楊林錦,杜麗霞,宋國(guó)強(qiáng),郭遠(yuǎn)達(dá),金宇昕,姜麗嬌,田 健

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長(zhǎng)春 130117;2.吉林省一汽總醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130013)

人參(PanaxginsengC.A.Mey.),是吉林省道地藥材,五加科人參的干燥根和根莖[1],可補(bǔ)元?dú)?安神,益脾,益肺,益智,生津[2]。人參發(fā)酵產(chǎn)物是采用人參根為君藥,經(jīng)過(guò)發(fā)酵后而得到的一種藥物。經(jīng)發(fā)酵,人參有效成分中的稀有皂苷含量大大增加[3-5]。稀有皂苷對(duì)腫瘤、不同種類的癌癥有明顯的治療和抑制作用[6-9],對(duì)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移預(yù)防有借鑒作用,可用于輔助治療腫瘤。本實(shí)驗(yàn)以人參發(fā)酵產(chǎn)物為研究對(duì)象研究人參總皂苷成分的提純過(guò)程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品(人參皂苷Re),中國(guó)藥品生物制品鑒定所;人參藥材購(gòu)于長(zhǎng)春市宏檢大藥房,經(jīng)翁麗麗教授(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué))鑒定;D101、AB-8、DM130、X-5、HPD100、HP20型大孔吸附樹(shù)脂(河北滄州寶恩化工有限公司);實(shí)驗(yàn)所用液體試劑全部為分析純、固體試劑為化學(xué)純、水為純凈水。

萬(wàn)分之一電子天平EL204,METTLER TOLEDO;十萬(wàn)分之一電子天平AB135-S,METTLER TOLEDO;TU-1810系列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SORVALL Evolution離心機(jī),Kendro Laboratory 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參總皂苷的含量測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)照品人參總皂苷Re溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re 5 mg,置于25 mL容量瓶中,加入適量甲醇溶化后,稀釋定容至刻度線,搖勻即得0.200 4 mg/mL的Re溶液。

1.2.1.2 供試品溶液制備

精密稱取研細(xì)的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取物1 g,置于25 mL容量瓶中,加入適量蒸餾水后,超聲后放置陰涼處冷卻,再加入蒸餾水,定容至刻度,搖勻,以等量水飽和正丁醇溶液,分4次萃取,干燥,即得。取干燥后的供試品置于50 mL的量瓶?jī)?nèi),加入適量甲醇溶液至刻線,搖勻。再?gòu)闹芯芪? mL的續(xù)濾液置于10 mL容量瓶中,用甲醇將濾液定容到刻線上,并搖勻。

1.2.1.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

分別精密地吸取1 mL對(duì)照物溶液和0.1 mL供試品溶液,置于具塞試管內(nèi),低溫?fù)]發(fā)溶劑,加入5%香草醛高氯酸溶液0.5 mL,立即搖晃,即成。在60 ℃水浴中加熱15 min,然后放入冰水中立即冷卻,加入77%的5 mL硫酸溶液,搖晃均勻即可。使用相應(yīng)試劑作為空白溶液。

波長(zhǎng)300～700 nm范圍內(nèi)光譜掃描。人參皂苷Re對(duì)照品和供試品在540 nm處吸收峰最大,因此選擇其作為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.2 大孔樹(shù)脂純化工藝優(yōu)選

根據(jù)《中國(guó)藥典》人參總皂苷項(xiàng)下的提純方法及文獻(xiàn)報(bào)道,人參中的有效成分主要是人參皂苷類成分,而人參皂苷成分提純大多采用的是大孔樹(shù)脂吸附。大孔樹(shù)脂吸附性能各型號(hào)不同[10-15]。本文選取了D101、HP20、AB-8、X-5、DM130、HPD100的樹(shù)脂進(jìn)行考察。

1.2.2.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理方法

在適量的95%乙醇中分別加入6種不同型號(hào)未經(jīng)處理的大孔樹(shù)脂,浸泡24 h,使之充分溶脹。濕法裝柱,用95%乙醇沖洗。向蒸餾水中加入待流出的95%乙醇溶液,當(dāng)蒸餾水中不再呈現(xiàn)白色混濁液后,用蒸餾水將其沖至沒(méi)有乙醇味的狀態(tài)。用5%的鹽酸溶液浸泡4 h,以5 BV/h的流速經(jīng)大孔樹(shù)脂,用蒸餾水沖至中性;然后再用2%氫氧化鈉溶液浸泡4 h,以同樣的流速通過(guò)樹(shù)脂,用蒸餾水沖至中性后,在水中浸泡。最后將以上處理過(guò)的樹(shù)脂保存在95%的乙醇溶液中備后續(xù)使用。

1.2.2.2 最大吸附量和靜態(tài)解析率

用濾紙吸干其大孔樹(shù)脂表面的水分,分別稱取10.0 g預(yù)處理后不同型號(hào)的樹(shù)脂各兩份。其中一份放置有塞的錐形瓶中,精密地加入質(zhì)量濃度為20.31 mg/mL的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液25 mL。浸泡6 h,每隔30 min左右振蕩一次,攪拌60 s,再靜置吸附24 h。過(guò)濾后,按總皂苷含量測(cè)定方法,測(cè)定其吸光度。另一份樹(shù)脂自然晾干后稱重,求濾液中皂苷的總含量及其飽和吸附量Qe。

Qe=(c0-c1)V/m,

其中,c0、c1為分析物的初始濃度和平衡濃度,V為吸附體積,m為樹(shù)脂質(zhì)量。

將100 mL 70%乙醇,加入水洗后的飽和吸附樹(shù)脂中,在常溫條件下,浸泡2 h,每隔10 min搖動(dòng)60 s,濾過(guò)。按總皂苷含量測(cè)定靜態(tài)解析率D。

D=(cdVd/Qe)×100%,

其中,cd為解析液濃度,Vd為解析液體積。

1.2.2.3 提取液上樣濃度選擇

取3份處理妥當(dāng)?shù)臉?shù)脂。另取3份不同濃度發(fā)酵產(chǎn)物提取液,分別上柱。先用上樣速度2 BV/h,吸附1 h。然后將雜質(zhì)用蒸餾水洗去,再將有效成分用5 BV的70%乙醇溶液洗去,最后以4 BV/h的速度洗去。旋蒸回收后測(cè)定。

1.2.2.4 提取液上樣pH值(酸堿度)選擇

取D101型號(hào)25 g的大孔樹(shù)脂,采用濕法填充后,取4份相同濃度的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液,將其酸堿度分別調(diào)整為3.5(原液酸堿度)、5、7,9,先用2 BV/h的上樣速度吸附1 h。按前面方法洗去雜質(zhì),洗去有效成分。乙醇回收后測(cè)定。

1.2.2.5 上樣液上樣速度考察

取處理妥當(dāng)?shù)腄101大孔樹(shù)脂25 g。濕法裝柱。取質(zhì)量濃度0.8 g/mL的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液3份,采用不同速度上樣,吸附1 h。按前面方法洗去雜質(zhì),洗去有效成分。乙醇回收后測(cè)定。

1.2.2.6 樣液吸附時(shí)間考察

取處理妥當(dāng)?shù)腄101大孔樹(shù)脂25 g,濕法填裝。取質(zhì)量濃度0.8 g/mL的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液3份,上樣速度為2 BV/h。上樣后,分別靜置不同時(shí)間,再按前面方法洗去雜質(zhì),洗去有效成分。乙醇回收后測(cè)定。

1.2.2.7 洗脫劑種類考察

取處理妥當(dāng)?shù)腄101大孔樹(shù)脂25 g,濕法填裝。取質(zhì)量濃度0.8 g/mL的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液3份,上樣速度為2 BV/h上樣,靜置吸附1 h,按前面方法洗去雜質(zhì),再分別用不同濃度乙醇,洗去有效成分。再進(jìn)行乙醇回收,然后進(jìn)行測(cè)定。

1.3 工藝驗(yàn)證

采用濕法裝柱的25 g D101大孔樹(shù)脂進(jìn)行適當(dāng)處理,取質(zhì)量濃度0.8 g/mL的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液3份,上樣速度為2 BV/h,靜置吸附1 h,用蒸餾水洗去未吸附雜質(zhì),再用75%乙醇溶液洗去有效成分,將乙醇浸出液分別收集后測(cè)定。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精準(zhǔn)量取人參皂苷Re對(duì)照品0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mL溶液,在540 nm處測(cè)定吸光度,同上法顯色。取對(duì)照品人參皂苷Re溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以其吸光度的值為縱坐標(biāo)求得回歸方程:Y=0.011 32X-0.002 9,r=0.999 9。在7.287～80.160 μg/mL的范圍內(nèi),人參皂苷Re的線性關(guān)系較好。

2.2 最大吸附量和靜態(tài)解析率

6種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂的飽和吸附量和靜態(tài)解析率考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂的飽和吸附量和靜態(tài)解析率結(jié)果

從表1可以看出,在解析率上,雖然DM130型和HPD100型樹(shù)脂比D101型稍大一些,但是三者之間并沒(méi)有太大的差別。但在靜態(tài)吸附量上,D101的大孔樹(shù)脂明顯高于其他型號(hào),因此在人參總皂苷提取物的純化樹(shù)脂中選用了D101的大孔樹(shù)脂。

2.3 提取液上樣濃度選擇

選用不同濃度的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液上樣的結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取液的上柱濃度考察結(jié)果表

根據(jù)表2,選擇上樣液質(zhì)量濃度定為0.8 g/L時(shí),測(cè)得洗脫液中總皂苷的含量最高。選擇0.8 g/mL為最優(yōu)的上樣質(zhì)量濃度。

2.4 提取液上樣pH值選擇

對(duì)人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)后上樣,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 提取液上柱pH考察結(jié)果

根據(jù)表3,原液與pH呈中性時(shí)的提取液比較,兩者的總皂苷含量相似,而更適合大生產(chǎn)的是不用調(diào)節(jié)酸堿度的原液。

2.5 上樣液上樣速度考察

在人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液上樣時(shí)采用不同的上樣速度,結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)表4看出,上樣速度為2 BV/h,洗脫液中皂苷的含量最佳。

表4 提取液上樣速度考察結(jié)果表

2.6 上樣液吸附時(shí)間考察

人參發(fā)酵產(chǎn)物提取液上樣后,分別靜置不同時(shí)間進(jìn)行吸附,結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)表5,總皂苷在不同吸附時(shí)間內(nèi)的吸附量相差不大,最好的條件是選短1 h的上樣吸附時(shí)間。

表5 提取液上樣液吸附時(shí)間的考察結(jié)果

2.7 洗脫劑種類考察

經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)確定乙醇為最適洗脫溶劑,不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液洗脫人參發(fā)酵產(chǎn)物提取物中總皂苷的結(jié)果見(jiàn)表6。根據(jù)表6,有效成分從75%的乙醇中洗脫得到的皂苷的量是最高的。

表6 洗脫劑的種類的考察結(jié)果

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)選的工藝條件下,采用D101型大孔樹(shù)脂對(duì)人參發(fā)酵產(chǎn)物提取物,分別進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次,結(jié)果見(jiàn)表7。根據(jù)表7,人參發(fā)酵產(chǎn)物總皂苷經(jīng)過(guò)D101型大孔樹(shù)脂純化,其工藝具有穩(wěn)定性和可行性。

表7 大孔樹(shù)脂純化總皂苷驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究將6種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)人參發(fā)酵產(chǎn)物總皂苷的吸附和解吸性能進(jìn)行比較,考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣速度、吸附時(shí)間等因素對(duì)提純效果的影響。顯示D101樹(shù)脂分離純化效果最佳。取處理妥當(dāng)?shù)腄101大孔樹(shù)脂,濕法填裝,0.8 g/mL的人參發(fā)酵產(chǎn)物提取原液上樣,上樣速度為2 BV/h,吸附1 h,水溶性雜質(zhì)先用蒸餾水洗去,再用5BV的75%乙醇溶液洗去,收集洗脫液,回收乙醇,干燥并粉碎。純化工藝穩(wěn)定可靠,為后續(xù)人參發(fā)酵產(chǎn)物不同劑型的制備工藝研究提供理論參考。