巫鍇麗 劉鍵鍾 李成梅 曾建榮 龐玉新 嚴(yán)寒靜

摘??要：為應(yīng)對(duì)廣藿香藥材需求量急速增加、無(wú)突出優(yōu)點(diǎn)的品種且品種單一的情況，解決廣藿香道地藥材缺失及種質(zhì)退化、種質(zhì)來(lái)源混亂、易遭受病害蟲(chóng)害等問(wèn)題，本研究通過(guò)輻照誘變育種，設(shè)置梯度劑量的60Co-γ射線，對(duì)愈傷組織、叢生芽、生根苗3種不同生長(zhǎng)階段的廣藿香進(jìn)行輻照處理，觀測(cè)再生植株外觀形態(tài)，篩選出變異植株，測(cè)量其農(nóng)藝性狀和生理生化指標(biāo)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測(cè)定其主要揮發(fā)性成分廣藿香酮及百秋李醇含量。結(jié)果表明：愈傷組織和叢生芽對(duì)60Co-γ射線較為敏感，死亡率較高，生根苗對(duì)60Co-γ射線較為耐受，死亡率較低，最佳誘變育種的方式是采用100?Gy?60Co-γ射線輻照處理生根苗，其誘變率高達(dá)10%。本研究最終獲得29株廣藿香變異植株，分別為三葉輪生、異型葉、深裂葉、狹葉、卷葉、下卷葉和紫色葉7種形態(tài)類(lèi)型植株，通過(guò)比較分析滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸）、抗氧化物質(zhì)（丙二醛、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶）、廣藿香酮和百秋李醇含量，最終篩選得到15株具有潛力植株，分別為：抗逆且高有效成分植株SY7和ZY1；對(duì)環(huán)境敏感且高有效成分植株SY15、SY18和XY1；抗逆植株SY2、SY6、SY19、YY2、YY9和XJY1；高有效成分植株SY10和SY17；“酮型”廣藿香植株SY3和JY1。其中SY7和ZY1為雙重優(yōu)良特性新種質(zhì)，2株“酮型”廣藿香植株對(duì)于解決道地藥材缺失及其種質(zhì)退化等問(wèn)題具有應(yīng)用價(jià)值。本研究采用60Co-γ射線輻照誘變方法選育的廣藿香變異植株，具有較強(qiáng)抗逆性、高有效成分等優(yōu)點(diǎn)，為廣藿香誘變育種以及新品種選育提供成熟方法和潛在種質(zhì)。

關(guān)鍵詞：廣藿香；60Co-γ射線；生理生化指標(biāo)；GC-MS；百秋李醇；廣藿香酮中圖分類(lèi)號(hào)：S567.239??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Screening?and?Evaluation?of?Induced?Mutation?by?60Co-γ?Radiation?of?Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.

WU?Kaili1，?LIU?Jianzhong2，?LI?Chengmei1，?ZENG?Jianrong3，?PANG?Yuxin4*，?YAN?Hanjing1*

1.?School?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guangdong?Pharmaceutical?University，?Guangzhou，?Guangdong，?510006，?China;?2.?Baoan?Peoples?Hospital，?Shenzhen，?Guangdong?518101，?China;?3.?Guangdong?Chaozhou?Health?Vocational?College，?Chaozhou，?Guangdong?515632，?China;?4.?School?of?Pharmacy，?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang，?Guizhou?550025，?China

Abstract：?The?study?was?aimed?to?cope?with?the?rapid?increase?in?demand?for?patchouli?[Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.]?and?to?solve?the?problems?of?lack?of?patchouli?medicinal?materials，?germplasm?degradation，?confusion?of?germplasm?sources，?and?vulnerability?to?diseases?and?pests.?Callus，?cluster?buds?and?rooting?seedling?of?patchouli?were?irradiated?with?a?gradient?dose?of?60Co-γ?rays.?The?appearance?and?morphology?of?regenerated?plants?were?observed，?the?mutated?plants?were?screened，?the?agronomic?traits?and?physiological?and?biochemical?indicators?were?measured，?and?the?content?of?pogostone?and?patchouli?alcohol，?the?main?volatile?components，?were?determined?by?gas?chromatography-mass?spectrometry?（GC-MS）.?The?results?showed?that?calluses?and?cluster?buds?were?more?sensitive?to?60Co-γ?rays?and?had?higher?mortality?rate，?while?rooting?seedlings?were?more?tolerant?to?60Co-γ?rays?and?had?lower?mortality.?The?best?way?to?breed?mutagenesis?is?60Co-γ?treated?rooting?seedlings?with?irradiation?doses?of?100?Gy?with?a?mutagenesis?rate?of?up?to?10%.?In?this?experiment，?29?patchouli?variant?plants?were?obtained，?which?were?divided?into?seven?morphological?types，?namely?three-leaf?whorls，?heteromorphic?leaves，?deep-split?leaves，?narrow?leaves，?coiled?leaves，?undercoiled?leaves?and?purple?leaves.?The?contents?of?osmotic?conditioning?substances?[soluble?sugar，?soluble?protein?and?free?proline?（Pro）]，?antioxidant?substances?[malondialdehyde?（MDA），?peroxidase?（POD），?catalase?（CAT）]，?pogostone?and?patchouli?alcohol?were?compared?and?analyzed.?According?to?the?analysis?results?of?the?above?determination?indicators，?15?potential?plants?were?finally?screened，?namely：?stress-resistant?plants?with?high?effective?components?SY7?and?ZY1;?environmentally?sensitive?plants?with?high?effective?components?SY15，?SY18?and?XY1;?stress-resistant?plants?SY2，?SY6，?SY19，?YY2，?YY9?and?XJY1;?high?active?ingredient?plants?SY10?and?SY17;?“pogostone-type”?patchouli?plants?SY3?and?JY1.?Among?them，?SY7?and?ZY1?are?new?germplasms?with?double?excellent?characteristics，?and?the?two?“pogostone-type”?patchouli?plants?have?application?value?for?solving?the?problems?of?the?lack?of?authentic?medicinal?materials?and?the?degradation?of?germplasm.?In?this?study，?patchouli?variant?plants?bred?by?the?60Co-γ?ray?irradiation?mutagenesis?method?have?the?advantages?of?strong?stress?resistance?and?high?active?ingredients，?which?would?provide?mature?methods?and?potential?germplasm?for?patchouli?mutagenesis?breeding?and?new?variety?breeding.

Keywords：?Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.;?60Co-γ?ray;?physiological?and?biochemical?indicators;?GC-MS;?patchouli?alcohol;?pogostone

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2024.02.007

廣藿香[Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部分入藥，具有開(kāi)胃止嘔、芳香化濕、發(fā)表解暑等功效[1]，是藿香正氣水、抗病毒口服液等中成藥的主要原料之一，在醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[2]。廣藿香在防治新型冠狀病毒感染中起到了重要的作用，為外用預(yù)防方最常用藥，內(nèi)服預(yù)防方常用藥[3]，并且為《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》中推薦使用中藥治療復(fù)方的高頻使用藥[4]。廣藿香具有較好的抗病毒抗菌能力，在治療COVID-19及抗菌方面有很好的發(fā)展前景[5-7]。廣藿香原產(chǎn)東南亞國(guó)家，最早自梁代前傳入中國(guó)[8]，在我國(guó)有悠久的栽培歷史。廣藿香罕見(jiàn)開(kāi)花，即使偶有開(kāi)花，也無(wú)結(jié)實(shí)，所以各地栽種的廣藿香主要以扦插的方式繁殖[9]，因此難以采用傳統(tǒng)雜交育種方式獲得優(yōu)良品種。廣州石牌一帶盛產(chǎn)廣藿香，由于其質(zhì)量?jī)?yōu)、療效好，被稱(chēng)為“牌香”道地藥材[10]，羅集鵬等[11]根據(jù)廣藿香揮發(fā)油成分中的百秋里醇與廣藿香酮含量的不同，將不同產(chǎn)地的廣藿香分為2個(gè)化學(xué)型，石牌及肇慶高要產(chǎn)的為“廣藿香酮型”，廣東吳川、遂溪、雷州和海南萬(wàn)寧產(chǎn)的為“廣藿香醇型”。

目前廣藿香道地藥材缺失，種源混亂，無(wú)抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、有效成分含量高等突出優(yōu)點(diǎn)、性狀穩(wěn)定的品種，優(yōu)良品質(zhì)的中藥材種子種苗是保障中藥材品質(zhì)的必要條件，是中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此選育廣藿香優(yōu)良品種迫在眉睫。輻照誘變技術(shù)具有方法簡(jiǎn)便、育種周期短、效果好等特點(diǎn)[12]，本研究以廣藿香為試材，采用60Co-γ射線為輻射源對(duì)不同生長(zhǎng)階段的廣藿香進(jìn)行誘變，確定60Co-γ射線的誘變條件，通過(guò)植株外觀形態(tài)、農(nóng)藝性狀初步篩選出變異植株，以生化指標(biāo)及主要揮發(fā)性成分含量對(duì)廣藿香變異植株進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)，以期獲得性狀優(yōu)良的突變植株并為廣藿香誘變育種提供參考，后續(xù)可對(duì)廣藿香變異植株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)一步研究。

1??材料與方法

1.1??材料

1.1.1??植物材料??采用廣藿香無(wú)菌愈傷組織、叢生芽和生根苗為材料，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院嚴(yán)寒靜教授鑒定為廣藿香[Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.]，為醇型廣藿香。

1.1.2??主要試劑與儀器??主要試劑：脯氨酸（20200906）、蒽酮（20201114）均購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；茚三酮（S19209）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)法試劑盒（A045-2-1）、丙二醛（MDA）試劑盒（A003-1-2）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（A064-1-1）、過(guò)氧化物酶（POD）試劑盒（A084-3-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；十八烷（A13111044）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷（分析純）、正己烷（色譜純）均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；百秋里醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，B-037-180122）、廣藿香酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.5%，G-055-180710）對(duì)照品均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

儀器：1530酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；3K15冷凍離心機(jī)（SIGMA公司）；7890B-7000D型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent?Technologies?Inc公司），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2??方法

1.2.1??60Co-γ射線輻照處理及變異植株的篩選??以廣藿香愈傷組織、叢生芽及生根苗為60Co-γ射線輻照材料，各組實(shí)驗(yàn)個(gè)體約100個(gè)培養(yǎng)瓶，以未輻照處理的材料為對(duì)照（CK）。設(shè)計(jì)6組梯度輻照劑量組，輻照劑量分別為10、20、40、60、80、100?Gy，劑量率為0.82?Gy/min，60Co-γ射線輻照處理后的愈傷組織團(tuán)塊轉(zhuǎn)移至叢生芽培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，輻照處理后的叢芽及CK接種至生根培養(yǎng)基中培育3個(gè)月，經(jīng)水培煉苗，營(yíng)養(yǎng)土育苗。根據(jù)分枝、葉序、葉型及葉色等形態(tài)差異，遵循分枝數(shù)≥2、三葉輪生葉序、葉型及葉色較大差異者的原則，篩選變異植株，于4月將變異植株定植于花盆內(nèi)，相同管理措施，11月采收。

1.2.2??農(nóng)藝性狀觀測(cè)??在廣藿香生長(zhǎng)茂盛期，觀測(cè)廣藿香株高、地徑、分枝數(shù)、葉型指數(shù)（葉長(zhǎng)/葉寬）、葉色、葉型、葉序等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。

1.2.3??生理生化指標(biāo)測(cè)定??（1）采樣。取廣藿香主枝第2～3對(duì)新鮮成熟葉片若干，液氮速凍，置于–80?℃冰箱保存。

（2）指標(biāo)測(cè)定。參考張志良等[13]的方法測(cè)定可溶性糖（soluble?sugar，?SS）含量和脯氨酸（proline，?Pro）含量?？扇苄缘鞍祝╯oluble?protein，?SP）含量、MDA含量、CAT活性和POD活性參照考馬斯亮蘭法試劑盒（A045-2-1）、MDA試劑盒（A003-?1-2）、CAT試劑盒（A064-1-1）、POD試劑盒（A084-3-1）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4??變異植株主要揮發(fā)性成分測(cè)定??（1）溶液的配制。內(nèi)標(biāo)溶液：1?mg/mL正十八烷內(nèi)標(biāo)溶液；對(duì)照品溶液：2?mg/mL百秋李醇及1?mg/mL廣藿香酮對(duì)照品溶液。供試品的制備：稱(chēng)取0.3?g廣藿

香變異植株地上部分干燥粗粉，置于具塞錐形瓶中，加入二氯甲烷30?mL，超聲處理3次，每次20?min，過(guò)濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，稠膏加正己烷溶解后，全量轉(zhuǎn)移至5?mL容量瓶中，定容，測(cè)定時(shí)按比例稀釋?zhuān)尤雰?nèi)標(biāo)溶液，用0.45?μm微孔濾膜過(guò)濾。

（2）氣相色譜-質(zhì)譜分析條件。參考?xì)W曉華等[14]的方法進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。氣相條件：色譜柱為DB-5?MS毛細(xì)管柱（30?m×0.25?mm，?0.25?μm）；初始溫度為120?℃，保持2?min；以2?℃/min速率升溫至160?℃，保持2?min；以10?℃/min速率升溫至180?℃，保持2?min；以30?℃/min速率升溫至280?℃，保持0?min；進(jìn)樣量為1?μL，分流比為30∶1，載氣為高純氦氣，柱箱溫度為120?℃，進(jìn)樣口溫度為250?℃，接口溫度為250?℃。質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度為200?℃，電離能量為70?eV，掃描質(zhì)量范圍m/z為50～500，溶劑延遲2?min。標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)NIST14.lib。百秋李醇含量的線性范圍為0.01～0.50?mg/mL，回歸方程為y=80.5061x+?0.0197（R?=0.9999），樣品精密度r=0.53%，加樣回收率為97.02%，重復(fù)性r=4.56%；廣藿香酮含量的線性范圍為0.01～0.10?mg/mL，回歸方程為y=?11.892x–0.1135（R?=0.9993），樣品精密度r=0.99%，加樣回收率為102.9%，重復(fù)性r=4.97%，結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高（圖1）。

1.3??數(shù)據(jù)處理

采用Excel?2016軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并制圖，采用SPSS?24.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2??結(jié)果與分析

2.1??60Co-γ射線輻照處理及廣藿香變異植株的篩選

由表1可知，不同材料對(duì)輻照的敏感程度不同，實(shí)際輻照劑量為58～64?Gy時(shí)，愈傷組織最敏感，死亡率為8.65%，叢生芽次之，生根苗死亡率為0；實(shí)際輻照劑量為77～116?Gy時(shí)，叢生芽死亡率最高，愈傷組織次之，生根苗耐受性較強(qiáng)，死亡率最低。結(jié)果表明：廣藿香3種輻照材料的死亡率均隨輻照劑量的升高而升高，愈傷組織的半致死輻照劑量可能在98～105?Gy之間，叢生芽的半致死輻照劑量約為70?Gy（圖2），較高輻照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織損傷較大，會(huì)導(dǎo)致其大量停止生長(zhǎng)并死亡；低輻照劑量時(shí)，愈傷組織對(duì)輻照效應(yīng)更為敏感；高輻照劑量時(shí)，叢生芽對(duì)輻照效應(yīng)更為敏感；總體表現(xiàn)為生根苗對(duì)60Co-γ射線較為耐受。

根據(jù)變異植株篩選標(biāo)準(zhǔn)，在1299株廣藿香輻照處理再生苗中篩選獲得29株廣藿香變異植株，各組篩選得到的變異植株數(shù)及誘變率見(jiàn)表2。結(jié)果表明，廣藿香3種輻照材料的誘變率均隨輻照劑量的升高而升高，當(dāng)輻照劑量小于77?Gy時(shí)，叢生芽和愈傷組織的誘變率均為0，而生根苗在任一輻照劑量中均篩選出變異植株，在輻照劑量為100?Gy時(shí)誘變率最高，為10%。

2.2??廣藿香變異植株農(nóng)藝性狀指標(biāo)及分類(lèi)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和變異植株葉的生長(zhǎng)情況，制定變異植株的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)：葉序=3為三葉輪生植株，葉序=2為正常葉序；葉型指數(shù)≤1.00為異型葉，葉型指數(shù)≥1.40為狹葉，葉型指數(shù)在1.00～1.40之間為正常葉型，葉片卷曲方向向上為卷葉，向下為下卷葉，葉色紫色為紫色葉。

根據(jù)以上分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將29株變異廣藿香分為7個(gè)變異類(lèi)型（表3）。其中，三葉輪生的變異植株株高、地徑均顯著低于CK，而分支數(shù)極顯著高于CK；異型葉和深裂葉的變異植株株高、地徑均極顯著低于CK，異型葉植株的分枝數(shù)極顯著高于CK；深裂葉植株的分支數(shù)顯著高于CK，其他變異植株株高、地徑均低于CK，而分支數(shù)高于CK，說(shuō)明60Co-γ射線對(duì)廣藿香株高、地徑及分枝數(shù)有顯著影響，抑制廣藿香的生長(zhǎng)高度及莖粗，但會(huì)使廣藿香分枝數(shù)變多。

2.3??廣藿香變異植株生理生化特性

SS、SP和Pro為植物體內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過(guò)積累或分解滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，從而應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿等不利生境。在不利生境的刺激下，會(huì)引起植物體內(nèi)活性氧的積累，過(guò)多的活性氧會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，MDA含量是細(xì)胞膜受到傷害程度的重要指標(biāo)[15]。植物體內(nèi)具有抗氧化酶和還原性物質(zhì)等保護(hù)性物質(zhì)，這些物質(zhì)組成了復(fù)雜的活性氧清除系統(tǒng)，植物體內(nèi)的活性氧不斷產(chǎn)生，同時(shí)也不斷被清除，形成了動(dòng)態(tài)平衡[16]。POD和CAT為抗氧化酶，可以根據(jù)抗氧化酶活性來(lái)體現(xiàn)植株清除活性氧的能力。

29株廣藿香變異植株及CK植株中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、MDA和抗氧化酶活性見(jiàn)表4。有3株變異植株的SS含量與CK呈極顯著差異，其中SY6的SS含量最高，為80.9?mg/g；有6株變異植株的SS含量與CK呈顯著差異，其中YY8的SS含量最低，為38.0?mg/g。有9株變異植株的SP含量與CK呈極顯著差異，其中JY1的SP含量最高，為7.91?mg/g，SY13的SP含量最低，為0.69?mg/g；有5株變異植株的可溶性蛋白含量與CK呈顯著差異。SY7和SL3的Pro含量分別比CK高89.79%和101.58%，均呈極顯著差異；有4株廣藿香變異植株的Pro含量顯著低于CK，其余植株與CK無(wú)顯著差異。有10株變異植株的MDA含量與CK呈極顯著差異，其中SY11的MDA含量最高，為30.68?nmol/mg，SY19的MDA含量最低，為1.97?nmol/mg；有6株變異植株的MDA含量與CK呈顯著差異。SY13的CAT和POD活性最高，分別為163.59?μmol/mg和265.33?μmol/g，SY11、SY13、SY14、SY15、SY16、SY18和XY1的MDA含量、CAT活性和POD活性均顯著高于CK。

綜上，變異植株SY6、YY9和XJY1的SS含量顯著增加，SY7的SS和Pro含量顯著增加。SY2、SY19和YY2的SP含量顯著增加，而MDA含量顯著降低，說(shuō)明植株SY2、SY19和YY2體內(nèi)的活性氧積累較少。ZY1的SP含量顯著增加，植株體內(nèi)含較高有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可以很好地維持滲透勢(shì)，上述植株可能具有較強(qiáng)的抗逆性。SY13、SY16和SY18的Pro和SP含量顯著降低，同時(shí)其MDA含量、CAT和POD活性顯著增加，

SY13、SY16和SY18在當(dāng)前栽培環(huán)境下未合成較多的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，使活性氧含量積累，破壞其細(xì)胞膜完整性，產(chǎn)生大量MDA，從而使植株需要保持較高的抗氧化酶活性以消除活性氧，以維持植株活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，說(shuō)明其對(duì)栽培環(huán)境較為敏感。SY11、SY14、SY15和XY1除Pro含量無(wú)顯著差異外，其余指標(biāo)與SY13、SY16、SY18相同，為環(huán)境敏感型植株。

2.4??廣藿香變異植株主要揮發(fā)性成分測(cè)定

廣藿香揮發(fā)油中的主要化學(xué)成分和主要有效成分為百秋李醇與廣藿香酮[17]。由圖3可知，有8株變異植株的百秋李醇含量極顯著高于CK，其中SY12、SY15、XY1和ZY1的百秋李醇含量約為CK的2倍；有2株變異植株的百秋里醇含量顯著高于CK；有4株變異植株的百秋李醇含量極顯著低于CK；有2株變異植株的百秋李醇含量顯著低于CK。由圖4可知，有13株變異植株的廣藿香酮含量極顯著高于CK，其中SY3的廣藿香酮含量高達(dá)3.883%，約為CK的16倍，含量極高；有2株變異植株的廣藿香酮含量顯著高于CK。由圖5可知，SY1、SY12和YY3的百秋李醇含量與廣藿香酮含量的比值均極顯著大于CK，SY14的顯著高于CK；變異植株SY3、YY8、YY10、SL3和JY1的百秋李醇含量與廣藿香酮含量的比值均極顯著小于CK，SY6、SY16、YY2、YY7和XJY1的百秋李醇含量與廣藿香酮含量的比值均顯著小于CK。

CK的百秋李醇含量為0.557%，廣藿香酮含量為0.241%，百秋李醇含量與廣藿香酮含量的比值為2.58，百秋李醇含量相對(duì)較高，屬于“醇型”廣藿香。而變異植株中SY3和JY1的醇酮比分別為0.013和0.005，醇酮比值較低，廣藿香酮相對(duì)含量更高，可視為“酮型”廣藿香。60Co-γ射線輻照誘變對(duì)廣藿香主要有效成份含量影響顯著，變異植株SY7、SY10、SY15、SY17、SY18、XY1和ZY1的百秋李醇和廣藿香酮含量均顯著高于CK。綜上，本研究獲得7株高有效成分含量的廣藿香植株以及2株“酮型”廣藿香。

2.5??廣藿香變異植株的綜合評(píng)價(jià)

結(jié)合以上分析結(jié)果，根據(jù)廣藿香變異植株的生理生化指標(biāo)及揮發(fā)性成分含量的分析結(jié)果得出以下5種類(lèi)型植株：（1）抗逆且高有效成分植株SY7和ZY1；（2）環(huán)境敏感且高有效成分植株SY15、SY18和XY1；（3）抗逆植株SY2、SY6、SY19、YY2、YY9和XJY1；（4）高有效成分植株SY10和SY17；（5）“酮型”廣藿香植株SY3和JY1。

3??討論

3.1??60Co-γ射線對(duì)不同生長(zhǎng)階段廣藿香的輻照效應(yīng)

藥用植物輻射誘變育種需要選擇適宜的誘變材料和輻照劑量才能獲得有效的誘變。低劑量輻照處理?xiàng)l件下，可以獲得較多的輻照處理個(gè)體但突變頻率低，獲得的變異個(gè)體較少。高劑量輻照處理?xiàng)l件下，輻照處理個(gè)體的突變頻率高，但死亡率也高，不良突變性狀也會(huì)隨之增加。因此輻照誘變育種研究中多采用半數(shù)致死劑量作為輻照試驗(yàn)的最佳劑量[18]。已有研究表明，輻照誘變育種僅依據(jù)死亡率來(lái)衡量輻照對(duì)其的影響是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要綜合考察半致死輻照劑量、外植體能否出芽、再生苗能否成活以及移栽后的生長(zhǎng)情況來(lái)確定最佳輻照劑量[19]。誘變因子在作用于生長(zhǎng)旺盛的器官、分生組織和分化程度小的細(xì)胞時(shí)，其誘變敏感性更強(qiáng)[20]，針對(duì)以往研究中采用廣藿香離體葉片組織等為輻照材料[21-23]，輻照明顯抑制葉片再生，容易出現(xiàn)褐化、死亡，難以生長(zhǎng)出健康的再生芽的現(xiàn)象，本研究比較了3種不同生長(zhǎng)階段廣藿香離體組織材料（愈傷組織、叢生芽、生根苗）的輻照效果，以最終的誘變率與存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出廣藿香的最佳誘變育種方式是以輻照劑量為100?Gy?60Co-γ射線處理生根苗，其誘變率高達(dá)10%，此條件下可以獲得數(shù)量最多、存活率高的變異植株。

3.2??60Co-γ射線對(duì)廣藿香變異植株的影響

植物在不利的生境條件下，次生代謝產(chǎn)物由活性氧的誘導(dǎo)產(chǎn)生的，次生代謝產(chǎn)物含量的增加可提高植物細(xì)胞的適應(yīng)能力[24]。廣藿香酮和百秋李醇均為廣藿香植株體內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境敏感且高有效成分植株雖然抗逆性較弱，但在適宜的生長(zhǎng)環(huán)境下可以種植獲得高有效成分含量的廣藿香。抗逆且高有效成分植株，具有雙重優(yōu)良特性，不但抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)各種栽培環(huán)境，同時(shí)也有比母本更高的有效成分含量的特性，這類(lèi)型的品種為優(yōu)良品種。

SY3和JY1兩株“酮型”廣藿香，其母本為“醇型”廣藿香，經(jīng)誘變出現(xiàn)了化學(xué)型的變化，對(duì)于獲得高廣藿香酮含量品種具有重要的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。由此說(shuō)明可通過(guò)60Co-γ射線輻照誘變育種，獲得與道地藥材品質(zhì)相近的廣藿香新品種，后續(xù)可對(duì)變異植株SY3和JY1進(jìn)行離體快繁，研究其遺傳穩(wěn)定性并獲得大量子代植株。通過(guò)子代植株和“牌香”的揮發(fā)性成分、藥理和藥效等進(jìn)行對(duì)比，研究其實(shí)用性及可替代性。為解決道地藥材種質(zhì)退化、抗逆性弱、產(chǎn)量低等問(wèn)題提供新思路。姚宇等[22]采用ISSR方法對(duì)廣藿香誘變體植株進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)60Co-γ射線可使廣藿香發(fā)生較大頻率的變異。吳立蓉等[23]對(duì)廣藿香輻照誘變的再生植株進(jìn)行RAPD分析，發(fā)現(xiàn)其在表現(xiàn)型及分子水平出現(xiàn)一定的分離。本研究將進(jìn)一步使用SRAP分析方法對(duì)獲得的變異植株進(jìn)行遺傳多樣性分析，以研究60Co-γ射線對(duì)廣藿香變異植株分子水平的影響。

本研究中獲得17株三葉輪生植株，其葉片數(shù)量和一級(jí)分枝數(shù)均比正常植株多1/3，可將三葉輪生植株應(yīng)用于廣藿香的種植生產(chǎn)中，這意味著可以獲得更高的產(chǎn)量。植物的葉序是由葉片在莖尖分生組織（SAM）中形成時(shí)決定的，相關(guān)研究表明有規(guī)律的葉序類(lèi)型間的轉(zhuǎn)變是受多基因控制的[25]，同時(shí)也有學(xué)者認(rèn)為某些植物葉序的發(fā)生不僅是受1種機(jī)制調(diào)控，可能同時(shí)受2種或多種機(jī)制共同影響，葉序形成由基因控制，也受激素的影響。到目前為止，尚無(wú)一種完整模型可以明確地解釋葉序的發(fā)生機(jī)制[26]。后續(xù)可以通過(guò)對(duì)單葉對(duì)生和三葉輪生廣藿香植株的SAM全基因組重測(cè)序或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析其差異基因，進(jìn)而研究植物葉序的發(fā)生機(jī)制，以期開(kāi)發(fā)成為廣藿香定向育種的分子標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)

• 國(guó)家藥典委員會(huì)編.?中華人民共和國(guó)藥典：?2020年版一部[S].?北京：?中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，?2020：?46.?National?Pharmacopoeia?Commission.?Pharmacopoeia?of?the?Peoples?Republic?of?China：?2020?edition?Part?1[S].?Beijing：?China?Medical?Science?and?Technology?Press，?2020：?46.?（in?Chinese）
• 常怡雪，?甘君妍，?王瑋哲，?寇新宇，?馮志攀，?李普旺，?楊子明，?陳煜.?廣藿香功效及應(yīng)用進(jìn)展[J].?熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2019，?39（12）：?68-74.CHANG?Y?X，?GAN?J?Y，?WANG?W?Z，?KOU?X?Y，?FENG?Z?P，?LI?P?W，?YANG?Z?M，?CHEN?Y.?The?efficacy?and?application?progress?of?Pogostemon?cablin[J].?Chinese?Journal?of?Tropical?Agriculture，?2019，?39（12）：?68-74.?（in?Chinese）

[3]?凌曉穎，?姜茗宸，?徐秋月，?武祎文，?袁斌.?基于數(shù)據(jù)挖掘的中醫(yī)藥防治新型冠狀病毒肺炎的用藥規(guī)律研究[J].?中藥材，?2020，?43（7）：?1761-1766.LING?X?Y，?JIANG?M?C，?XU?Q?Y，?WU?Y?W，?YUAN?B.?Study?on?medication?regularity?of?traditional?Chinese?medicine?in?prevention?and?treatment?of?novel?coronavirus?pneumonia?based?on?data?mining[J].?Journal?of?Chinese?Medicinal?Materials，?2020，?43（7）：?1761-1766.?（in?Chinese）

[4]?邵仲柏，?朱月霞，?劉書(shū)豪，?蔣凱俊，?吳琦，?沈金陽(yáng)，?劉瑋煒.?臨床使用治療新型冠狀病毒肺炎中藥復(fù)方中高頻數(shù)中藥抗病毒研究概述[J].?中草藥，?2020，?51（5）：?1153-1158.SHAO?Z?B，?ZHU?Y?X，?LIU?S?H，?JIANG?K?J，?WU?Q，?SHEN?J?Y，?LIU?W?W.?A?review?on?clinical?application?of?high?frequency?traditional?Chinese?medicine?in?treatment?of?coronavirus?pneumonia?2019[J].?Chinese?Traditional?and?Herbal?Drugs，?2020，?51（5）：?1153-1158.?（in?Chinese）

[5]?WU?X?L，?JU?D?H，?CHEN?J，?YU?B，?LIU?K?L，?HE?J?X，?DAI?C?Q，?WU?S，?CHANG?Z，?WANG?Y?P，?CHEN?X?Y.?Immunologic?mechanism?of?patchouli?alcohol?anti-H1N1?influenza?virus?may?through?regulation?of?the?RLH?signal?pathway?in?vitro[J].?Current?Microbiology，?2013，?67（4）：?431-436.

[6]?YU?Y?Y，?HE?J?J，?SU?J?Q，?KONG?S?Z，?SU?J?Y，?LI?Y?C，?HUANG?S?H，?LI?C?W，?LAI?X?P，?SU?Z?R.?Synthesis?and?antimicrobial?evaluation?of?pogostone?and?its?analogues[J].?Fitoterapia，?2013，?38：?135-139.

[7]?LIU?F，?CAO?W，?DENG?C，?WU?Z?Q，?ZENG?G?Y，?ZHOU?Y?J.?Polyphenolic?glycosides?isolated?from?Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.?as?novel?influenza?neuraminidase?inhibitors[J].?Chemistry?Central?Journal，?2016，?10（1）：?51.

[8]?吳友根，?郭巧生，?鄭煥強(qiáng).?廣藿香本草及引種歷史考證的研究[J].?中國(guó)中藥雜志，?2007，?32（20）：?2114-2117，?2181.WU?Y?G，?GUO?Q?S，?ZHENG?H?Q.?Textual?research?on?history?of?introduction?and?herbal?medicine?of?Pogostemon?cablin[J].?China?Journal?of?Chinese?Materia?Medica，?2007，?32（20）：?2114-2117，?2181.?（in?Chinese）

[9]?歐陽(yáng)蒲月，?李亞萍，?莫小路.?廣藿香資源調(diào)查、研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J].?大眾科技，?2019，?21（8）：?55-57.OUYANG?P?Y，?LI?Y?P，?MO?X?L.?Resource?investigation，?research?progress?and?development?trend?of?Pogostemon?cablin[J].?Popular?Science?&?Technology，?2019，?21（8）：?55-57.?（in?Chinese）

[10]?羅集鵬，?馮毅凡，?何冰，?郭曉玲，?陳小夏，?曹暉，?劉玉萍.?廣藿香的道地性研究[J].?中藥材，?2005，?28（12）：?1121-1125.LUO?J?P，?FENG?Y?F，?HE?B，?GUO?X?L，?CHEN?X?X，?CAO?H，?LIU?Y?P.?An?authentic?study?of?Pogostemon?cablin[J].?Journal?of?Chinese?Medicinal?Materials，?2005，?28（12）：?1121-1125.?（in?Chinese）

[11]?羅集鵬，?劉玉萍，?馮毅凡，?郭曉玲，?曹暉.?廣藿香的兩個(gè)化學(xué)型及產(chǎn)地與采收期對(duì)其揮發(fā)油成分的影響[J].?藥學(xué)學(xué)報(bào)，?2003，?38（4）：?307-310.?LUO?J?P，?LIU?Y?P，?FENG?Y?F，?GUO?X?L，?CAO?H.?Two?chemotypes?of?Pogostemon?cablin?and?influence?of?region?of?cultivation?and?harvesting?time?on?volatile?oil?composition[J].?Acta?Pharmaceutica?Sinica，?2003，?38（4）：?307-310.?（in?Chinese）

[12]?屠禮剛，?丁建平，?馬忠社，?趙玫，?王禮平，?李四游，?高卿.?荷花輻照育種技術(shù)初步研究[J].?現(xiàn)代園藝，?2016（7）：?21-22.TU?L?G，?DING?J?P，?MA?Z?S，?ZHAO?M，?WANG?L?P，?LI?S?Y，?GAO?Q.?Preliminary?study?of?lotus?irradiation?breeding?technology[J].?Contemporary?Horticulture，?2016（7）：?21-22.?（in?Chinese）

[13]?張志良，?翟偉菁.?植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].?3版.?北京：?高等教育出版社，?2006：?127-130.ZHANG?Z?L，?QU?W?J.?Experimental?guidance?of?plant?physiology[M].?3rd?ed.?Beijing：?Higher?Education?Press，?2006：?127-130.?（in?Chinese）

[14]?歐曉華，?羅可可，?鄧文靜，?張眾生，?劉小華，?嚴(yán)寒靜.?廣藿香化學(xué)型分型及形成時(shí)期研究[J].?中成藥，?2022，?44（4）：?1209-1213.OU?X?H，?LUO?K?K，?DENG?W?J，?ZHANG?Z?S，?LIU?X?H，?YAN?H?J.?Chemotype?classification?and?formation?period?of?Pogostemon?cablin[J].?Chinese?Traditional?Patent?Medicine，?2022，?44（4）：?1209-1213.?（in?Chinese）

[15]?CHEN?Y?E，?MAO?J?J，?SUN?L?Q，?HUANG?B，?DING?C?B，?GU?Y，?LIAO?J?Q，?HU?C，?ZHANG?Z?W，?YUAN?S，?YUAN?M.?Exogenous?melatonin?enhances?salt?stress?tolerance?in?maize?seedlings?by?improving?antioxidant?and?photosynthetic?capacity[J].?Physiologia?Plantarum，?2018，?164（3）：?349-363.

[16]?巖學(xué)斌，?袁金海.?鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響[J].?安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2019，?47（4）：?30-33.YAN?X?B，?YUAN?J?H.?Effects?of?salt?stress?on?plant?growth[J].?Journal?of?Anhui?Agricultural?Sciences，?2019，?47（4）：?30-33.?（in?Chinese）

[17]?張志軍，?張桂芝，?王朋朋.?廣藿香揮發(fā)油的紅外光譜鑒定和氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].?中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，?2015，?5（1）：?86-88，?91.ZHANG?Z?J，?ZHANG?G?Z，?WANG?P?P.?Analysis?of?essential?oils?of?Pogostemonis?Herba?by?FTIR?and?GC-MS[J].?China?Medicine?and?Pharmacy，?2015，?5（1）：?86-88，?91.?（in?Chinese）

[18]?劉進(jìn)平，?鄭成木.?誘變結(jié)合植物組織培養(yǎng)在植物育種中的應(yīng)用（綜述）[J].?上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，?2004，?20（1）：?19-22.LIU?J?P，?ZHENG?C?M.?Induced?mutation?in?connection?with?in?vitro?culture?for?crop?breening[J].?Acta?Agriculturae?Shangha，?2004，?20（1）：?19-22.?（in?Chinese）

[19]?吳立蓉，?賀紅，?張燕玲，?劉星，?林小樺.?60Co-γ射線輻照對(duì)廣藿香離體培養(yǎng)的影響[J].?核農(nóng)學(xué)報(bào)，?2008，?22（1）：?14-17.WU?L?R，?HE?H，?ZHANG?Y?L，?LIN?X，?LIN?X?H.?The?effect?of?60Co-γ?irradiation?on?culture?in?vitro?of?Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.[J].?Journal?of?Nuclear?Agricultural?Sciences，?2008，?22（1）：?14-17.?（in?Chinese）

[20]?趙會(huì)芳.?辣椒誘變及其誘變機(jī)理的研究[D].?楊凌：?西北農(nóng)林科技大學(xué)，?2005.ZHAO?T?F.?Study?on?mutagenic?effects?mechanism?of?the?treatments?with?different?mutagenic?on?the?pepper?（Capsicum?annuum?L.）[D].?Yangling：?Northwest?A＆F?University，?2005.?（in?Chinese）

[21]?賀紅，?許仕仰，?吳立蓉，?張燕玲.?廣藿香輻射誘變篩選抗病突變體的研究[J].?廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，?2012，?29（2）：?185-189.HE?H，?XU?S?Y，?WU?L?R，?ZHANG?Y?L.?Selection?of?bacterial-wilt-resistance?mutants?of?Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.?by?radiation?mutation[J].?Journal?of?Guangzhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?2012，?29（2）：?185-189.?（in?Chinese）

[22]?姚宇，?李娟玲，?李碧英，?羅志平，?李麗輝，?李文革.?廣藿香60Co-γ誘變體植株遺傳多樣性的ISSR分析[J].?熱帶生物學(xué)報(bào)，?2017，?8（3）：?277-283.YAO?Y，?LI?J?L，?LI?B?Y，?LUO?Z?P，?LI?L?H，?LI?W?G.?ISSR?analysis?of?plant?genetic?diversity?of?60Co-γ?induced?mutants?of?Pogostemon?cablin[J].?Journal?of?Tropical?Biology，?2017，?8（3）：?277-283.?（in?Chinese）

[23]?吳立蓉，?賀紅，?張燕玲，?劉丹，?謝建輝，?柴婷婷.?60Co-γ射線對(duì)廣藿香的輻照誘變及再生植株的RAPD分析[J].?激光生物學(xué)報(bào)，?2010，?19（2）：?174-178.WU?L?R，?HE?H，?ZHANG?Y?L，?LIU?D，?XIE?J?H，?CHAI?T?T.?60Co-γ?ray?radiation?mutation?of?Pogostemon?cablin?（Blanco）?Benth.?and?the?RAPD?analysis?of?the?regenerated?plant[J].?Acta?Laser?Biology?Sinica，?2010，?19（2）：?174-178.?（in?Chinese）

[24]?孟祥才，?李曉穎，?姚杰，?孔玲，?關(guān)瑜.?生態(tài)脅迫促進(jìn)道地藥材質(zhì)量形成機(jī)制與質(zhì)量評(píng)價(jià)思路[J].?中草藥，?2022，?53（5）：?1587-1594.MENG?X?C，?LI?X?Y，?YAO?J，?KONG?L，?GUAN?Y.?Mechanism?of?ecological?stress?enhancing?quality?of?genuine?medicinal?materials?and?its?quality?evaluation?idea[J].?Chinese?Traditional?and?Herbal?Drugs，?2022，?53（5）：?1587-1594.?（in?Chinese）

[25]?劉天寶.?不同葉序植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素差異分析[D].?合肥：?安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，?2010.LIU?T?B.?Variance?analysis?of?endogenous?cytokinin?and?auxin?in?different?phyllotaxis?plants[D].?Hefei：?Anhui?Agricultural?University，?2010.?（in?Chinese）

[26]?談應(yīng)權(quán)，?孔晶晶，?江海洋.?植物葉序發(fā)生的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].?安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，?2020，?47（6）：?1001-1006.TAN?Y?Q，?KONG?J?J，?JIANG?H?Y.?Advances?in?molecular?mechanism?of?phyllotaxis?development?in?plants[J].?Journal?of?Anhui?Agricultural?University，?2020，?47（6）：?1001-1006.?（in?Chinese）