陳應(yīng)奇,劉英蓮,梁 薇,姜子祥,韋 祎,李宏英,馬天鵬,姜 燕

(1.海南醫(yī)學(xué)院,海南 ?？?71199;2.寧波市鎮(zhèn)海區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,浙江 寧波 315000)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是由腦血管疾病(Cerebrovascular disease,CVD)所致,核心表現(xiàn)為大腦認(rèn)知功能損傷的慢性進(jìn)行性疾病[1]。相關(guān)臨床調(diào)查證實(shí),VD的患病率已占全球中老年癡呆癥患者的20%～30%,并被列為“癡呆”的第二大類(lèi)型,以意識(shí)功能受損為主,并伴有注意力、記憶力及執(zhí)行力減退等癥狀。近年來(lái),人口老齡化趨勢(shì)已是全世界面臨的共同問(wèn)題,相應(yīng)地心腦血管疾病和VD發(fā)病例數(shù)也隨之上升[2]?，F(xiàn)代科研結(jié)果表明,在學(xué)習(xí)記憶的信息產(chǎn)生與貯存方面,海馬神經(jīng)元所含神經(jīng)細(xì)胞Ca2+、鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMPKⅡ)、鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)發(fā)揮著重要作用[3]。丹參-川芎這一藥對(duì)作為活血化瘀方中最常用組合,臨床上有許多關(guān)于活血化瘀的藥方或中成藥,但關(guān)于丹參-川芎藥對(duì)治療海馬神經(jīng)細(xì)胞的作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)干預(yù)大鼠的學(xué)習(xí)能力,并檢測(cè)干預(yù)前后大鼠海馬 CaM、CaMPK Ⅱ的 mRNA 水平,探討丹參-川芎提取物對(duì)血管性癡呆認(rèn)知功能的部分調(diào)控機(jī)制,為中醫(yī)藥診治 VD 提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取100只SPF級(jí)SD雄性大鼠,平均體重(250±20)g ,飼養(yǎng)在白晝循環(huán)模式采光,室溫為22 ℃左右。每日按時(shí)喂食、自由飲水,預(yù)養(yǎng)2周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物:尼莫地平片(國(guó)藥準(zhǔn)字H13021882)、硝普鈉(國(guó)藥準(zhǔn)字H20058958)、慶大霉素(國(guó)藥準(zhǔn)字H42022058)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:Morris 水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供);電子分析天平(型號(hào)XPR226DRQ/AC);離心機(jī)(型號(hào)KH22,湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);勻漿機(jī)(型號(hào)PRO200,FLUKO 公司);酶標(biāo)儀(型號(hào)LD-96A,萊恩德智能科技);激光掃描共焦顯微鏡(型號(hào)STELLARIS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組方法:雄性、健康的100只SD大鼠經(jīng)由隨機(jī)方式歸入造模組(n=80)、正常組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)。造模組先通過(guò)Morris水迷宮找出造模有效的50只血管性癡呆大鼠,再經(jīng)由隨機(jī)手段歸入模型組(n=10)、尼莫地平組(n=10)、丹參-川芎高劑量組(n=10)、丹參-川芎中劑量組(n=10)、丹參-川芎低劑量組(n=10)。

1.2.2 造模:先對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行2周預(yù)養(yǎng),自第15天起造模。造模方法為反復(fù)夾閉頸動(dòng)脈,再注射硝普鈉降壓及單側(cè)永久性結(jié)扎頸動(dòng)脈,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前禁食、水[4]。呈仰臥位固定,按400 mg/kg用量予腹腔注射10%水合氯醛行麻醉處理,通過(guò)碘伏對(duì)頸部行常規(guī)消毒處理,頸正中切開(kāi),對(duì)組織行鈍性分離,暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈(Common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal carotid,ICA)、頸外動(dòng)脈(External carotid artery,ECA)。于夾閉兩側(cè)CCA前,先腹腔注入2.0 mg/kg硝普鈉,借助無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾對(duì)兩側(cè)CCA行10 min夾閉操作,再將動(dòng)脈夾去掉,通血10 min[5]。間歇阻斷雙側(cè)頸動(dòng)脈血3次后,用鑷子隨后將一側(cè)頸總動(dòng)脈挑起,血管下穿兩根縫合線,結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈,切口處滴注青霉素后縫合皮膚,碘伏消毒縫合處,保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組只需對(duì)兩側(cè)頸動(dòng)脈行分離操作,為了防范感染,術(shù)畢肌注慶大霉素。

1.2.3 模型篩選:通過(guò)Morris水迷宮完成對(duì)癡呆鼠的篩選。水池為120 cm直徑,水深30 cm左右,平臺(tái)為10 cm直徑(相較水面偏低2 cm左右)。將池壁等分為四個(gè)象限,各象限池壁中點(diǎn)就是各象限的入水點(diǎn),平臺(tái)固定于某一象限內(nèi)距離池壁約30 cm的位置。單獨(dú)測(cè)試每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6]。在測(cè)試環(huán)節(jié)對(duì)每只動(dòng)物分別自4個(gè)象限入水點(diǎn)1次。觀察記錄大鼠從入水尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(這個(gè)時(shí)間被稱(chēng)為逃避潛伏期;并讓其在平臺(tái)上休息1 min后再進(jìn)行下次測(cè)試,如果超過(guò)90 s未能找到平臺(tái),將其引導(dǎo)到平臺(tái),該逃避潛伏期記錄為90 s。分別記錄每只大鼠4次入水到找到平臺(tái)所需時(shí)間,取4次的平均值為該鼠每天的逃避潛伏期。建模后經(jīng)過(guò)2周(手術(shù)傷口已徹底愈合)開(kāi)始訓(xùn)練大鼠,1次/d,合計(jì)5 d。把第5天正常組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物逃避潛伏期的均值當(dāng)作參考值,對(duì)各造模動(dòng)物第5天的逃避潛伏期均值與參考值的差值與參考值做比值,若此值在20%以上,表示建模有效[6]。

1.2.4 干預(yù)方法:待有效完成模型篩選工作,對(duì)各組動(dòng)物開(kāi)始實(shí)施相應(yīng)操作,1次/d,6次/周,共處理4 周,藥物人常用劑量為丹參、川芎各10 g,按照體表面積轉(zhuǎn)換動(dòng)物藥物用量,于每日早晨 8:00 灌胃。丹參-川芎高劑量組40 mg/kg、丹參-川芎中劑量組20 mg/kg、丹參-川芎低劑量組10 mg/kg、尼莫地平組20 mg/kg干預(yù);正常組、假手術(shù)組、模型組皆給予相應(yīng)藥物溶劑等量的0.9%氯化鈉溶液干預(yù);各組給藥頻率為1次/d、6次/周,共干預(yù)4周。

1.2.5 行為學(xué)檢測(cè):在造模前1周、造模后1周及進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)措施結(jié)束后1周,各組大鼠均采取水迷宮測(cè)試,定位航行試驗(yàn)記錄大鼠逃避潛伏期,空間探索試驗(yàn)記錄在撤出平臺(tái)后大鼠穿越原平臺(tái)象限的次數(shù)。各組間數(shù)據(jù)分為定位航行試驗(yàn)、空間探索試驗(yàn)兩大項(xiàng),以此對(duì)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能變化進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè):腹主動(dòng)脈引出盡可能多的血液后,斷頭處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,同時(shí)快速將其腦組織取出,通過(guò)冰冷0.9%氯化鈉溶液將殘留血液除掉,隨后分離出海馬組織,稱(chēng)重后裝入凍存管中迅速置于液氮,保存?zhèn)溆么龣z測(cè)。激光掃描,共焦顯微鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+] i。各組分別選擇 5 只動(dòng)物兩側(cè)海馬組織,通過(guò)冷胰蛋白酶(Trypsin)消化法完成對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的分離,借助微量加樣器將1 μl熒光探針 Fluo-3滴加于在蓋玻片上貼壁的海馬神經(jīng)細(xì)胞懸浮液。觀察工具為激光掃描共焦顯微鏡,反射光、激發(fā)光各設(shè)定為530、488 nm,對(duì)各視野神經(jīng)細(xì)胞實(shí)施激光掃描查看細(xì)胞中[Ca2+]i,并對(duì)細(xì)胞中熒光像素的相對(duì)值記錄。

1.2.7 RT-qPCR 半定量檢測(cè) mRNA 表達(dá):快速分離各組大鼠海馬,液氮中保存。用總 RNA 抽提試劑(Trizol 試劑)提取總RNA 后,反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈,并將其當(dāng)作模板,各自對(duì) CaM、CaMPKⅡ受損PCR 擴(kuò)增處理,內(nèi)參為β-actin 。引物信息見(jiàn)表1。

表1 各基因引物信息

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠干預(yù)前定位航行試驗(yàn)比較 見(jiàn)表2。干預(yù)前,各組大鼠前3 d的訓(xùn)練情況比較均無(wú)差異,組間因素與正常訓(xùn)練天數(shù)之間沒(méi)有交互作用。第 4天起,正常組與造模組開(kāi)始不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)前第4、5天,各給藥組間大鼠定位航行試驗(yàn)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠干預(yù)前不同時(shí)間定位航行試驗(yàn)比較(s)

2.2 各組大鼠干預(yù)后定位航行試驗(yàn)比較 見(jiàn)表3。各組大鼠在接受干預(yù)后第1天,正常組與其他各組定位航行試驗(yàn)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)第 2天,正常組與其他各組定位航行試驗(yàn)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)第5天,丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組定位航行試驗(yàn)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)定位航行試驗(yàn)比較(s)

2.3 各組大鼠干預(yù)前后空間探索試驗(yàn)比較 見(jiàn)表4。干預(yù)后,正常組、假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、丹參-川芎高劑量組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組的空間探索試驗(yàn)結(jié)果均高于干預(yù)前。干預(yù)后,尼莫地平組、丹參-川芎高劑量組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組空間探索試驗(yàn)結(jié)果均低于正常組和假手術(shù)組。丹參-川芎高劑量的空間探索試驗(yàn)結(jié)果與尼莫地平組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而丹參-川芎高劑量組高于丹參-川芎低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表4 各組大鼠干預(yù)前后空間探索試驗(yàn)比較(次)

2.4 各組大鼠干預(yù)后 [Ca2+]i熒光像素相對(duì)值比較 見(jiàn)表5。模型組的[Ca2+]i熒光像素相對(duì)值高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后,接收藥物干預(yù)的各組[Ca2+]i熒光像素相對(duì)值低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后,丹參-川芎高劑量組[Ca2+]i熒光像素相對(duì)值與尼莫地平組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。丹參-川芎高劑量組[Ca2+]i熒光像素相對(duì)值低于丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠干預(yù)后[Ca2+]i熒光像素相對(duì)值比較

2.5 各組大鼠干預(yù)后海馬神經(jīng)細(xì)胞CaM、CaMPKⅡ的mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表6。干預(yù)后,模型組CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后,丹參-川芎高劑量組CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量高于尼莫地平組、丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠干預(yù)后海馬神經(jīng)細(xì)胞CaM、CaMPKⅡ的 mRNA 表達(dá)比較

3 討 論

VD為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的命名,在中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中與之匹配的病型歸屬于“呆病”范疇,其主要表現(xiàn)為健忘,病機(jī)與“瘀”相關(guān),歷代醫(yī)學(xué)典籍中散在提及此類(lèi)疾病[7]。“年五十以上,陽(yáng)氣日衰……心力漸退,忘前失后”[8]。《雜病源流犀燭》中提到的“中風(fēng)后,善忘”等[9]。首次對(duì)“呆病”提出專(zhuān)論是明代《景岳全書(shū)·雜證謨》,而清代陳士鐸《辨證錄》單獨(dú)提出“呆病門(mén)”,對(duì)呆病癥狀詳細(xì)描述,并闡明成因、病機(jī)、病理轉(zhuǎn)化過(guò)程,其主要與腦相關(guān);而腦又被稱(chēng)為髓海,血能滋養(yǎng)腦髓,是將精微上供于腦髓的主要載體[10]。血液的正常運(yùn)行與臟腑功能、氣機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)、脈道通利等機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素關(guān)系密切。凡是能促使血液運(yùn)行不暢或離開(kāi)經(jīng)脈的各種因素,導(dǎo)致瘀血的形成?，F(xiàn)代研究證實(shí),血瘀證和腦灌注異常、血液流變學(xué)異常、血流動(dòng)力學(xué)、微循環(huán)受限等存在緊密聯(lián)系,VD患者有不同程度的血液流變學(xué)異常表現(xiàn),如聚、濃、凝、黏等[11]。ASL-MRI、CTA、TCD等腦血管相關(guān)檢查發(fā)現(xiàn),相當(dāng)數(shù)量的VD患者存在血管動(dòng)脈粥樣硬化、血管狹窄、血管閉塞、血管瘤、先天血管異常、血液灌注不足等[12]。心臟附壁血栓、原發(fā)性血管炎、免疫性血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊引起腦栓塞等腦血管病亦與中醫(yī)血瘀證相關(guān)[13]。

中藥在治療癡呆方面有一定優(yōu)勢(shì),中藥治療呆病歷史悠久,古代醫(yī)家留下很多治療癡呆的寶貴經(jīng)驗(yàn)[14]。我國(guó)地勢(shì)復(fù)雜,中草藥類(lèi)型多樣。研究發(fā)現(xiàn),活血化瘀藥物如丹參、川芎、葛根、雞血藤等具有改善血液流變學(xué),增加腦血流作用[15]。《日華子本草》記載川芎具有“破癥結(jié)宿血,養(yǎng)新血……,及排膿消瘀血”的作用,《本草綱目》記載丹參有“活血,通心包絡(luò)”功效,在治療瘀血內(nèi)阻型老年癡呆中丹參的運(yùn)用尤為重要[16-17]。川芎與丹參同用,可助川芎活血行氣祛瘀之力,川芎、丹參相配既可入血分又可入氣分,氣隨血行,從而活血化瘀,讓滯留于腦府脈絡(luò)的瘀血消散,是治療癡呆常用的活血化瘀藥對(duì)?，F(xiàn)代藥理學(xué)對(duì)川芎、丹參單味藥有研究,川芎水提物中與抗血小板聚集活性的關(guān)系最為密切,可改善腦循環(huán);丹參中的丹參酮具有抗凝血作用,有利于增加腦局部血液供應(yīng),防止血栓和動(dòng)脈粥樣硬化形成,這可能與其抗炎、抗氧化、下調(diào)血脂等調(diào)節(jié)機(jī)制激活相關(guān)[18-19]。“丹參-川芎”藥對(duì)的作用靶點(diǎn)分布在多種細(xì)胞組分中,主要以胞質(zhì)為主,通過(guò)多種結(jié)合方式參與生物進(jìn)程,有抗小動(dòng)脈硬化、抗血小板聚集、預(yù)防血栓的形成作用,且能改善腦血管微循環(huán)[20]。

現(xiàn)代研究結(jié)果表明,對(duì)于學(xué)習(xí)與記憶的形成與維持,海馬神經(jīng)元細(xì)胞功能與形態(tài)發(fā)揮著核心作用。正常情況下,鈣離子在細(xì)胞內(nèi)可作為第二信使C與aM結(jié)合生成復(fù)合物,但 CaMPKⅡ是處于靜止?fàn)顟B(tài)[21]。當(dāng)細(xì)胞受外界刺激時(shí),CaMPKⅡ會(huì)被激活,然后與復(fù)合物結(jié)合形成新復(fù)合物,使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平又恢復(fù)到基礎(chǔ)狀態(tài)。同時(shí) CaMPK Ⅱ快速出現(xiàn)自身磷酸化,對(duì)Ca2+失去依賴(lài)性,此自身磷酸化能夠使CaMPK Ⅱ留存先前活化Ca2+信號(hào),這與記憶產(chǎn)生與存儲(chǔ)相關(guān)[22-23]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干預(yù)前在熟悉環(huán)境并獲取空間信息后各組大鼠表現(xiàn)記憶方面的能力存在差異,造模各組大鼠在尋找平臺(tái)的效率上開(kāi)始落后于正常組,VD大鼠的空間參考記憶力明顯受損。干預(yù)后,各治療組大鼠在尋找及穿越平臺(tái)的效率明顯優(yōu)于模型組,丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組無(wú)差異,接近正常組。模型組[Ca2+]i含量明顯增高,而CaM、CaMPKⅡ的mRNA表達(dá)量減少;各治療組Ca2+的含量明顯減少,CaM、CaMPKⅡ mRNA表達(dá)量明顯增多,丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組Ca2+的含量相當(dāng),均低于丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組;丹參-川芎高劑量組與尼莫地平組CaM、CaMPKⅡ的mRNA含量增多,且均高于丹參-川芎中劑量組、丹參-川芎低劑量組。實(shí)驗(yàn)表明,腦部缺血、缺氧后導(dǎo)致鈣離子通道異常,海馬組織的神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i會(huì)增多,使得Ca2+在細(xì)胞內(nèi)大量聚積,Ca2+過(guò)量可減弱腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase,AC)功能,并將磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)活化,從而使cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response-element protein,CREB)的生成量下降,細(xì)胞中cAMP濃度減少[24]。cAMP水平降低,減少蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)激活,使cAMP磷酸化受到嚴(yán)重抑制,對(duì)CRE轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)下游基因活動(dòng)不利[17]。然而,CRE 的啟動(dòng)障礙降低了CaM,CaMPKⅡ的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平[25]。丹參-川芎藥對(duì)能有效抑制其表達(dá),證明丹參-川芎藥對(duì)通過(guò)降低海馬細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i熒光強(qiáng)度作用機(jī)制,控制CaM、CaMPK Ⅱ的mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,丹參-川芎藥對(duì)成功阻止了VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i過(guò)量增加和CaM、CaMPKⅡ的mRNA 表達(dá)下降,且對(duì)于 VD 大鼠臨床癥狀也能有效改善,為臨床深入研究丹參-川芎治療 AD 作用機(jī)制提供參考。