吳少明，劉文菁，戴 明，何孟杭，陳言凱，王 征，詹重清，歐陽立群

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，國家加工食品質(zhì)量檢驗檢測中心，福建 福州 350002）

藥品和個人護(hù)理用品（pharmaceutical and personal care products，PPCPs）是一類具有偽持久性的“新興環(huán)境污染物”[1]，包括各種抗生素、性激素、興奮劑、退燒藥、降壓藥、減肥藥、避孕藥、麻醉劑等，涉及生活及生產(chǎn)的各個方面[2]，近年來在國內(nèi)外備受關(guān)注。PPCPs主要通過生活中的廢水進(jìn)入環(huán)境中，會對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成潛在危害[3-6]。為此，澳大利亞、歐盟、美國國家水研究所相繼出臺了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對包括雙氯芬酸在內(nèi)的PPCPs進(jìn)行了水質(zhì)指標(biāo)的濃度限定[7]；美國食品藥品監(jiān)督管理局于2016年明確禁止在抗菌清潔類產(chǎn)品中添加三氯生[8]，我國新頒布的GB/T 5750—2023《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》也新增了39 項PPCPs的檢測指標(biāo)。

隨著儀器分析技術(shù)的不斷發(fā)展，全球范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPCPs存在于各地區(qū)水體中，包括美國[9]、意大利[10]、非洲[11]、伊朗[12]和中國[13]等地，水平從ng/L到μg/L不等。Kolpin等[14]在美國139 條河流中發(fā)現(xiàn)了85 種PPCPs藥物；McArdell等[15]對3 座污水處理廠和Glatt河流中的大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了不同濃度的克拉霉素；Miao Xiusheng等[16]調(diào)查了加拿大5 座城市8 個污水處理廠出水中的31 種抗生素殘留情況，發(fā)現(xiàn)除磺胺甲惡唑，還檢測到磺胺吡啶等新藥物殘留。Nakada等[17]對日本利根川的藥物殘留情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在70 種檢測的藥物中有57 種被檢出，包括克拉霉素、咖啡因、苯扎貝特和卡馬西平等。Murata等[18]則研究了12 種抗生素在37 條河流中的污染狀況，發(fā)現(xiàn)這些河流中的抗生素總質(zhì)量濃度范圍為未檢出至626 ng/L，中位數(shù)為7.3 ng/L；Yoon等[19]對韓國漢江中31 種內(nèi)分泌干擾物和PPCPs的分布情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)碘普羅胺、萘普生、避蚊胺、卡馬西平、咖啡因等化合物在河流和小溪樣品中經(jīng)常被檢測到；Sun Qian等[20]研究福建九龍河PPCPs化合物的空間分布及趨勢，發(fā)現(xiàn)冬季的河水樣品中解熱鎮(zhèn)痛藥和消炎藥的檢出率均高達(dá)100%，其中撲熱息痛、布洛芬、酮洛芬、雙氯芬酸的檢出濃度較高；甚至在我國一些地區(qū)的居民飲用水中甚至也檢測到PPCPs的存在，蕪湖、珠三角和蘇州等地的居民飲用水中均檢出多類抗生素[21-23]，說明PPCPs在水中的存在已是不爭的事實。因此，建立一種準(zhǔn)確性好的高通量檢測方法，對了解我國水體中PPCPs的污染水平、分布特征和遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律具有重要意義。

目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是PPCPs測定最常用的方法[2,13,21-23]，但現(xiàn)階段的檢測技術(shù)主要是針對同類或少數(shù)種類PPCPs，對多類PPCPs的同時檢測技術(shù)報道較少，且通常需要多種前處理方法才能完成多項目的測定。因此，本研究旨在利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的高準(zhǔn)確性和高通量優(yōu)勢，建立僅需一次前處理和一次上機測試即可完成水源中20大類共176 種PPCPs的快速篩查和準(zhǔn)確定量分析方法，涉及的化合物主要包括文獻(xiàn)報道中常檢出以及日常生活中可能用到的PPCPs，并將其應(yīng)用于對福州水源水中PPCPs的篩查和定量分析，該技術(shù)可為水源水中的安全監(jiān)測、預(yù)警和執(zhí)法提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20大類共176 種PPCPs液體混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（每一類為1 瓶混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）天津阿爾塔公司；甲酸、乙腈、甲醇（均為色譜純）德國Merck 公司；冰乙酸、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氨水（均為分析純）上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Cleanert PEP固相萃取柱（6 mL/500 mg）美國Agela公司；UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）美國Waters公司；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Triple Quad 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；Multifuge×4R Pro高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；DS-8510 DTH超聲波振蕩器 上海分析儀器有限公司；MS 3 basic旋渦振蕩器 德國IKA公司；AutoEVA-20Plus全自動平行濃縮儀 天津?？苾x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水樣采集

選用福州市閩江水源水，從西頭閩侯至東頭馬尾區(qū)，每隔5 km設(shè)置一個采樣點，共計13 個采樣點，每個采集點采集2 個樣品，共26 個水樣。水樣的采集和保存按照GB/T 5750.1—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》。將采集的水樣密閉保存于棕色玻璃瓶中，采樣量為500 mL，采集后24 h內(nèi)進(jìn)行實驗。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確取水樣50 mL于離心管中，用5%甲酸或5%氨水溶液調(diào)節(jié)pH值為7，轉(zhuǎn)移至事先用6 mL甲醇和6 mL水活化的Cleanert PEP固相萃取柱中（加裝50 mL大體積管），待其自然重力作用流出后，用6 mL蒸餾水淋洗小柱，棄去全部淋洗流出液，減壓抽干后先以5 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)，后同）甲醇-乙腈溶液洗脫，再以5 mL含1%甲酸的50%甲醇-乙腈溶液洗脫，收集兩次洗脫液，并加入100 μL DMSO后于平行濃縮儀中40 ℃水浴濃縮至近干，以40%甲醇溶液定容至1.0 mL，渦旋混勻后過0.22 μm聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）濾膜，上機測試。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

準(zhǔn)確吸取20 大類標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）各1.00 mL至100 mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度均為1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，轉(zhuǎn)入棕色瓶中，于－18 ℃保存。分別準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，以40%甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 色譜條件

色譜柱：UPLC HSS T3色譜柱（2.1×150 mm，1.8 μm）；流動相：水相（A）為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水（含0.2 mmol/L乙酸銨）溶液，有機相（B）為甲醇；流速為0.3 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL，洗脫程序為：0～6 min，95%～5% A、5%～95% B；6～9 min，5% A、95% B；9～9.01 min，5%～95% A、95%～5% B；9.01～12 min，95% A、5% B。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（electro-spray ionization，ESI）：正離子、負(fù)離子切換掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測掃描，分段掃描方式（分段時間段為各化合物保留時間左右各30 s）；離子化電壓：正離子模式5500 V，負(fù)離子模式4500 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度550 ℃；定性離子對、定量離子對及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 176 種PPCPs化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for the detection of 176 PPCPs

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Multiquant 4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，采用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用50%甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至質(zhì)量濃度均為200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，采用外置針泵連續(xù)進(jìn)樣模式、ESI源進(jìn)行采集分析。根據(jù)化合物的性質(zhì)，分別采用對應(yīng)的離子掃描模式（正、負(fù)），先采用Q1（Q1Scan）掃描，分別獲得[M＋H]＋或[M－H]－的母離子，再進(jìn)行MS2子離子掃描，得到每個化合物的主要碎片離子，選取相對豐度最高及次高的碎片離子作為定量離子和定性離子，以滿足歐盟2002/657/EC的規(guī)定，即保證檢測需達(dá)到4 個確證點的要求。再分別進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測掃描，優(yōu)化各離子對的去簇電壓、碰撞能，最終得到161 種化合物采用ESI＋模式，其余15 種化合物則采用ESI－模式，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

對于PPCPs的測定，文獻(xiàn)中大多采用的是C18色譜柱。本實驗對比了常用的Acuity UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Acuity UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱分析效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同流動相條件下，間氨基苯甲酸、普魯卡因胺、沙丁胺醇、阿莫西林等強極性的化合物，在HSS T3色譜柱上得到更好的保留，三氯卡巴、炔諾肟酯、丙酸睪丸素等極性較弱的目標(biāo)物也不會過強地保留，整體表現(xiàn)出更尖銳的峰形，且可以耐受更高比例的水相，因此選擇Waters Acuity UPLC HSS T3作為分析柱。此外，對比了0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸（含0.02 mmol/L乙酸銨）-甲醇、0.1%甲酸（含0.02 mmol/L乙酸銨）-乙腈4 種流動相的效果。結(jié)果顯示，有機相為甲醇時，可以提高可的松、咖啡因、青霉素G等大多數(shù)化合物的響應(yīng)，但炔諾肟酯、地爾卓卡、替米考星等化合物色譜峰出現(xiàn)分叉；而含有乙酸銨時，色譜峰分叉的情況得到明顯改善，這是由于大多數(shù)化合物采用的是ESI＋模式，甲醇是質(zhì)子供體，能夠提高目標(biāo)物的質(zhì)子化，而乙酸銨是流動相改進(jìn)劑，可以有效改善峰形。因此，選擇0.1%甲酸（含0.02 mmol/L乙酸銨）-甲醇作為流動相，176 種化合物的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 176 種化合物的提取離子色譜圖（20 ng/mL）Fig.1 Extracted ion chromatograms of 176 PPCPs (20 ng/mL)

2.2 凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 水樣pH值的選擇

對于水中PPCPs的測定，研究中通常采用HLB[24-26]、PEP-2[27-28]固相萃取柱凈化富集，并認(rèn)為不同化合物的回收率和樣品pH值有關(guān)[27-28]。本實驗選取Cleanert PEP固相萃取柱作為凈化柱，對比了不同pH值（3、5、7、9、11）的水樣進(jìn)行上樣以及淋洗步驟，收集流出液進(jìn)行后續(xù)實驗，研究PPCPs化合物的損失情況，平行實驗n＝2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水樣pH值低于9時，所有化合物均未損失；而pH值為9時，12 種化合物有不同程度的損失，尤其是對氨基苯甲酸（損失率為93.6%）、間氨基苯甲酸（損失率為97.4%）、磺胺醋酰（損失率為72.1%）；而當(dāng)水樣pH值達(dá)到11時，17 種化合物均有不同程度的損失，其中10 種化合物損失率高于87.4%（圖2），說明水樣為堿性條件時，一些化合物在上樣或淋洗過程存在損失，綜合考慮選擇水樣pH值為7。

圖2 樣品pH值對上樣和淋洗過程中PPCPs損失率的影響Fig.2 Effect of sample pH on the loss rates of PPCPs during loading and washing

2.2.2 洗脫溶劑的選擇

Cleanert PEP固相萃取柱填料是由聚苯乙烯和二乙烯苯組成的，同時具有親水性和憎水性基團，對各類強極性、弱極性的化合物均具有較好的吸附，而常用的洗脫溶劑為甲醇和乙腈。但本研究涉及176 種PPCPs，種類繁多且性質(zhì)差異較大，考慮到洗脫溶劑酸堿性可能對結(jié)果產(chǎn)生影響，分別對比甲醇、乙腈、50%甲醇-乙腈、含1%甲酸的50%甲醇-乙腈及含1%氨水的50%甲醇-乙腈作為洗脫溶劑的效果。結(jié)果見圖3，采用甲醇洗脫時，54.0%（95/176）的化合物回收率高于60%；乙腈洗脫時，67.0%（118/176）的化合物回收率高于60%；50%甲醇-乙腈洗脫時，72.2%（127/176）的化合物回收率高于60%；1%甲酸化的50%甲醇-乙腈或1%氨水的50%甲醇-乙腈洗脫時，85.8%（151/176）的化合物回收率高于60%，說明酸性或堿性的50%甲醇-乙腈洗脫效果較好；此外，采用1%甲酸化的50%甲醇-乙腈效果較差的25 種化合物中，50%甲醇-乙腈洗脫效果均較好，回收率在68.8%～129.6%之間，繼續(xù)實驗，先采用5 mL 50%甲醇-乙腈洗脫，再加入5 mL 1%甲酸化的50%甲醇-乙腈繼續(xù)洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)176 種化合物的回收率均較為滿意，回收率在73.2%～123.2%之間。因此，選擇先以5 mL 50%甲醇-乙腈洗脫，再以5 mL 1%甲酸化的50%甲醇-乙腈洗脫的分步洗脫方式。

圖3 不同洗脫溶劑洗脫后回收率高于60%的化合物占比Fig.3 Compounds percentage with recoveries higher than 60% with different elution solvents

2.3 濃縮條件的選擇

2.3.1 濃縮溫度的選擇

由于凈化后的溶液體積較大，且洗脫液為高比例有機相，與流動相初始比例差距較大，會產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，需將凈化液濃縮后進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。但由于176 種PPCPs化合物種類繁多，性質(zhì)差異較大，可能存在熱不穩(wěn)定的化合物。因此，以50%甲醇-乙腈為溶劑配制質(zhì)量濃度均為50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用平行濃縮儀進(jìn)行濃縮，分別對比濃縮溫度為30、40、50、60 ℃條件下對目標(biāo)物回收率的影響。如圖4所示，當(dāng)濃縮溫度到達(dá)40 ℃時，頭孢拉定的回收率下降12.1%；當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時，9 種化合物的回收率明顯下降，降至32.5%～78.8%；而當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時，25 種化合物的回收率下降明顯，僅為1.7%～67.3%（圖4）；除圖中的化合物外，其余化合物并沒有明顯損失，回收率均在90%以上，但考慮到30 ℃時濃縮時間較長（約60 min），最終選擇濃縮溫度為40 ℃。

圖4 濃縮溫度對PPCPs回收率的影響Fig.4 Effect of condensation temperature on the recovery rates of PPCPs

2.3.2 DMSO用量的選擇

為了考察經(jīng)濃縮吹干后PPCPs的回收效果，以50%甲醇-乙腈配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于平行濃縮儀中40 ℃氮氣吹干，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、甲硫威、地爾硫卓、瑞格列奈6 種化合物無明顯損失，回收率在93.2%～102.1%之間，而其余回收率均較低，回收率均低于80%，其中103 種化合物回收率低于60%，這是由于吹干后，一方面10%乙腈無法完全溶解目標(biāo)物導(dǎo)致?lián)p失；另一方面，氮吹干后一部分目標(biāo)物隨溶劑共同揮發(fā)或者分解導(dǎo)致。而在進(jìn)行大批量樣品處理時很難避免每個樣品都不被吹干，吳少明等[29]認(rèn)為DMSO與水、甲醇、乙腈等都互溶，且對于PPCPs化合物均有較好的溶解性，且沸點較高（189 ℃），在濃縮前添加一定量DMSO可能會減少目標(biāo)物的損失，但過量的DMSO可能會對儀器造成損壞。因此，本實驗通過選擇10、20、50、100、200 μL DMSO進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著DMSO添加量的增多，所有化合物的回收率逐漸升高，在100 μL時基本無損失，每個化合物回收率均為86.6%～104.7%之間，符合分析要求，因此，選擇DMSO 用量為100 μL，并對比該用量下添加DMSO與未添加組對經(jīng)濃縮吹干后的176 種PPCPs的回收率影響，結(jié)果見圖5。

圖5 添加100 μL DMSO對PPCPs回收率的影響Fig.5 Effect of the addition of 100 μL of DMSO on the recovery rates of PPCPs

2.4 濾膜的選擇

常用的濾膜主要有尼龍濾膜和PTFE濾膜，相較PTFE濾膜，尼龍膜吸附能力更強，得到的濾液更干凈，但也可能吸附目標(biāo)物。本實驗以40%甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度為20 ng/mL，分別使用0.22 μm尼龍濾膜和0.22 μm PTFE濾膜過濾，對比兩種濾膜處理后對回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用PTFE膜對176 種化合物均沒有明顯的吸附，回收率均在97.0%以上；而尼龍膜對29 種化合物存在不同程度的吸附，13 種化合物回收率降至3.0%～67.6%之間，而其余16 種化合物則沒有回收（圖6），說明尼龍膜吸附較嚴(yán)重，故選擇0.22 μm PTFE濾膜過濾。

圖6 尼龍濾膜對PPCPs的吸附Fig.6 Adsorption efficiencies of PPCPs on nylon filter membrane

2.5 方法學(xué)評價

2.5.1 線性范圍和定量限

將1.3.3節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線上機測定，以各目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各自質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，176 種目標(biāo)物在5.00～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)r＞0.99。選取陰性水樣進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，由于樣品為水，信噪比較大，若以3 倍信噪比和10 倍信噪比確定檢出限和定量限，所得結(jié)果大部分較小。因此，本實驗以各目標(biāo)物在線性范圍內(nèi)滿足實際回收率在60%～130%之間的最低加標(biāo)水平為定量限，最終確定176 種PPCPs化合物的定量限均為0.1 ng/mL。

2.5.2 準(zhǔn)確度、精密度

以陰性水樣進(jìn)行0.1、0.4、1.0 ng/mL 3 種水平的加標(biāo)回收實驗，每個加標(biāo)水平平行實驗6 次，計算各自的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果顯示，176 種化合物的平均回收率在68.0%～126.7%之間，RSD在1.1%～10.3%之間。此外，在同樣條件下，將同一加標(biāo)水平（0.5 ng/mL）的樣液每隔2 h進(jìn)樣一次，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以6 次的回收率RSD計算日內(nèi)精密度；并連續(xù)6 d進(jìn)行同水平（0.5 ng/mL）加標(biāo)實驗，以6 d 所得回收率的RSD計算日間精密度。結(jié)果表明，176 種PPCPs化合物的日內(nèi)精密度為2.2%～5.7%，日間精密度為3.2%～9.8%。說明該方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測 附錄F》的要求。

2.6 實際樣品測定

采用新開發(fā)的方法測定13 個閩江水源水樣，共檢出11 種PPCPs化合物，其中咖啡因質(zhì)量濃度為13.5～58.9 ng/mL、1,7-二甲基黃嘌呤質(zhì)量濃度為1.5～7.5 ng/mL、撲熱息痛質(zhì)量濃度為0.6～6.3 ng/mL、纈沙坦質(zhì)量濃度為1.3～4.3 ng/mL、頭孢拉定質(zhì)量濃度為0.5～2.5 ng/mL、磺胺質(zhì)量濃度為ND～1.0 ng/mL、甘寶素質(zhì)量濃度為ND～1.0 ng/mL、替米沙坦質(zhì)量濃度為ND～0.9 ng/mL、西咪替丁質(zhì)量濃度為ND～0.8 ng/mL、雷尼替丁質(zhì)量濃度為ND～1.2 ng/mL、三氯卡巴質(zhì)量濃度為ND～0.2 ng/mL，其余化合物均未檢出。

3 結(jié)論

本研究對儀器條件以及前處理條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，建立了一種Cleanert PEP固相萃取小柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水中176 種PPCPs化合物含量的高通量分析方法。方法學(xué)驗證表明該方法具有良好的線性范圍、較低的檢出限、較高的準(zhǔn)確度和精密度。該方法只需一次前處理以及一次上機測試即可完成176 種PPCPs化合物的分析，涉及的化合物更多，種類更齊全，可為水環(huán)境中PPCPs化合物含量的監(jiān)管提供技術(shù)支持。