何榮健 雷佳玉 楊 慧 岑 香 楊 昆 顧昌華*

（1銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食用菌工程中心，貴州銅仁 554300；2安順學(xué)院，貴州安順 651000）

灰樹花（Grifola frondosa）又名蓮花菌、舞茸等，是灰樹花科（Grifolaceae）、灰樹花屬（Grifola）的珍稀食藥用菌[1]，常生長在板栗樹、櫟樹等殼斗科植物樹樁周圍[2]?；覙浠I養(yǎng)豐富，口感脆嫩，具有獨(dú)特清香，富含多糖、糖蛋白、氨基酸、維生素等營養(yǎng)與生物活性物質(zhì)[3-4]，具有較好的免疫調(diào)節(jié)、腫瘤抑制、抗病毒等保健功能[5-8]?；覙浠ㄒ蚓哂歇?dú)特口感與保健功效，其市場發(fā)展前景廣闊。近年來，我國圍繞灰樹花藥用價(jià)值、菌種選育、培養(yǎng)基配方和栽培管理等方面開展大量研究[9-10]，但研究所用灰樹花菌株多數(shù)引自日本，對(duì)本土野生灰樹花資源開發(fā)利用較少。

梵凈山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)地處亞熱帶，屬山地季風(fēng)氣候，獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，造就了豐富的野生食藥用菌資源[11-12]。為此，筆者以梵凈山野生灰樹花為材料，通過組織分離獲得灰樹花菌株，并研究其農(nóng)藝性狀及遺傳關(guān)系，初步篩選評(píng)價(jià)野生灰樹花種質(zhì)資源，以期篩選適合銅仁市氣候的優(yōu)良灰樹花菌株，為開發(fā)利用梵凈山野生灰樹花提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株見表1，7株菌株均采自貴州省梵凈山，為野生菌株。供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

表1 供試灰樹花菌株

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 野生灰樹花菌株分離純化

將野生灰樹花子實(shí)體擦拭干凈，在無菌環(huán)境下用無菌解剖刀將子實(shí)體切開，取菌柄菌蓋交界處未污染的組織塊，迅速放至平板培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫暗培養(yǎng)。待平板上形成菌落，挑取菌落邊緣菌絲，轉(zhuǎn)接至空白平板培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，并將純化后的菌株置于4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 野生灰樹花鑒定

測量和觀察梵凈山野生灰樹花的子實(shí)體大小、形狀、顏色等特征。利用DNA提取試劑盒（TSINGKE）提取野生灰樹花菌株DNA，通過引物ITS1/ITS4擴(kuò)增野生灰樹花ITS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測后測序，并利用NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MAGE 7進(jìn)行遺傳距離計(jì)算和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 野生灰樹花菌株拮抗試驗(yàn)

選用PDA平板培養(yǎng)基，將供試菌株兩兩組合，分別接種至平板兩側(cè)，置25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，觀察不同菌株菌絲接觸區(qū)有無拮抗反應(yīng)。每個(gè)組合3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 菌株培養(yǎng)特性

用打孔器取直徑9 mm菌塊接種到PDA培養(yǎng)基平板中央，置25 ℃恒溫暗培養(yǎng)。觀察菌絲生長情況，并采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算試驗(yàn)菌株菌絲平均生長速度，觀察比較供試菌株菌絲長勢。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株鑒定

2.1.1 供試野生灰樹花菌株子實(shí)體形態(tài)初步比較

梵凈山野生灰樹花種質(zhì)資源豐富，供試菌株灰樹花子實(shí)體形態(tài)、顏色、大小，菌片長寬等形態(tài)特征存在顯著性差異（表2，圖1）?；覙浠℉SH-3菌株的子實(shí)體呈鹿角狀，菌蓋分化不完全，為畸形菇；HSH-7菌株的子實(shí)體呈灰白色，大?。?3.2 cm×35.6 cm）和菌褶寬度均最大；HSH-4菌株和HSH-5菌株朵形最好，為蓮花狀，菌片形態(tài)最佳。綜合分析表明，HSH-7、HSH-4、HSH-5菌株可作為良好育種材料。

圖1 野生灰樹花子實(shí)體形態(tài)

表2 野生灰樹花子實(shí)體形態(tài)特征

2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于rDNA-ITS序列，對(duì)供試野生灰樹花序列進(jìn)行BLAST比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：所有供試菌株與灰樹花（Grifola frondosa）同源性均在99%以上，7株野生灰樹花菌株遺傳距離較小，其中，HSH-1菌株與HSH-7菌株的親緣關(guān)系較近，HSH-2菌株、HSH-3菌株、HSH-4菌株、HSH-5菌株、HSH-6菌株的親緣關(guān)系較近（圖2）。

圖2 供試野生灰樹花菌株遺傳距離

2.2 供試野生灰樹花菌株拮抗試驗(yàn)結(jié)果

由表3、圖3可知，7株供試野生灰樹花菌株間兩兩組合均發(fā)生拮抗反應(yīng)，但拮抗反應(yīng)程度有所不同。HSH-6菌株、HSH-7菌株與其他菌株均存在非常明顯的拮抗反應(yīng)，表明HSH-6、HSH-7菌株與其他菌株存在較大遺傳差異。

圖3 部分供試灰樹花菌株拮抗反應(yīng)狀態(tài)

表3 供試野生灰樹花菌株拮抗反應(yīng)情況

2.3 供試野生灰樹花菌株菌絲培養(yǎng)特性

由表4可知，7株野生灰樹花菌株菌絲生長速度差異顯著，其中，HSH-1菌株菌絲生長速度最快，達(dá)4.61 mm/d；其次是HSH-7菌株，生長速度為4.44 mm/d，顯著高于其他野生灰樹花菌株；HSH-5、HSH-4菌株生長速度次之，分別為4.28 mm/d和4.11 mm/d；HSH-6菌株生長速度最慢。所有供試灰樹花菌株菌落顏色由潔白至乳白色（圖4）。綜合分析表明，HSH-1菌株菌絲生長特性最佳。

圖4 供試野生灰樹花菌株平板培養(yǎng)菌落形態(tài)

表4 供試野生灰樹花菌株菌絲生長特性

3 小結(jié)

梵凈山野生灰樹花種質(zhì)資源豐富，7株供試灰樹花菌株均采自梵凈山，菌株間遺傳距離較小，供試灰樹花子實(shí)體形態(tài)特征差異顯著，除HSH-3菌株子實(shí)體呈鹿角狀，明顯畸形外，其他供試菌株均可作為優(yōu)良育種材料。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，7株供試灰樹花菌株分為兩個(gè)類群（支系），HSH-1菌株、HSH-7菌株的親緣關(guān)系較近，HSH-2至HSH-6菌株的親緣關(guān)系較近；供試灰樹花菌株間均存在一定拮抗反應(yīng)，HSH-6菌株、HSH-7菌株與其他菌株均存在非常明顯的拮抗反應(yīng)；供試灰樹花菌株菌絲培養(yǎng)特性差異顯著，除HSH-6菌株、HSH-3菌株外，其他菌株菌絲生長普遍較快?；覙浠℉SH-1菌株菌絲生長速度最快，HSH-7菌株菌絲生長速度次之。綜合比較分析，HSH-1、HSH-2、HSH-4、HSH-5、HSH-7菌株的生物學(xué)特性較好，可作為優(yōu)良種質(zhì)資源進(jìn)行開發(fā)利用。