張 蓉, 陳光吉, 尚以順* ,梁寶山, 冉偉男,趙明坤,班宋智

(1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550006;2. 思南縣寬坪鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,貴州 思南 565100; 3. 長(zhǎng)順縣送智養(yǎng)殖場(chǎng),貴州 長(zhǎng)順 550707)

在實(shí)際生產(chǎn)中,蛋雞養(yǎng)殖常面臨夏季高溫帶來(lái)的產(chǎn)蛋率下降和雞只腸道健康問(wèn)題。研究表明,高溫環(huán)境下,家禽腸絨毛結(jié)構(gòu)和腸粘膜的完整性易遭受損傷和破壞,進(jìn)而引起宿主與菌群的微生態(tài)平衡被打破,形成腸道受損-菌群失衡-機(jī)體炎癥的惡性循環(huán),嚴(yán)重影響家禽生產(chǎn)性能,甚至導(dǎo)致死亡[1-3]。因此,改善高溫環(huán)境條件下家禽的腸道屏障功能和微生物區(qū)系是緩解家禽高溫暴露負(fù)面效應(yīng)的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn),植物提取物中的某些活性物質(zhì)如黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、皂苷類(lèi)等可通過(guò)抗氧化緩解高溫引發(fā)的生產(chǎn)性能下降、畜禽疾病增加等問(wèn)題[4-5]。如松針中的黃酮可顯著提高氧化應(yīng)激狀態(tài)的肥胖大鼠肝臟中的抗氧化酶活性[6],槲皮素可以提高高溫條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性和抗氧化能力[7],白茶中提取的多酚類(lèi)物質(zhì)能夠使機(jī)體紋狀體細(xì)胞免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷等[8]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),金蕎麥(Fagopyrumdibotrys(D. Don) Hara)根莖中含有大量黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等抗氧化活性物質(zhì),同時(shí)金蕎麥在夏季高溫頻發(fā)的南方地區(qū)的生物產(chǎn)量較高,充分挖掘其飼用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在夏季高溫條件下新鮮金蕎麥替代10%的基礎(chǔ)飼糧飼喂蛋雞可維持原有產(chǎn)蛋率,且降低了血清中炎癥因子和內(nèi)毒素水平,但具體作用機(jī)理未知[10]。

閉合蛋白(Occluding)和Claudin是緊密連接主要的整合膜蛋白,在維持和調(diào)節(jié)緊密連接屏障功能中有重要作用。同時(shí),腸道黏膜中上皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)是參與腸道上皮細(xì)胞的修復(fù)重要因子之一[11-12],因此Occluding、Claudin和EGF可作為腸道損傷程度和修復(fù)功能的表征指標(biāo)。

基于此,本試驗(yàn)擬通過(guò)探究鮮飼金蕎麥對(duì)夏季高溫條件下蛋雞腸道微生物區(qū)系及Occluding、Claudin和EGF的mRNA表達(dá)量的影響,進(jìn)一步解析其作用機(jī)理,為挖掘金蕎麥的飼用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)選取300只32周齡體重相近、健康的長(zhǎng)順綠殼蛋雞,隨機(jī)分為5組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)12只雞。其中,C組飼喂基礎(chǔ)飼糧,T1、T2、T3和T4組分別飼喂添加有5%、10%、15%和20%新鮮金蕎麥的基礎(chǔ)飼糧,5%、10%、15%和20%指的是新鮮金蕎麥占飼喂飼糧的比例。為防止飼料霉變,每天現(xiàn)配現(xiàn)用?；A(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

采用三層式階梯式籠養(yǎng),每籠3只雞。每天光照16 h,自由飲水,每天采摘新鮮的初花期金蕎麥,用粉碎機(jī)粉碎后,與基礎(chǔ)飼糧充分混合,每天喂食2次(9:00和16:00),現(xiàn)配現(xiàn)用。為避免因試驗(yàn)期延長(zhǎng)導(dǎo)致金蕎麥前后生育期不一致,借助金蕎麥多年生的特點(diǎn),試驗(yàn)前期便采用時(shí)間交錯(cuò)種植的方法,保障有足夠數(shù)量的處于初花期的金蕎麥供試驗(yàn)使用,最大程度保證新鮮金蕎麥的成熟度穩(wěn)定。試驗(yàn)時(shí)間為6月份～8月份,試驗(yàn)前關(guān)閉雞舍濕簾降溫裝置,將試驗(yàn)雞只暴露在當(dāng)?shù)刈匀桓邷貤l件下,并在雞舍過(guò)道入口處、中間和雞舍尾部分別懸掛1個(gè)掛壁式室內(nèi)溫濕度計(jì)(天津市美達(dá)時(shí)儀器儀表有限公司),分別在8:00、14:00和23:00記錄雞舍3個(gè)區(qū)域溫度,表2中顯示了6月份、7月份和8月份各時(shí)間點(diǎn)的平均溫度和平均相對(duì)濕度值。預(yù)飼15 d,正試90 d。

表2 試驗(yàn)期各月每天各時(shí)間點(diǎn)的平均溫度和平均相對(duì)濕度Table 2 Average temperature and average relative humidity at each time point of each day in each month of the trial period

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 腸段樣品采集 于90 d試驗(yàn)結(jié)束后,每組選3只雞,禁食12 h,采用無(wú)菌操作分別取十二指腸和回腸腸段的同一部位放入2 ml無(wú)RNA酶凍存管中,液氮保存,待測(cè)。

1.3.1.1 小腸總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用trizol法提取十二指腸和回腸組織總RNA,用核酸蛋白儀測(cè)其完整性、濃度和純度。按照試劑盒Takara的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說(shuō)明合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中雞的GADPH(NM_204305.1)、occluding(NM_205128.1)、Claudin-1(AY750897.1)、EGF(NM_001001292.1)基因的mRNA序列,以GADPH作為內(nèi)參基因,利用Primer Premier5.0引物軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(西安淳風(fēng)信息科技有限公司),引物序列見(jiàn)表3。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

1.3.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以合成的cDNA為模板,按照SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性10 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,延伸完成采集熒光信號(hào),共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量分析法,以GADPH為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 腸道內(nèi)容樣品采集 于90 d試驗(yàn)結(jié)束后,每組選3只雞,禁食12 h,將回腸和盲腸內(nèi)容物置于滅菌凍存管中,液氮速凍,待測(cè)。

1.3.2.2 測(cè)序 使用e.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit(omega)柱子將混好的樣品進(jìn)行膠前純化,用Monarch DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收,1.8%瓊脂糖電泳檢測(cè),Qsep-400 方法質(zhì)檢合格后上機(jī)檢測(cè),根據(jù)illumina novaseq6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(北京百邁克生物科技有限公司)。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行整理,試驗(yàn)結(jié)果按單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì),調(diào)用SPSS 18.0軟件的“一般線(xiàn)性模型(GLM)”程序進(jìn)行方差分析,主效應(yīng)為金蕎麥在飼糧中的添加水平。然后用Duncan法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著。再調(diào)用“回歸分析”中的線(xiàn)性(Linear)和二次(Quadratic)函數(shù)程序?qū)虮磉_(dá)量趨勢(shì)進(jìn)行分析,結(jié)果用平均值表示,各處理變異程度用標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞腸道目的基因mRNA表達(dá)量

由表4可見(jiàn),試驗(yàn)因子顯著影響了蛋雞十二指腸和回腸中的Occluding和EGF的表達(dá)量(P<0.05),各處理Claudin-1的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。其中,十二指腸中的Occluding和EGF的表達(dá)量隨金蕎麥添加量的提高呈顯著的二次上調(diào)趨勢(shì)(P<0.05),以T2組表達(dá)量較高(P<0.05),而回腸中的表達(dá)量成顯著的線(xiàn)性和二次上調(diào)的趨勢(shì)(P<0.05)。

表4 蛋雞腸道claudin-1、occluding以及EGF基因mRNA表達(dá)量Table 4 Expression of claudin-1, occluding and EGF gene mRNA in intestinal tract of laying hens

2.2 蛋雞腸道微生物α多樣性指數(shù)

α多樣性指數(shù)反映組間物種豐度及物種多樣性的差異。其中Shannon和Simpson指數(shù)反映物種多樣性,Ace和Chao指數(shù)評(píng)估物種豐度,Shannon值越大或Simpson值越小,說(shuō)明群落多樣性越高。由表5可知,飼糧中添加金蕎麥主要對(duì)回腸的物種豐度差異顯著(P<0.05),其中T2組的Ace和Chao指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表5 鮮飼金蕎麥對(duì)蛋雞腸道微生物α多樣性指數(shù)的影響Table 5 Effect of fresh-fed Fagopyrum dibotrys on gut microbial α diversity index in laying hens

2.3 蛋雞腸道菌群的物種多樣性分析

高通量測(cè)序表明,蛋雞回腸和盲腸內(nèi)容物樣品測(cè)序共獲得2 288 250 對(duì)Reads,平均產(chǎn)生 74 112 條Clean tags,得到2 251和2 884個(gè)OTU。為更好展現(xiàn)不同金蕎麥添加組之間的差異,分別對(duì)回腸中2 251個(gè)OTU和盲腸中2 884個(gè)OTU進(jìn)行維恩圖分析(圖1和圖2),結(jié)果顯示,回腸中不同處理組之間共有200個(gè)OTU,不同處理組之間獨(dú)有OTU個(gè)數(shù)分別為6、65、1、4和14;盲腸中共有499個(gè)OTU,獨(dú)有OTU個(gè)數(shù)分別為11、10、5、8和8。

圖1 回腸微生物多樣性維恩分析圖Fig.1 Venn diagram analysis of Ileum

圖2 盲腸微生物多樣性維恩分析圖Fig.2 Venn diagram analysis of Cecum

由圖3可知,門(mén)水平上,回腸微生物中相對(duì)豐度前5的細(xì)菌門(mén)分別為厚壁菌(Firmicutes),各組豐度分別為79.24%、56.26%、75.69%、58.72%、36.02%;藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria),各組豐度分別為1.22%、29.74%、18.65%、26.36%、41.13%;放線(xiàn)菌(Actinobacteria),各組豐度分別為84.40%、4.51%、4.06%、9.94%、6.16%;變形桿菌(Proteobacteria),各組豐度分別為6.23%、1.56%、1.17%、3.80%、9.93%;擬桿菌(Bacteroidetes),各組豐度分別為2.38%、7.54%、0.30%、0.64%、0.48%。

圖3 蛋雞回腸微生物在門(mén)水平的組成圖Fig.3 Composition of Ileal microorganism in layer at phyla level

由圖4可知,盲腸微生物中相對(duì)豐度前5的細(xì)菌門(mén)分別為厚壁菌(Firmicutes),各組豐度分別為52.54%、48.03%、50.35%、46.38%、37.49%; 擬桿菌(Bacteroidetes),各組豐度分別為38.90%、40.39%、40.55%、45.29%、41.44%;放線(xiàn)菌(Actinobacteria),各組豐度分別為5.98%、7.18%、4.67%、2.96%、4.78%;疣微菌(Verrucomicrobia),各組豐度分別為0.21%、0.25%、0.31%、0.24%、12.7%;變形桿菌(Proteobacteria),各組豐度分別為1.18%、1.94%、2.34%、2.42%、1.90%。

圖4 蛋雞盲腸微生物在門(mén)水平的組成Fig.4 Composition of Cecal microorganism in layer at phyla level

由圖5可知,屬水平上,回腸微生物中相對(duì)豐度前5的細(xì)菌屬分別為乳桿菌(Lactobacillus)、未分類(lèi)細(xì)菌(uncultured_bacterium)、未分類(lèi)真核生物(uncultured_eukaryote)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和腸球菌(Enterococcus)。各處理組豐度前5的細(xì)菌屬分別為C組:72.36%、0.92%、0.31%、1.06%、0.36%;T1組:49.77%、6.97%、23.87%、34.81%、0.17%;T2組:75.29%、19.51%、0.07%、3.28%、0.03%;T3組:48.93%、28.22%、0.02%、6.10%、3.98%;T4組:30.10%、44.22%、0.02%、3.06%、0.83%。

由圖6可知,盲腸微生物中相對(duì)豐度前5的細(xì)菌屬分別為擬桿菌(Bacteroides)、理研菌(Rikenellaceae_RC9_gut_group) 、乳桿菌(Lactobacillus)、瘤胃球菌(uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae)、扭鏈胃球菌([Ruminococcus]_torques_group)。各處理組豐度前5的細(xì)菌屬分別C組:13.51%、15.98%、12.02%、4.91%、3.15%;T1組:20.95%、11.69%、72.69%、43.48%、43.19%;T2組:17.07%、11.58%、4.50%、3.62%、3.94%;T3組:19.74%、10.99%、1.30%、4.98%、5.93%;T4組:16.66%、13.08%、2.25%、3.93%、4.09%。

圖6 蛋雞盲腸微生物在屬水平的組成Fig.6 Composition of Cecal microorganism in layer at genus level

3 討 論

3.1 鮮飼金蕎麥對(duì)腸道目的基因表達(dá)的影響

正常的腸道粘膜屏障功能是畜禽健康與否的重要保障,當(dāng)高溫不斷刺激畜禽時(shí),機(jī)體會(huì)通過(guò)下調(diào)Occluding和Claudin基因的mRNA表達(dá)增加腸粘膜的通透性,損害畜禽腸道粘膜結(jié)構(gòu),進(jìn)而導(dǎo)致腸道代謝功能障礙。同時(shí),機(jī)體內(nèi)毒素、病原菌等有害物質(zhì)通過(guò)受損的腸道粘膜釋放進(jìn)入血液,誘發(fā)腸炎、敗血癥及多臟器功能衰竭綜合征[13-14]。

目前,某些中草藥及其提取物作為抗生素替代品是飼料行業(yè)研究熱點(diǎn)之一,沈萍等[15]將由藿香、薄荷、知母、紅景天等7種中草藥組成的方劑添加在高溫條件下的蛋雞飼糧中,發(fā)現(xiàn)蛋雞小腸局部黏膜免疫功能得到改善,腸道上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量和濃度均提高。何邵平[16]報(bào)道指出,中草藥虎杖提取物白藜蘆醇(200～500 mg/kg)能夠有效改善高溫條件下肉雞機(jī)體代謝,提高腸道緊密連接,抑制炎癥反應(yīng),提高生產(chǎn)性能。Mei等[17]研究發(fā)現(xiàn),中草藥厚樸提取的厚樸酚(20 μmol/L)可緩解熱應(yīng)激造成的小鼠小腸上皮細(xì)胞G1期細(xì)胞周期阻滯。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在夏季自然高溫條件下蛋雞飼糧中添加10%～15%的新鮮金蕎麥上調(diào)了十二指腸和回腸中的Occluding和EGF的基因表達(dá)量,表明金蕎麥具有提高蛋雞腸道緊密連接的作用,且改善了腸道受損的修復(fù)機(jī)能,這與韓芳芳等[18]報(bào)道指出的金蕎麥提取物上調(diào)了豬上皮細(xì)胞閉合小環(huán)蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、Occluding的表達(dá),抑制機(jī)體炎癥反應(yīng),保護(hù)腸道粘膜的結(jié)果類(lèi)似,可能是由于金蕎麥含有黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等多重抗氧化活性成分,能顯著清除O2-和-OH,增加代謝自由基的酶的活性,緩解蛋雞因高溫造成的氧化應(yīng)激反應(yīng),間接影響了腸道緊密連接蛋白和修復(fù)因子的表達(dá)[19-20],但具體分子信號(hào)通路的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.2 鮮飼金蕎麥對(duì)熱應(yīng)激蛋雞微生物區(qū)系的影響

研究發(fā)現(xiàn),家禽的腸道屏障有四個(gè),主要包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和微生物屏障,四個(gè)屏障之間相互關(guān)聯(lián)、共同維護(hù)家禽腸道健康[21]。其中腸道微生物不僅參與腸道中大部分的新陳代謝活動(dòng),同時(shí)可以在腸道粘膜表面形成保護(hù)層,阻止致病菌侵入機(jī)體,因此,腸道微生物對(duì)于維持腸道穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[22]。當(dāng)畜禽暴露在高溫條件下,腸道微生態(tài)平衡遭到破壞,有害微生物開(kāi)始在腸道上皮細(xì)胞黏附、定植,損害家禽腸道屏障[23]。

本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同金蕎麥添加劑量中蛋雞回腸和盲腸微生物多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,回腸中相對(duì)豐度前5的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分別為:厚壁菌、藍(lán)細(xì)菌、放線(xiàn)菌、變形桿菌和擬桿菌。這與王雪潔[24]報(bào)道的回腸主要細(xì)菌門(mén)類(lèi)型的結(jié)果有所差異,主要表現(xiàn)在藍(lán)細(xì)菌門(mén)在家禽腸道中鮮見(jiàn),而哺乳類(lèi)或其它脊椎動(dòng)物腸道中卻常見(jiàn)[25],可能是由于家禽回腸中菌群定植的種類(lèi)受動(dòng)物品種、生存環(huán)境影響所致[26]。盲腸中豐度前5的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分別為:厚壁菌、擬桿菌、放線(xiàn)菌、疣微菌和變形桿菌。回腸中豐度前5的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為:乳桿菌、未分類(lèi)細(xì)菌、其他細(xì)菌、雙歧桿菌和腸球菌;盲腸中分別為:擬桿菌、理研菌、乳桿菌、瘤胃球菌和扭鏈胃球菌。這與前人報(bào)道雞腸道主要細(xì)菌門(mén)與細(xì)菌屬類(lèi)型的結(jié)果基本吻合[27-28]。然而,各處理蛋雞回腸和盲腸微生物結(jié)構(gòu)和組成存在較大差異,主要表現(xiàn)在試驗(yàn)組蛋雞腸道中厚壁菌門(mén)(36.02%～75.69%)和放線(xiàn)菌門(mén)(4.06%～9.94%)的豐度顯著低于對(duì)照組(79.24%和84.40%),而藍(lán)菌門(mén)呈相反趨勢(shì);此外,試驗(yàn)因子降低了盲腸中的厚壁菌門(mén)豐度,但提高了擬桿菌門(mén)豐度,該結(jié)果提示新鮮金蕎麥作為蛋雞飼糧組成部分對(duì)其腸道優(yōu)勢(shì)菌群有較大影響,但這種變化對(duì)腸道功能或其它機(jī)能的正面或負(fù)面作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。值得注意的是,雙歧桿菌屬和乳桿菌屬作為家禽腸道中的有益菌群[29]也出現(xiàn)了較大差異,蛋雞回腸中的雙歧桿菌屬豐度隨金蕎麥添加水平的提高呈整體上升趨勢(shì),但盲腸中的乳桿菌屬整體呈先上升后降低的趨勢(shì)(豐度最高為T(mén)2組72.69%),表明金蕎麥有利于蛋雞回腸中雙歧桿菌的增殖,而對(duì)盲腸中乳桿菌屬的增殖有劑量效應(yīng),即適宜添加量的新鮮金蕎麥有利于蛋雞盲腸中乳桿菌的增殖,超過(guò)10%則會(huì)對(duì)乳桿菌的增殖有負(fù)面作用,不利于病原菌抑制和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[30],該效應(yīng)與本課題前期研究的產(chǎn)蛋率等生產(chǎn)性能結(jié)果相吻合[10]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,金蕎麥作為蛋雞飼糧的組成部分具有提高腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)量的作用,同時(shí)改變了回腸中細(xì)菌門(mén)的多樣性和盲腸中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的豐度,但還不清楚微生物菌群變化與腸道緊密連接蛋白的基因表達(dá)的關(guān)系,這將成為下一步的研究方向,以進(jìn)一步揭示金蕎麥對(duì)蛋雞抗熱應(yīng)激的作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

鮮飼金蕎麥上調(diào)了夏季高溫條件下蛋雞十二指腸和回腸中緊密連接蛋白基因Occluding和修復(fù)因子基因EGF的表達(dá)量;鮮飼金蕎麥改變了夏季高溫條件下蛋雞回腸和盲腸細(xì)菌門(mén)的多樣性,促進(jìn)了雙歧桿菌屬的増殖,添加量不超過(guò)10%時(shí)對(duì)乳桿菌屬的増殖有正向調(diào)控作用。