǎng)發(fā)育,但干旱脅迫強(qiáng)度不同復(fù)水后青岡櫟幼苗恢復(fù)能力有所不同。

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ),干旱脅迫主要通過(guò)氣孔限制和非氣孔限制因素影響其Pn,從而顯著影響著植物光合作用正常進(jìn)行[24]。研究表明,Pn降低的原因可通過(guò)葉片Ls和Ci的變化趨勢(shì)判斷;隨干旱脅迫加劇,若Pn和Ci降低的同時(shí)伴隨Ls升高,則Pn主要受氣孔因素限制,若Pn和Ls降 低而同時(shí)伴隨Ci升高或不變則,則Pn主要受非氣孔因素限制[25]。本研究發(fā)現(xiàn),青岡櫟幼苗Pn、Ci和Gs隨干旱脅迫加劇均呈顯著下降趨勢(shì),而Ls呈顯著升高趨勢(shì),說(shuō)明干旱導(dǎo)致其Pn降低主要由氣孔限制引起。這與栓皮櫟(Quercus variabilisBl.)[11]和柑橘(Citrus reticulataBlanco)[26]上的相關(guān)研究結(jié)論一致,Pn與Gs、Ci呈顯著正相關(guān),說(shuō)明干旱脅迫使氣孔阻力增大甚至關(guān)閉,使氣孔導(dǎo)度下降,導(dǎo)致葉肉細(xì)胞羧化位點(diǎn)的CO2量減少,引起光合速率下降。

此外,青岡櫟幼苗通過(guò)關(guān)閉氣孔降低蒸騰速率來(lái)減少水分散失,并伴隨葉相對(duì)含水率和水勢(shì)顯著降低,從而適當(dāng)增加葉片保水能力,這也是一種生態(tài)避旱策略。這與射干(Belamcanda chinensisL.)上的相關(guān)研究結(jié)果一致[25]。但此避旱策略在不同干旱脅迫強(qiáng)度下作用效果不同,表現(xiàn)出明顯的閾值響應(yīng),在輕度干旱脅迫下青岡櫟幼苗可通過(guò)有效降低葉片相對(duì)含水率和水勢(shì),關(guān)閉氣孔降低蒸騰速率,將CO2吸收和水分散失穩(wěn)定在最優(yōu)狀態(tài),提高Pn/Tr比值,從而使瞬時(shí)水分利用效率(WUE)升高,提高了青岡櫟幼苗對(duì)輕度干旱脅迫環(huán)境的適應(yīng)性,幼苗可以健康生長(zhǎng);在中度脅迫下其WUE 開(kāi)始低于對(duì)照;而在重度干旱脅迫時(shí),其WUE 顯著低于對(duì)照。說(shuō)明當(dāng)土壤水勢(shì)低于-0.9 MPa時(shí),青岡櫟幼苗的光合同化能力開(kāi)始受到抑制,其生產(chǎn)能力降低,幼苗生長(zhǎng)緩慢。這與前人對(duì)鼓節(jié)竹(Bambusa tuldoides‘Swolleninternode’)[27]和文冠果(Xanthoceras sorbifolia)[28]的研究結(jié)果相同。

復(fù)水可以顯著提高各干旱脅迫處理下青岡櫟幼苗的光合參數(shù),明顯改善了其葉片水分狀況,但干旱脅迫強(qiáng)度不同復(fù)水后恢復(fù)效果不同。輕度干旱脅迫復(fù)水后葉片Pn、相對(duì)含水率和水勢(shì)能完全恢復(fù),且Pn顯著高于對(duì)照,說(shuō)明輕度脅迫下青岡櫟具有較強(qiáng)的旱后恢復(fù)能力,且旱后存在補(bǔ)償生長(zhǎng);在中度干旱脅迫下,盡管青岡櫟幼苗葉片Pn也可恢復(fù)到對(duì)照水平,且WUE也略高于對(duì)照,但葉片水分狀況未恢復(fù)到對(duì)照水平,說(shuō)明這時(shí)青岡櫟幼苗保水能力開(kāi)始降低;而重度干旱脅迫復(fù)水后的青岡櫟幼苗Pn顯著低于對(duì)照,說(shuō)明重度脅迫對(duì)其葉片的細(xì)胞膜造成了一定的損傷,在日后青岡櫟幼苗撫育管理中,應(yīng)避免其遭受中度以上干旱脅迫。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fo、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo)可反映光合作用“內(nèi)秉性”特點(diǎn)[29]。大量研究發(fā)現(xiàn),植物在遭受輕度干旱脅迫時(shí),葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化不顯著,而當(dāng)植物遭受中、重度干旱脅迫時(shí),Fm、Fv/Fm、Fv/Fo均迅速下降,而Fo則顯著升高,光合作用反應(yīng)中心PSⅡ會(huì)出現(xiàn)可逆性的損傷或不可逆的傷害,導(dǎo)致光合原初反應(yīng)過(guò)程受阻,進(jìn)而降低植物的光合作用效率[7,30-31]。本研究也發(fā)現(xiàn),青岡櫟幼苗Fo隨干旱脅迫程度加劇呈顯著升高趨勢(shì),而Fm、Fv/Fm和Fv/Fo呈顯著降低趨勢(shì),且輕度脅迫下葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)與對(duì)照差異均不顯著,而從中度脅迫開(kāi)始葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化顯著,重度脅迫則進(jìn)一步加大了葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對(duì)照間的顯著差異性。說(shuō)明中度和重度干旱脅迫抑制了青岡櫟幼苗PSⅡ反應(yīng)中心的活性及電子傳遞,產(chǎn)生了光抑制現(xiàn)象,導(dǎo)致其生長(zhǎng)受到一定程度的損害。復(fù)水使各干旱脅迫下青岡櫟幼苗的Fo比其復(fù)水前降低,Fm、Fv/Fm和Fv/Fo則比其復(fù)水前有不同程度的增加。其中,輕度脅迫復(fù)水后青岡櫟幼苗Fo可恢復(fù)到對(duì)照水平,而其Fm、Fv/Fm和Fv/Fo均達(dá)到峰值;中度和重度脅迫復(fù)水后其Fo均未恢復(fù)到對(duì)照水平,仍顯著高于對(duì)照,且重度脅迫復(fù)水后Fv/Fm和Fv/Fo仍均略低于對(duì)照,Fv/Fm僅為0.75。說(shuō)明當(dāng)青岡櫟幼苗遭受中度以上干旱脅迫(-0.9 MPa)時(shí),在解除干旱脅迫后,遭受損傷的光合作用反應(yīng)中心PSⅡ雖得到了一定程度的修復(fù),但尚未恢復(fù)至干旱脅迫前的水平,此時(shí)青岡櫟幼苗光合作用反應(yīng)中心受到光抑制,反應(yīng)中心發(fā)生較嚴(yán)重?fù)p傷[27]。這與孫婭楠等對(duì)棕櫚(Trachycarpus fortunei)幼苗的相關(guān)研究結(jié)論相同[30]。

氣孔是植物和外界環(huán)境進(jìn)行氣體和水分交換的重要通道,植物對(duì)氣孔器大小、開(kāi)口、密度的調(diào)節(jié)是植物抵御干旱逆境的機(jī)制之一[32]。本研究結(jié)果顯示,青岡櫟幼苗氣孔主要分布在葉下表皮,這種結(jié)構(gòu)特征既可以保證正常氣體交換,同時(shí)能抑制水分散失,達(dá)到同時(shí)提高水分利用率和抗旱能力的目的;此外,本研究中青岡櫟幼苗葉片氣孔器大小(長(zhǎng)度、寬度)、氣孔開(kāi)口面積隨干旱脅迫加劇均呈顯著減少趨勢(shì),而氣孔密度則呈極顯著增加趨勢(shì),說(shuō)明在干旱環(huán)境下,青岡櫟幼苗葉片通過(guò)小氣孔口面積、大氣孔密度來(lái)降低蒸騰速率、減少水分損失、維持其生理代謝活動(dòng),但由于中度和重度脅迫處理葉片氣孔口開(kāi)度(面積)迅速降低,也導(dǎo)致其Pn快速降低,幼苗生長(zhǎng)變慢。目前,大量研究發(fā)現(xiàn),不同植物葉片氣孔特征應(yīng)對(duì)干旱環(huán)境的規(guī)律不同,前人對(duì)楊樹(shù)(Populus)[33]和赤皮青岡(Cyclobalanopsis gilva)[34]的研究表明,隨干旱脅迫加劇,葉片氣孔密度與氣孔口開(kāi)度呈負(fù)相關(guān)變化,氣孔大小和密度與其蒸騰失水量直接相關(guān);同時(shí),氣孔密度大在一定程度上有利于光合作用和散熱,可避免熱害使葉綠體和原生質(zhì)體發(fā)生變性。本研究結(jié)果與之一致。但也有不同研究結(jié)論,例如何鳳等[35]對(duì)杜仲(Eucommia ulmoides)研究發(fā)現(xiàn),隨干旱脅迫加劇,氣孔密度表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì),而氣孔面積、氣孔器長(zhǎng)寬則表現(xiàn)為增-減-增的變化趨勢(shì);Qiang 等研究發(fā)現(xiàn)青海云杉(Picea crassifolia)氣孔密度隨干旱脅迫加劇而降低[36]。因此,不同植物葉片氣孔特征對(duì)環(huán)境條件的響應(yīng)與適應(yīng)具有多樣和復(fù)雜性,還需對(duì)其深入研究。在本研究環(huán)境條件下,干旱脅迫加劇可能使青岡櫟幼苗葉片面積減小[26],導(dǎo)致單位面積的氣孔數(shù)目增加,使得氣孔密度增大;復(fù)水未對(duì)各干旱脅迫處理下的氣孔器長(zhǎng)寬以及密度變化產(chǎn)生影響,但復(fù)水使青岡櫟幼苗氣孔開(kāi)口面積均比其復(fù)水前顯著提高。其中,輕度干旱脅迫復(fù)水后青岡櫟幼苗氣孔開(kāi)口面積恢復(fù)到對(duì)照水平,中度干旱脅迫復(fù)水后氣孔開(kāi)口面積還是略低于對(duì)照;重度脅迫復(fù)水后氣孔開(kāi)口面積則仍顯著低于對(duì)照,說(shuō)明當(dāng)干旱脅迫強(qiáng)度達(dá)到中度水平(-0.9 MPa)時(shí),對(duì)青岡櫟幼苗進(jìn)行旱后復(fù)水,并不能使其氣孔開(kāi)口迅速恢復(fù)打開(kāi),從而限制了光合作用的恢復(fù)。

青岡櫟葉片為異面葉,由緊密排列的上表皮細(xì)胞、柵欄組織、疏松的海綿組織和下表皮細(xì)胞、表皮毛構(gòu)成,葉脈粗大向下隆起。葉片厚度、表皮細(xì)胞、柵欄組織、海綿組織、主葉脈等結(jié)構(gòu)都與植物的抗旱性關(guān)系密切。一般而言,柵欄組織越厚,海綿組織越薄,柵海比越大,主脈越粗大、導(dǎo)管直徑越大葉片的耐旱性越強(qiáng),反之,則耐旱性越差[35]。本研究發(fā)現(xiàn),青岡櫟幼苗葉片上下表皮厚度隨干旱脅迫程度加劇均呈極顯著增加趨勢(shì),且上表皮厚度增加更多;葉片厚度和柵欄組織厚度均呈先增加后下降趨勢(shì),且重度脅迫使葉片柵欄組織厚度低于對(duì)照;同時(shí),海綿組織厚度隨干旱脅迫加劇呈顯著降低趨勢(shì),干旱脅迫使其柵海比高于對(duì)照,且比值均大于1,并以中度脅迫下柵海比值最大(1.29±0.29),說(shuō)明在輕度和中度干旱脅迫下,青岡櫟幼苗可以更有效通過(guò)增加上表皮細(xì)胞厚度和排列緊密度、發(fā)育發(fā)達(dá)的葉肉柵欄組織,相對(duì)減少海綿組織厚度,提高柵海比,從而增大葉片組織緊密度,避免植物葉肉細(xì)胞遭受強(qiáng)光灼傷,同時(shí)充分利用衍射光進(jìn)行光合作用,有利于提高或保持青岡櫟幼苗的保水能力和耐旱能力;但通過(guò)調(diào)節(jié)青岡櫟葉片結(jié)構(gòu)適應(yīng)干旱環(huán)境的能力是有限的,當(dāng)干旱脅迫強(qiáng)度到達(dá)重度水平時(shí)(-1.2 MPa),青岡櫟幼苗葉片柵欄組織厚度開(kāi)始低于對(duì)照組,導(dǎo)致柵海比開(kāi)始降低,其耐旱能力減弱。此外,當(dāng)干旱脅迫強(qiáng)度達(dá)到重度時(shí),青岡櫟幼苗的主葉脈厚度開(kāi)始顯著迅速減小,且主脈導(dǎo)管直徑并無(wú)顯著增加,也進(jìn)一步說(shuō)明青岡櫟幼苗并不能通過(guò)迅速改變?nèi)~片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)重度干旱脅迫。有研究表明,葉片主脈的大小跟水分在植物體內(nèi)的運(yùn)輸效率直接相關(guān),越粗的主脈具備越強(qiáng)的水分控制能力,其可在高溫及干旱條件下加快蒸騰,降低葉表溫度,從而避免植物體受高溫及干旱傷害[34]。盡管復(fù)水后,輕度、中度和重度脅迫下青岡櫟幼苗葉片厚度、上下表皮、柵欄組織、海綿組織厚度以及柵海比均恢復(fù)到或優(yōu)于對(duì)照;但復(fù)水后,重度脅迫下青岡櫟幼苗主葉脈厚度還仍略低于對(duì)照,導(dǎo)管直徑也并未顯著提高,說(shuō)明青岡櫟幼苗在重度干旱脅迫下經(jīng)短期復(fù)水后導(dǎo)管吸水和輸水的恢復(fù)能力較弱。

4 結(jié)論

青岡櫟幼苗葉片在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、光合作用、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等方面均對(duì)干旱脅迫和復(fù)水表現(xiàn)出明顯的響應(yīng)。在輕度干旱脅迫下,青岡櫟幼苗通過(guò)有效改變?nèi)~片結(jié)構(gòu)引起葉片生理功能變化,誘發(fā)青岡櫟幼苗積極的水分應(yīng)對(duì)策略,保證幼苗健康生長(zhǎng),且復(fù)水后青岡櫟幼苗各指標(biāo)均優(yōu)于或恢復(fù)到對(duì)照水平。在中度干旱脅迫下,青岡櫟幼苗主要通過(guò)顯著增加葉片厚度、主葉脈厚度,以及提高最大柵海比,維持幼苗生長(zhǎng),但其Pn、Gs、Tr、WUE 和部分葉綠素?zé)晒鈪?shù)均顯著降低,其耐旱能力降低,復(fù)水后,僅有部分葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)和光合生理、葉綠素?zé)晒鈪?shù)恢復(fù)到對(duì)照水平,說(shuō)明其旱后恢復(fù)能力開(kāi)始下降。重度干旱脅迫嚴(yán)重抑制青岡櫟幼苗氣孔口開(kāi)度,柵海比未顯著提高,光合同化能力受到抑制,PSⅡ光系統(tǒng)反應(yīng)中心受損,但未出現(xiàn)幼苗死亡現(xiàn)象;重度干旱復(fù)水后,幼苗葉片各項(xiàng)光合指標(biāo)均未能恢復(fù)到對(duì)照水平,Fv/Fm僅為0.75。因此,青岡櫟幼苗具有一定的耐旱性和旱后恢復(fù)能力,適合作為喀斯特地區(qū)的生態(tài)恢復(fù)樹(shù)種,但在青岡櫟幼苗撫育階段,應(yīng)保證土壤水勢(shì)不低于-0.9 MPa,維持其更強(qiáng)的旱后恢復(fù)能力,從而更有利于幼苗生長(zhǎng)。