張一幟,任小俠,辛凌翔,朱良全,孫 淼,李 建,張 媛,馮 妍,王秀麗,劉元杰,劉 燕

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥評(píng)審中心),北京 100081)

羊鏈球菌病是由溶血性鏈球菌所引起的一種急性熱性傳染病,屬鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus)[1]。該病原為革蘭氏陽(yáng)性球菌,多呈鏈條狀。羊通常于氣候寒冷時(shí)出現(xiàn)發(fā)病,幼齡羊及母羊的發(fā)病率較高。發(fā)病多為急性型,發(fā)病羊出現(xiàn)體溫升高(大于41 ℃)、精神萎靡、行動(dòng)不便、眼結(jié)膜充血、咽喉腫脹,剖檢可見膽囊腫大以及纖維素性肺炎[2]。

我國(guó)目前發(fā)現(xiàn)的羊鏈球菌由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心保藏并編號(hào)為CVCC55001、CVCC55002。此兩種菌為羊鏈球菌滅活疫苗效力檢驗(yàn)用的強(qiáng)毒菌種,也是羊鏈球菌病疫苗的生產(chǎn)用菌種,最早由青海牧醫(yī)所于青海省貴南縣分離所得。CVCC55001、CVCC55002血清型均為蘭氏C型,能水解淀粉,不發(fā)酵水楊苷[3]。紅霉素、四環(huán)素、青霉素、金霉素等抗生素類以及磺胺類藥物都能夠?qū)υ摼鸬搅己玫臍饔肹4]。目前對(duì)于該菌的感染及致病機(jī)理方面的研究較為欠缺,建立一種穩(wěn)定可靠的感染動(dòng)物模型對(duì)于羊鏈球菌病的研究至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002 株,2016年3月22日,由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心提供。鏈球菌馬獸疫亞種CVCC55138,2014年2月25日,由國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 馬丁瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基、緩沖肉湯培養(yǎng)基、生理鹽水、均購(gòu)自北京中海生物技術(shù)有限公司;莢膜染色試劑盒購(gòu)自Solarbio公司、ATB 鏈球菌快速鑒定試劑盒、哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自Bio Mérieux公司;新生牛血清購(gòu)自四季青生物;革蘭氏染色液購(gòu)自海博生物;莢膜染色液購(gòu)自源葉生物;鏈球菌分型試劑盒購(gòu)自O(shè)xoid公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18～22 g SPF級(jí)昆明小鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液培養(yǎng) 開啟凍干羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002株各一支,用0.5 mL馬丁肉湯溶解后,分別接種含10%綿羊脫纖血馬丁瓊脂平板(以下簡(jiǎn)稱血平板)2付,37 ℃培養(yǎng)18 h。之后挑取該平板上的典型菌落,分別接種含10%綿羊脫纖血瓊脂斜面2支,37 ℃培養(yǎng)24 h,血斜培養(yǎng)物呈灰色、半透明、濕潤(rùn)、粘稠。將血斜培養(yǎng)物劃取少量接種含10%新生牛血清的馬丁肉湯,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,肉湯培養(yǎng)物一致混濁,無(wú)菌膜。

1.2.3 菌液凍存與定量 將培養(yǎng)好的羊鏈球菌緩沖肉湯培養(yǎng)物加入滅菌甘油(終濃度為20%),3 mL/支分裝于15 mL離心管中,置于冰箱(-70 ℃以下)凍存。凍存3 d后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),分別取出CVCC55001、CVCC55002株各一支,使用緩沖肉湯進(jìn)行105倍稀釋后,再進(jìn)行3倍稀釋,之后吸取0.1 mL加至含10%新生牛血清的TSA培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。之后分別于凍存后7 d、21 d、49 d、63 d進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)羊鏈球菌的凍存保存期。

1.2.4 小鼠測(cè)毒 購(gòu)買18～22 g SPF級(jí)昆明小鼠于ABSL-2級(jí)負(fù)壓動(dòng)物舍獨(dú)立通氣籠具內(nèi)飼養(yǎng),按照活菌計(jì)數(shù)預(yù)數(shù)結(jié)果分別將CVCC55001、CVCC55002菌液稀釋至5、15、25、35、45、55 CFU/mL。0.2 mL/只腹腔注射昆明小鼠,每組10只。每日觀察統(tǒng)計(jì)小鼠狀態(tài),無(wú)菌狀態(tài)下剖檢死亡小鼠,采集心血,收集心、肝、脾、肺、淋巴組織固定后進(jìn)行H&E染色,對(duì)比各組小鼠病變情況。

1.2.5 細(xì)菌形態(tài)和生化鑒定 無(wú)菌環(huán)境采集死亡小鼠心血,劃線接種哥倫比亞血瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取典型單菌落進(jìn)行莢膜染色,使用ATB鏈球菌快速鑒定試劑盒參照使用說(shuō)明書對(duì)于心血培養(yǎng)菌進(jìn)行生化特性鑒定。

1.2.6 PCR鑒定 根據(jù)GenBank中馬鏈球菌獸疫亞種16S rDNA基因序列(定位號(hào):EU784820.1)設(shè)計(jì)引物(上游引物:TATCTGTGAGTCGCGAACGG;下游引物:GCCGTCCCTTTCTGGTTAGT),目的片段大小為424 bp,引物由華大基因合成。反應(yīng)體系為25 μL(詳見表1)。反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,循環(huán)35次;終延伸72 ℃ 10 min。結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳檢測(cè)。

表1 PCR反應(yīng)體系Tab 1 PCR reaction system

1.2.7 ANI檢測(cè) 將菌種液體培養(yǎng)物加入甘油(20%終體積),委托南京派森諾基因科技有限公司進(jìn)行ANI檢測(cè)分析,選用參考基因組為Streptococcusequisubsp.zooepidemicus(NCBI編號(hào):ASM1568945v1),使用OAT軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002的凍存保存期評(píng)價(jià) 由于活菌計(jì)數(shù)需要培養(yǎng)一定時(shí)間,其結(jié)果的延后性導(dǎo)致無(wú)法實(shí)時(shí)明確攻毒菌液的活菌含量。目前一般采用培養(yǎng)及保存條件相同的菌液,以預(yù)實(shí)驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果確定正式實(shí)驗(yàn)的菌液濃度,本研究通過(guò)對(duì)羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002的凍存菌液的活菌數(shù)進(jìn)行評(píng)測(cè),確定其活菌數(shù)相對(duì)穩(wěn)定的期限。將新鮮羊鏈球菌CVCC55001、CVCC 55002緩沖肉湯培養(yǎng)物加入滅菌甘油至甘油終濃度為20%(W/V),使用15 mL離心管進(jìn)行分裝,3 mL/支,標(biāo)記后放入-70 ℃以下冰柜進(jìn)行凍存。分別于凍存后3 d、7 d、21 d、35 d、49 d、63 d、77 d各取出一支羊鏈球菌CVCC55001、CVCC 55002凍存菌液,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),結(jié)果如表2所示,說(shuō)明本方法保存的菌液在35 d內(nèi)細(xì)菌濃度相對(duì)穩(wěn)定,以預(yù)數(shù)濃度作為實(shí)際濃度進(jìn)行使用偏差小于10%,保存超過(guò)5周后菌數(shù)下降較快,保存77 d后分別下降了45.9%、51.2%。

表2 CVCC55001、CVCC55002菌液凍存保存期評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Evaluation results of freezing storage period of strain CVCC55001 and CVCC55002 bacterial liquid

2.2 羊鏈球菌CVCC55001、CVCC55002平均核苷酸一致性分析檢測(cè)(ANI) 之前的研究已經(jīng)利用經(jīng)典生化反應(yīng)鑒定及16S rDNA測(cè)序鑒定CVCC55001、CVCC55002均屬鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus)[1]。本研究使用平均核苷酸一致性分析(ANI)對(duì)于CVCC55001、CVCC55002與鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種進(jìn)行驗(yàn)證性比對(duì)。ANI是基于物種全基因組序列,通過(guò)分析比較同源基因序列來(lái)判定物種間的遺傳關(guān)聯(lián)性的重要參數(shù),可以直觀表示物種間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。ANI與16S rDNA相比,其親緣關(guān)系計(jì)算中并不受單個(gè)基因或者少數(shù)基因變化的遺傳速率和基因水平轉(zhuǎn)移影響。屬間、種間及亞種間兩兩菌株間ANI與其分類地位相關(guān),具有明顯的屬種特異性,一般屬間的ANI 值分布于50%～65%,種間的ANI 值分布65%～90%,亞種間的ANI 值分布于90%～96%。將CVCC55001與CVCC55002菌種制備為甘油菌后送至公司測(cè)序,使用參考基因組Streptococcusequisubsp.zooepidemicus進(jìn)行比對(duì),使用直系同源修正得到OrthoANI值[5](表3),結(jié)果顯示,CVCC55001、CVCC55002與鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種應(yīng)屬同一亞種,且CVCC55001與CVCC55002之間相似度非常高。

表3 CVCC55001、CVCC55002平均核苷酸一致性分析結(jié)果Tab 3 Average Nucleotide Identity Test Results of Strain CVCC55001 and CVCC55002

2.3 兩株羊鏈球菌對(duì)昆明小鼠毒力測(cè)定 將稀釋好的CVCC55001、CVCC55002腹腔注射18～22 g昆明小鼠,記錄小鼠死亡情況(表4)。結(jié)果顯示CVCC55001對(duì)于昆明小鼠的最小致死劑量為9 CFU;CVCC55002對(duì)于昆明小鼠的最小致死劑量為11 CFU。

表4 CVCC55001、CVCC55002菌種毒力測(cè)定結(jié)果Tab 4 Toxicity test results of strain CVCC55001 and CVCC55002

2.4 羊鏈球菌對(duì)昆明小鼠攻毒后臨床及剖檢癥狀攻毒后每日觀察小鼠臨床表現(xiàn),攻毒12 h后部分小鼠開始出現(xiàn)萎靡厭食、呼吸急促的狀況,部分組(5 CFU～11 CFU組)小鼠開始出現(xiàn)死亡,1 CFU組小鼠基本正常。攻毒24 h至72 h為死亡高峰期,大部分小鼠在出現(xiàn)顫抖、站立困難、背毛凌亂等情況后的12 h內(nèi)死亡,至攻毒96 h后不再出現(xiàn)新增死亡小鼠?？瞻讓?duì)照組小鼠均表現(xiàn)正常。

對(duì)于兩株菌攻毒死亡小鼠進(jìn)行剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn),CVCC55001株及CVCC55002株攻毒死亡小鼠均出現(xiàn)胸腔積液,肝臟出血,邊緣泛白,腸道液化性壞死,脾臟腫大、出血(圖1、圖2)。

圖1 CVCC55001株(左上)、CVCC55002株(左下)攻毒后小鼠剖檢情況Fig 1 Autopsy of mice after strain CVCC55001(top left)and CVCC55002(bottom left)challenge

圖2 CVCC55001株、CVCC55002株攻毒后小鼠脾臟、肺、肝臟病變情況Fig 2 Pathological changes of spleen, lung and liver in mice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge

2.5 羊鏈球菌攻毒昆明小鼠的病理變化 對(duì)于小鼠進(jìn)行剖檢,分別取下攻毒組和空白組小鼠的心、肝、脾、肺、腸道組織放入4%多聚甲醛溶液中固定,之后進(jìn)行H&E染色,結(jié)果如圖3所示,羊鏈球菌感染后腸道黏膜層廣泛自溶,呈無(wú)結(jié)構(gòu)的嗜酸性物,腸絨毛及腸腺結(jié)構(gòu)消失,而對(duì)照組黏膜層上皮完整,腸絨毛豐富均勻,固有層腸腺排列緊密,肌層肌細(xì)胞形態(tài)正常;羊鏈球菌感染小鼠肺臟肺泡壁輕度增厚,肺泡間距增寬,并伴有少量的粒細(xì)胞浸潤(rùn),多見血管淤血,部分支氣管腔內(nèi)及周圍肺泡腔內(nèi)見少量紅細(xì)胞;對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則、整齊,肝竇無(wú)明顯擴(kuò)張或擠壓,未見明顯壞死、增生及炎性改變,羊鏈球菌感染組與對(duì)照相比,肝竇輕度淤血、擴(kuò)張,肝細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死,胞核固縮深染、碎裂或溶解,多見血管結(jié)構(gòu)消失,與周圍組織融合呈無(wú)結(jié)構(gòu)的嗜酸性物質(zhì);對(duì)照組視野內(nèi)心肌纖維著色均勻,細(xì)胞分界清楚,走形一致,間質(zhì)未見異常,羊鏈球菌感染組間質(zhì)輕度水腫,結(jié)締組織排列疏松,同時(shí)伴有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),心肌細(xì)胞間距增寬;對(duì)照組脾臟視野內(nèi)白髓與紅髓分布分界清晰,細(xì)胞數(shù)量豐富,排列緊密。羊鏈球菌感染組小鼠脾臟組織廣泛壞死、出血,組織原有結(jié)構(gòu)消失,廣泛可見壞死的細(xì)胞碎片、大量的紅細(xì)胞,可見大量的粒細(xì)胞呈彌散性浸潤(rùn)。

圖3 羊鏈球菌CVCC55001株、CVCC55002株攻毒昆明小鼠的病理變化(200×)Fig 3 Pathological changes in KM mice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge(200×)

2.6 羊鏈球菌形態(tài)和生化特性鑒定 將攻毒小鼠進(jìn)行剖檢,分別取感染小鼠心血進(jìn)行劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h后,挑取典型單菌落進(jìn)行莢膜染色,結(jié)果中圍繞著色菌體(藍(lán)紫色)外的一層透明物質(zhì)即為莢膜(圖4紅色箭頭),結(jié)果顯示CVCC55001和CVCC55002株羊鏈球菌均具有莢膜。將羊鏈球菌哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)物收集后,按照ATB鏈球菌快速鑒定試劑盒說(shuō)明書制備菌懸液后進(jìn)行生化特性鑒定,CVCC55001和CVCC55002株羊鏈球菌結(jié)果均符合馬鏈球菌獸疫亞種生化特性(表5)。

圖4 羊鏈球菌CVCC55001株、CVCC55002株攻毒昆明小鼠分離菌莢膜染色(100×)Fig 4 Capsule staining of bacteria isolated from infected mice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge(100×)

表5 CVCC55001、CVCC55002菌種生化特性檢定結(jié)果Tab 5 Biochemical characteristics results of strain CVCC55001 and CVCC55002

2.7 羊鏈球菌PCR鑒定 選取攻毒小鼠分離菌平板上的典型單菌落加入TSB(含5%血清)中,靜置過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定,同時(shí)分別取CVCC55001標(biāo)準(zhǔn)菌、大腸桿菌BL21的新鮮菌液作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照,結(jié)果顯示擴(kuò)增到長(zhǎng)度約424 bp 的目的條帶(圖5),與陽(yáng)性對(duì)照片段大小一致。

1: BM2000分子量標(biāo)準(zhǔn);2: 鏈球菌馬獸疫亞種CVCC55138;3: 大腸桿菌BL21株;4: CVCC55001株攻毒小鼠分離菌; 5: CVCC55002株攻毒小鼠分離菌;6:空白對(duì)照1: BM2000 Marker;2: CVCC55001 Standard Strain;3: E. coli BL21 Strain;4: CVCC55001 strain isolated from mice;5: CVCC55002 strain isolated from mice;6:Blank control圖5 羊鏈球菌CVCC55001株、CVCC55002株攻毒昆明小鼠分離菌PCR鑒定結(jié)果Fig 5 PCR identification of bacteria isolated from infectedmice after strain CVCC55001 and CVCC55002 challenge

3 討 論

羊鏈球菌CVCC55001和CVCC55002株經(jīng)鑒定為蘭氏C群,屬于鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種[1]。它作為機(jī)會(huì)病原體在一定條件下引起馬呼吸道及生殖道感染。人感染該病原體會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重或潛在的致命疾病,包括菌血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、壞死性肌炎和腦膜炎[6]。該菌宿主廣泛,經(jīng)報(bào)道證實(shí)能夠感染人、馬、牛、羊、豬、驢、狐貍、兔、豚鼠、狗、貓和猴等并引起嚴(yán)重病癥[7-8]。

本研究以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,測(cè)定CVCC55001和CVCC55002對(duì)于昆明小鼠的最小致死量,并將死亡小鼠的臨床癥狀、剖檢癥狀及病理變化進(jìn)行全面梳理。值得注意的是從不同宿主體內(nèi)分離得到的菌種對(duì)于不同物種的感染能力也存在差異,Hau等使用兩株鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種感染5月齡豬,結(jié)果證實(shí)由豬體內(nèi)分離強(qiáng)毒株能夠引起豬嚴(yán)重的敗血癥,而從豚鼠中分離得到的鏈球菌馬鏈球菌獸疫亞種對(duì)于豬毒性顯著降低,只引起部分系統(tǒng)性癥狀,未導(dǎo)致豬死亡[9]。Bin T等使用豬源馬獸疫亞種鏈球菌CVCC55138攻毒BALB/c小鼠,測(cè)得BALB/c小鼠對(duì)該菌的致死劑量為2×105CFU[10]。本研究中小鼠對(duì)于羊源CVCC55001和CVCC55002的致死劑量分別為9 CFU和11 CFU,可見不同小鼠品系、不同菌株以及菌株來(lái)源等對(duì)于小鼠模型及毒力均有一定程度的影響。

關(guān)于馬鏈球菌獸疫亞種表面蛋白的研究顯示多種細(xì)菌表面蛋白在宿主和病原體的互作中發(fā)揮著重要作用,這些蛋白作為豬源血清學(xué)驗(yàn)證的生物標(biāo)記抑或亞單位疫苗組分[11]。其中C5a肽酶作為鏈球菌入侵宿主上皮細(xì)胞的重要分子,經(jīng)驗(yàn)證能夠有效保護(hù)小鼠免于馬鏈球菌獸疫亞種致死劑量攻毒導(dǎo)致的死亡[12]。馬鏈球菌獸疫亞種表面典型LPxTG基序細(xì)胞膜錨定結(jié)構(gòu)域MAP具備良好的免疫原性,是亞單位疫苗的潛力候選抗原。此外,Wei等證實(shí)馬鏈球菌獸疫亞種的莢膜多糖對(duì)于其致病性至關(guān)重要,而缺失株在降低了對(duì)于小鼠的毒力之外提供了對(duì)于馬鏈球菌獸疫亞種強(qiáng)毒株的有效保護(hù)作用,為該菌減毒活疫苗的研制提供了思路和方向[13]。

目前我國(guó)市場(chǎng)可售的羊鏈球菌疫苗包括羊敗血性鏈球菌滅活疫苗和羊敗血性鏈球菌活疫苗兩種。這兩種疫苗的檢驗(yàn)強(qiáng)毒菌種為CVCC55001和CVCC55002,根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,羊敗血性鏈球菌滅活疫苗和羊敗血性鏈球菌活疫苗在進(jìn)行效力檢驗(yàn)時(shí),需要使用本動(dòng)物進(jìn)行強(qiáng)毒攻毒[14]。目前該產(chǎn)品在實(shí)際檢驗(yàn)中存在新鮮菌液菌數(shù)差異大、試驗(yàn)重復(fù)性差和生物安全風(fēng)險(xiǎn)高等問(wèn)題,且使用本動(dòng)物進(jìn)行檢驗(yàn)存在健康狀態(tài)不可控、篩選困難、操作繁瑣、人力物力耗費(fèi)高等問(wèn)題。因此,針對(duì)上述疫苗產(chǎn)品開展效力檢驗(yàn)替代方法研究尤為必要,本研究建立了羊鏈球菌檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株CVCC55001、CVCC55002株的昆明小鼠攻毒感染模型,確定了最小致死劑量,并對(duì)其感染和致病性研究展開初步探索,為該菌種毒力、致病機(jī)制及疫苗研究評(píng)價(jià)提供了平臺(tái)支撐。