崔方超，王蕓婷，王當(dāng)豐，檀茜倩，李秋瑩，勵建榮*，李婷婷

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心中國輕工業(yè)海水魚加工重點實驗室 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600）

實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）因特異性強、靈敏度高、定量準確、高通量、操作簡便等優(yōu)點，而被廣泛應(yīng)用于基因表達的研究中[1]。qPCR 檢測基因表達水平的定量方法分為絕對定量和相對定量。相較于相對定量法，使用絕對定量法需要構(gòu)建不同梯度稀釋的標準品并繪制標準曲線來計算目的基因模板的起始量，操作更為繁瑣且增加了試驗難度[2]。因此，在使用qPCR 檢測基因表達水平時大多采用相對定量法，通常需要引入一個在不同樣本內(nèi)表達穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因，從而校準目的基因的表達量[3]。常用的內(nèi)參基因有GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、ACT（肌動蛋白）、TUB（微管蛋白）、His（組蛋白）、16S rRNA（16S 核糖體RNA）等。大量研究表明，上述內(nèi)參基因有可能因物種、生長階段或發(fā)育條件的不同而表達不穩(wěn)定，因此，需要根據(jù)試驗條件選擇能夠穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因來保證qPCR 結(jié)果準確可靠[4-6]。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）屬于革蘭氏陰性需氧桿菌，具有脂解和蛋白水解活性，是奶類[7]、水產(chǎn)品[8]、肉制品[9]等食品在冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌。熒光假單胞菌能產(chǎn)生生物被膜、胞外蛋白酶、嗜鐵素等多種致腐因子，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，分泌酮類、醛類、醇類等多種揮發(fā)性有機化合物，散發(fā)令人不快的氣味[8，10-11]。作為常見的致病性嗜冷菌，熒光假單胞菌對環(huán)境適應(yīng)力強，其產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶極其耐熱，這不僅縮短了食品的貨架期，還有可能危害到人體健康。研究表明，熒光假單胞菌的腐敗特性如生物被膜的形成、胞外蛋白酶的分泌等受群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）系統(tǒng)的調(diào)控[12]。QS 系統(tǒng)是一種細菌通訊機制，微生物通過信號分子監(jiān)測群體密度并激活相關(guān)基因表達來調(diào)節(jié)其生理行為以適應(yīng)環(huán)境變化[13]。近年來以熒光假單胞菌等腐敗菌的QS 系統(tǒng)為靶標來調(diào)控其腐敗特性已成為研究熱點[14-16]。通過致腐因子的表征和腐敗基因的表達來探索食品腐敗機制，其中對腐敗基因表達水平的檢測大多采用qPCR 技術(shù)，大部分都以16S rRNA 作為內(nèi)參基因。目前內(nèi)參基因的篩選分析多圍繞動物與植物，對微生物內(nèi)參基因的研究較少，尚未有有關(guān)熒光假單胞菌在QS 方面內(nèi)參基因篩選方面的研究報道。

本文以熒光假單胞菌PF-08 為試驗菌株，根據(jù)文獻查找和前期基因組測序結(jié)果，選擇8 個候選內(nèi)參基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA），通過qPCR 研究不同QS 信號分子培養(yǎng)下候選內(nèi)參基因的表達水平。利用geNorm[17]、Normfinder[18]、BestKeeper[19]和RefFinder[20]分析這8個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，從而篩選出合適的內(nèi)參基因，為利用qPCR 技術(shù)研究熒光假單胞菌QS 相關(guān)的致腐基因表達提供科學(xué)依據(jù)；也為其它腐敗菌在QS 方面的基因定量研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

熒光假單胞菌PF-08（從腐敗大菱鲆中分離純化）保藏于渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL，美國Sigma 公司；LB 肉湯，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；固相表面RNase 清除劑、EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒、RNase-Free DNA 清除試劑盒、Taq PCR 預(yù)混液（2X，含紅染料）、DNA Marker、4S Green 核酸染色劑、瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒、TBPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Imark 酶標儀、GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；Legend Micro21R 臺式微量離心機、NanoDrop One 超微量紫外-可見分光光度計、Applied Biosyetems StepOne Plus 熒光定量PCR 儀，美國Thermo 公司；Eppendorf 5331梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及外源AHLs 處理 將過夜活化后的熒光假單胞菌PF-08 按照體積比1∶100 的比例接種于10 mL 含有2 μg/mL 不同類型（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL）外源信號分子的LB 肉湯中，以未添加外源AHLs 的LB 肉湯作為對照，28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)至OD595nm為1左右。

1.3.2 總RNA 提取與cDNA 合成取1.3.1 節(jié)的7 個菌液樣本，使用EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒及RNase-Free DNA 清除試劑盒提取總RNA；為了防止RNA 降解，需在低溫環(huán)境下快速操作，還需要用固相表面RNase 清除劑來清潔工作環(huán)境。提取的總RNA 經(jīng)過超微量分光光度計和1.0%瓊脂糖凝膠電泳聯(lián)合檢測，分析其純度和濃度是否達標。以檢測合格的總RNA 為模板，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒合成cDNA。

1.3.3 候選內(nèi)參基因選擇和引物設(shè)計及特異性檢測根據(jù)文獻選取8 個常見的管家基因作為候選內(nèi)參基因（表1）：dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA。它們要么在碳水化合物代謝中起關(guān)鍵作用，要么曾被用作系統(tǒng)發(fā)育標記。

根據(jù)前期基因組測序結(jié)果（GenBank 登錄號：CP032618）[27]獲得候選內(nèi)參基因的序列，基于qPCR 反應(yīng)對引物特異性的要求設(shè)計這8 個內(nèi)參基因的上下游引物（表2），由上海生工生物合成。

以1.3.2 節(jié)獲得的cDNA 為模板，引物見表2，對這8 個候選內(nèi)參基因進行PCR 擴增，檢測其特異性，反應(yīng)體系和程序參照Taq PCR 預(yù)混液（2X，含紅染料）的使用說明。通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增后的產(chǎn)物，觀察各基因在這7 個樣本的條帶大小是否與預(yù)期一致，以及是否有雜帶產(chǎn)生。

1.4 數(shù)據(jù)分析

StepOneTMSoftware v2.3 軟件自動得出各樣本的Ct 值，利用geNorm、Normfinder、BestKeeper 3 個程序和 RefFinder 網(wǎng)站（http：//blooge.cn/RefFinder/）對數(shù)據(jù)進行分析，評估8 個候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。geNorm 是Vandesompele 等[17]基于Microsoft Excel 編寫的一個Visual Basic 應(yīng)用程序（VBA），可以識別給定組織中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并確定計算可靠歸一化因子所需的最少基因數(shù)即內(nèi)參基因最佳數(shù)量。NormFinder 程序植根于基因表達的數(shù)學(xué)模型，該模型不僅能估計候選基因的總體變化，而且能估計樣本組之間的變化[18]。與上述兩個程序不同，除了比較內(nèi)參基因間的穩(wěn)定性，BestKeeper 程序還可以同時比較目的基因的表達水平，一次最多能分析100 個樣本中10 個內(nèi)參基因和10 個目的基因的表達水平[19]。RefFinder 網(wǎng)站集成了以上3 個軟件的算法和比較delta-Ct 方法[28]來對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行排序[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 質(zhì)量檢測

7 個樣本總RNA 的濃度和純度（A260nm/A280nm與A260nm/A230nm）通過超微量分光光度計檢測，結(jié)果見表3。根據(jù)cDNA 的反應(yīng)體系，RNA 的質(zhì)量濃度不能低于77.0 ng/μL。表3 中所有樣本總RNA的質(zhì)量濃度都較高，最低值為462.3 ng/μL，最高值為1 240.2 ng/μL。RNA 純度指示值中的A260nm、A280nm、A230nm分別代表了核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物的吸收峰。所有樣本總RNA 的A260nm/A280nm比值均在2.1～2.2 之間，沒有低于2.0，表示RNA 沒有受蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染；雖然略高于純RNA 的比值2.0，但沒有超過2.2，表示RNA 雖存在降解但程度不深。所有總RNA 的A260nm/A230nm均大于2.0，說明樣本沒受碳水化合物、胍鹽等污染，RNA的純度良好。從圖1 可以看到，1～7 泳道均有兩條明亮清晰的條帶分別代表28S rRNA 和18S rRNA，且沒有明顯的彌散現(xiàn)象，說明提取的總RNA 完整性較好，濃度較高且降解程度較低?？傊崛〉目俁NA 均質(zhì)量良好，可用于合成cDNA。

圖1 外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

表3 外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌的總RNA 質(zhì)量檢測Table 3 Quality detection of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

2.2 引物特異性檢測

以cDNA 為模板，通過PCR 反應(yīng)和2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測這8 個內(nèi)參基因的qPCR 引物是否具有特異性。從圖2 中可以看到這8 個候選內(nèi)參基因的PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，且條帶清晰單一，并無引物二聚體產(chǎn)生。這8 個內(nèi)參基因的引物均具有良好的特異性，滿足qPCR 試驗對引物的要求。

圖2 候選內(nèi)參基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of candidate reference genes

2.3 qPCR 結(jié)果分析

由圖3 可知，8 個候選內(nèi)參基因的溶解曲線均呈現(xiàn)特異的單一信號峰，沒有產(chǎn)生非特異性雜峰，不存在引物二聚體，進一步驗證這8 個候選內(nèi)參基因的引物均特異性良好。qPCR 試驗結(jié)果準確可靠，Ct 值可以用于后續(xù)分析。

圖3 候選內(nèi)參基因qPCR 溶解曲線Fig. 3 The qPCR melting curves of candidate reference genes

Ct 值是指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號在qPCR 擴增過程中達到閾值（軟件自動設(shè)定在從基線到指數(shù)增長的拐點）時的擴增循環(huán)數(shù)。qPCR 國際化標準（MIQE 指南）[29]指出，Ct 值與該基因的起始模板濃度負相關(guān)，Ct 值越小則該基因在樣本中的表達豐度越高。內(nèi)參基因的Ct 值應(yīng)在10～25 之間，表達豐度過高或過低都不利于定量目的基因的表達水平。因此，由圖4 可知，16S rRNA 的Ct 值偏低，其它基因的Ct 值均在16.02～21.58 之間。比較同一內(nèi)參基因在7 個樣本間的Ct 值變化程度，由小到大依次為：gltA、rpoD、atpD、rpsL、carA、16S rRNA、dsbA、gyrB。結(jié)果表明，gltA 的Ct 值變化程度最小，表達穩(wěn)定性最高，其次是rpoD。根據(jù)Ct 值直接判斷出最適內(nèi)參基因還不夠準確，仍需要通過geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 進一步分析并綜合評估。

圖4 候選內(nèi)參基因qPCR 的Ct 值分布圖Fig. 4 The qPCR Ct value distribution of candidate reference genes

2.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

評估內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的幾個程序各有不同的使用要點和分析側(cè)重點，最常用的程序是geNorm、NormFinder 和BestKeeper[30]。

內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性在geNorm 程序中表示為M 值，M 值是某一內(nèi)參基因與其它內(nèi)參基因表達水平的兩兩比值經(jīng)對數(shù)變換后的平均標準差。以1.5 為閾值，M 值超過1.5 就表示該基因表達不穩(wěn)定，不適合作內(nèi)參基因。從圖5a 中可知較穩(wěn)定的內(nèi)參基因為atpD 和rpoD，且8 個基因的M 值均低于1.5，可被列為候選內(nèi)參基因。geNorm還可以確定內(nèi)參基因的最適數(shù)目，通過對標準化因子進行差異分析計算配對變異V 值，選擇出2個及以上的內(nèi)參基因。以0.15 為閾值，當(dāng)Vn/n+1低于0.15，就表示用n 個基因同時作為內(nèi)參基因，取均值后定量目的基因，可以得到更可靠的試驗結(jié)果。圖5b 中的Vn/n+1值均低于0.15，則最少可選用2 個內(nèi)參基因。結(jié)合圖5a，atpD 和rpoD 作為內(nèi)參基因聯(lián)合使用，可以減少試驗誤差，更準確地分析基因表達量。

圖5 geNorm 分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性（a）和最適內(nèi)參基因數(shù)目（b）Fig. 5 geNorm analyzes the expression stability of candidate reference genes（a）and the optimal number of reference genes（b）

NormFinder 直接比較內(nèi)參基因在樣本組內(nèi)和組間的表達差異，結(jié)果用穩(wěn)定性值（SV）表示，根據(jù)SV 值大小對內(nèi)參基因進行排序，SV 值最小的基因即為最適內(nèi)參基因。從圖6 可知，基因表達最穩(wěn)定的為gltA，其次是rpsL，最不穩(wěn)定的為16S rRNA。

圖6 NormFinder 分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Fig. 6 NormFinder analyzes the expression stability of candidate reference genes

與以上兩個程序不同，BestKeeper 直接分析各內(nèi)參基因的Ct 值，通過Ct 值計算表達水平的標準差（SD）來評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，SD 值越小則基因表達越穩(wěn)定。因此，表4 中基因表達穩(wěn)定性由高到低依次為gltA>rpoD>rpsL>atpD>carA>16S rRNA>dsbA>gyrB。另外，為了評估所有候選內(nèi)參基因間的關(guān)系，BestKeeper 還進行了成對的相關(guān)分析，皮爾遜相關(guān)系數(shù)r 和P 值見表4。rpsL 與其它基因的相關(guān)性最高，其次是carA 和16S rRNA，這3 個基因也達到顯著水平（P<0.05），gltA 的相關(guān)性最低。

表4 BestKeeper 分析候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper analyzes the expression stability of candidate reference genes

RefFinder 網(wǎng)站通過以上3 個軟件的算法和比較delta-Ct 方法對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行比較和排名，同時根據(jù)各程序的結(jié)果采用幾何平均值法進行綜合排名。網(wǎng)站的操作很簡便，用戶只需要在窗口輸入各候選內(nèi)參基因的Ct 值，即可得出候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性排名。結(jié)果見表5，geNorm、Normfinder、BestKeeper 在網(wǎng)站中的排名和上面單獨使用程序得出的穩(wěn)定性排名，其結(jié)果相一致。從綜合排名來看，這8 個候選內(nèi)參基因中表達穩(wěn)定性較高的是rpoD 和gltA，穩(wěn)定性最低的是16S rRNA。因此，rpoD 和gltA 適宜選為熒光假單胞菌在外源AHLs 培養(yǎng)下基因表達的內(nèi)參基因。

表5 候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性排名Table 5 Expression stability ranking of candidate reference genes

3 討論與結(jié)論

熒光假單胞菌是冷藏食品的優(yōu)勢腐敗菌，其致腐因子如生物被膜、蛋白酶和脂肪酶的合成都受到QS 信號分子的調(diào)控[12，31]。在探索QS 對食品腐敗調(diào)控機制的過程中，需要用到能夠穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因來準確定量致腐基因的表達。因此，本文通過qPCR 技術(shù)研究了8 個常見的候選內(nèi)參基因（dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16SrRNA）在熒光假單胞菌經(jīng)不同類型QS 信號分子培養(yǎng)后的表達情況，為確保表達穩(wěn)定性評價準確使用了geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 4 個程序，綜合評估后從8 個候選內(nèi)參基因中篩選出最適內(nèi)參基因。結(jié)果表明，在外源AHLs 刺激下，熒光假單胞菌中rpoD 和gltA 的基因表達最穩(wěn)定，可用于后續(xù)熒光假單胞菌QS 調(diào)控機制的研究中。

目前，通過qPCR 技術(shù)研究細菌功能基因在不同生長階段或者不同生長條件下的表達水平，多以16S rRNA 作為內(nèi)參基因。在大部分細菌中16S rRNA 都高度保守且具有特異性[32]，常被用作內(nèi)參基因，然而在本文中，16S rRNA 的Ct 值在8.27～9.37，表達豐度過高且穩(wěn)定性最差，不是熒光假單胞菌內(nèi)參基因的最佳選擇，最適內(nèi)參基因為rpoD 和gltA。rpoD 編碼RNA 聚合酶sigma70 因子，序列保守性超過50%，常用于菌株的分類鑒定和進化分析[33]。gltA 編碼檸檬酸合酶（三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶），最近也被用于多位點序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析[34]。Gomes 等[35]從11 個基因中篩選出recA、rho、rpoD 和proC 作為肺炎克雷伯菌在不同生長階段或環(huán)境脅迫下基因表達的最適內(nèi)參基因。鄭永欽等[36]發(fā)現(xiàn)rpoD 在柑橘黃龍病菌中表達穩(wěn)定性較差，進一步證明不同物種的最適內(nèi)參基因不一定相同。此外，geNorm、Normfinder、Best-Keeper 這3 款程序的統(tǒng)計方法皆不相同，評估候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性時可能會出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況，這就需要進一步使用RefFinder 對這3款程序的結(jié)果進行綜合評估，確保篩選結(jié)果更為可靠。

綜上所述，本研究通過對候選內(nèi)參基因?qū)訉雍Y選與全面評估后，獲得了熒光假單胞菌在外源QS 信號分子培養(yǎng)下表達穩(wěn)定的2 個內(nèi)參基因rpoD 和gltA，為后續(xù)探究熒光假單胞菌致腐基因表達提供理論支持；也為其它腐敗菌提供內(nèi)參基因的參考，從而在研究QS 基因表達時獲得更可靠的相對定量結(jié)果。