陳茜 朱鵬

膽囊癌(gallbladder carcinoma,GBC)是臨床上十分常見的消化道惡性腫瘤,導(dǎo)致了十分嚴(yán)重的社會(huì)及醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。全球每年新發(fā)GBC患者約12萬,超過70%的新發(fā)GBC患者在亞太地區(qū),每年約8萬患者因GBC病死,標(biāo)準(zhǔn)化病死率為0.84/10萬人,是發(fā)病率及致死率都較高的消化道惡性腫瘤[1, 2]。由于膽囊的解剖學(xué)位置和功能特殊,GBC患者早期無顯著的臨床表現(xiàn)及體征,且缺少篩查特異性的生物學(xué)標(biāo)志物,GBC在確診時(shí)通常都處于疾病中晚期,喪失了手術(shù)根治性切除的機(jī)會(huì),患者預(yù)后通常較差,短期病死率高[3]。流行病學(xué)資料顯示,GBC的總體生存率(overall survival,OS)極低,未經(jīng)根治性手術(shù)治療的GBC患者3年總體OS低于30%[4]。類似其他實(shí)體惡性腫瘤,GBC致病及進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制十分復(fù)雜,目前尚未完善闡明[5, 6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在人體內(nèi)廣泛分布的不具有編碼功能的小RNA,miRNA通常由19～24個(gè)核苷酸組成,其功能主要依靠直接結(jié)合到特定靶基因的3′-非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)來影響該基因翻譯為功能蛋白,從而對(duì)機(jī)體各類病理生理過程發(fā)揮調(diào)控作用[7]。既往研究顯示,miRNA在GBC的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著十分重要的調(diào)控作用[8]?；诖?本文對(duì)GBC中miRNA的調(diào)控功能及臨床應(yīng)用方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述,以期為臨床診療提供參考。

一、特異性miRNA參與調(diào)節(jié)GBC發(fā)生及發(fā)展

GBC作為惡性度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,其致病機(jī)制十分復(fù)雜,多個(gè)分子信號(hào)通路在其中相互影響,導(dǎo)致了GBC的發(fā)生[9]。特異性miRNA表達(dá)水平的改變也在GBC的發(fā)生中發(fā)揮重要調(diào)控作用,相關(guān)的研究方面也積累了大量證據(jù)。Su等[10]研究顯示,通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選出GBC中存在159個(gè)在GBC中表達(dá)存在異常的特異性miRNA,包含34個(gè)上調(diào)miRNA及125個(gè)下調(diào)的miRNA。數(shù)據(jù)分析顯示,表達(dá)增強(qiáng)的miRNA-125a-3p、miRNA-4647,以及表達(dá)降低的miRNA-29c-5p、miRNA-145a-5p、miRNA-192-5p、miRNA-194-5p、miRNA-339-8-3p的改變差異最為明顯,且與GBC患者的生存預(yù)后存在相關(guān)性?；谛畔W(xué)分析,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)STEAP3-AS1/hsa-miR-192-5p/MAD2L1信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)控GBC腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期及增殖中具有重要調(diào)控作用。Cao等[11]基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的分析顯示,來源于GBC患者的腫瘤組織中存在25個(gè)表達(dá)升高的miRNA及97個(gè)表達(dá)下降的miRNA,其中 miRNA-4430及miRNA-642a-3p升高最為明顯,miRNA-451a及miRNA-145-5p降低最為明顯,基于GO及KEGG分析顯示,上述miRNA的調(diào)節(jié)基因主要為mTOR及PI3K-Akt信號(hào)通路的相關(guān)功能蛋白,上述信號(hào)通路主要在細(xì)胞周期及凋亡作用中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Tong等[12]納入了39名GBC患者,結(jié)果顯示,GBC患者原位腫瘤組織中的miRNA-197表達(dá)顯著升高,且其升高程度與患者不良預(yù)后存在相關(guān)性。在細(xì)胞模型中降低miRNA-197的表達(dá)可抑制GBC細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示,miRNA-197可以直接結(jié)合到IGFBP3的3-UTR,從而抑制其表達(dá),并降低增殖相關(guān)蛋白p-ERK1/2、pAKT的表達(dá),并增加凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2、caspase-3的表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控功能。Ouyang等[13]研究也發(fā)現(xiàn),與匹配的癌旁組織相比,GBC腫瘤組織中的miRNA-146b-5p表達(dá)顯著降低,而對(duì)應(yīng)的靶向調(diào)控基因Toll樣受體4(TLR4)的表達(dá)則顯著升高。進(jìn)一步研究表明,miRNA-146b-5p表達(dá)減少可導(dǎo)致TLR4表達(dá)增高,從而激活NF-κB信號(hào)通路,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。同時(shí),研究者還在BALB/c裸鼠異種移植瘤模型中進(jìn)行了驗(yàn)證,通過分子技術(shù)增強(qiáng)miRNA-146b-5p的表達(dá)則可達(dá)到縮小腫瘤體積、抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用,這也提示了miRNA-146b-5p/TLR4/NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)GBC致病中具有重要的功能作用。Wang等[14]對(duì)GBC腫瘤組織中miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,與健康對(duì)照相比,長期存活GBC及短期存活GBC患者分別存在104級(jí)124個(gè)特異性miRNA的表達(dá)異常。長期存活GBC患者的miRNA-1421a-5p、miRNA-146b-5p,以及短期存活患者的miRNA-30a-3p、miRNA-660-5p、miRNA-338-3p的表達(dá)差異最為明顯。富集分析顯示,在短期存活GBC患者中miRNA失調(diào)涉及46個(gè)生物學(xué)過程及44個(gè)信號(hào)通路功能的紊亂等。上述研究結(jié)果均提示了特異性miRNA在調(diào)控GBC腫瘤細(xì)胞增殖中的重要作用,但是由于目前研究技術(shù)和生物信息學(xué)分析工具的限制,對(duì)于特異性miRNA在GBC致病中作用的分析往往只能從單一的信號(hào)通路入手,而一些特異性miRNA及其下游的功能蛋白可能在多個(gè)信號(hào)通路中發(fā)揮作用,因此未來還需要更為優(yōu)良的分析方法來進(jìn)一步闡述miRNA參與GBC的致病機(jī)制。

另一方面,侵襲及轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特點(diǎn),也是導(dǎo)致患者臨床預(yù)后不佳的重要原因之一。GBC惡性程度較高,其侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移在臨床上也十分常見。特異性miRNA作為調(diào)控GBC腫瘤細(xì)胞功能的重要因子,大量研究證據(jù)也顯示其參與了對(duì)GBC侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的調(diào)控。Zhang等[15]最新研究發(fā)現(xiàn),在來源GBC患者的腫瘤組織及模型細(xì)胞系(GBC-sd、SGC-996)中均可觀察到miRNA-182的表達(dá)升高。在模型細(xì)胞中降低miRNA-182的表達(dá)則可以顯著減弱GBC細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)作用,降低波形蛋白表達(dá),增高E-cadherin表達(dá),從而減弱腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移的能力。機(jī)制分析顯示,FOXN3是miRNA-182的靶向調(diào)控基因,miRNA-182可以直接結(jié)合到FOXN3的3-UTR,從而抑制FOXN3表達(dá),并激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,促進(jìn)EMT的發(fā)生。Hu等[16]研究發(fā)現(xiàn),來源于GBC患者的腫瘤組織中存在miRNA-4733-5p表達(dá)顯著升高,而KLF7(krppel-like facotr-7)表達(dá)則顯著降低。機(jī)制分析顯示,KLF7是miRNA-4733-5p的靶向調(diào)控基因。同時(shí)研究者還在移植瘤動(dòng)物模型上進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示miRNA-4733-5p可以促進(jìn)GBC腫瘤細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其侵襲能力,其也主要通過抑制KLF7的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)上述功能調(diào)控作用。Jiang等[17]研究也發(fā)現(xiàn),與匹配的癌旁組織相比,GBC腫瘤組織中miRNA-365的表達(dá)顯著降低,增強(qiáng)miRNA-365的表達(dá)則可顯著抑制GBC模型細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力。熒光素酶分析顯示Ras相關(guān)C3肉毒毒素底物1 (RAC1)是miRNA-365的直接調(diào)控靶點(diǎn)。特異性miRNA-365表達(dá)降低的同時(shí)RAC1表達(dá)增強(qiáng),并促進(jìn)GBC的侵襲能力顯著升高。

二、特異性 miRNA用于GBC診斷及預(yù)后的臨床價(jià)值

GBC起病隱匿,早期通常無顯著臨床癥狀和體征,大量患者在臨床確診時(shí)已處于疾病中晚期,失去了根治性手術(shù)的機(jī)會(huì),導(dǎo)致GBC的總體預(yù)后不佳[18]。臨床上對(duì)GBC的早期診斷及準(zhǔn)確評(píng)估有助于及時(shí)指導(dǎo)臨床干預(yù)措施,從而最大限度地改善GBC患者的預(yù)后。目前針對(duì)GBC的早期診斷方法包括血清學(xué)指標(biāo)及影像學(xué)檢查,均存在診斷特異度較低的不足,臨床上也一直在尋找改進(jìn)GBC早期診斷的方法[19]。Yang等[20]基于多中心患者的研究發(fā)現(xiàn),GBC患者存在血清miRNA-552-3p、miRNA-581、miRNA-4433a-3p、miRNA-496和miRNA-203b-3p表達(dá)的升高。同時(shí),研究者建立了聯(lián)合上述5項(xiàng)miRNA的早期診斷模型,并在患者隊(duì)列中進(jìn)行了驗(yàn)證(包含102名GBC患者及112名慢性膽囊炎患者多作為對(duì)照),結(jié)果顯示,聯(lián)合模型診斷GBC的曲線下面積(area under curve,AUC)為0.905,靈敏度和特異度分別為81.37%和86.61%,且診斷準(zhǔn)確度甚至優(yōu)于血清糖類抗原-199(carbohydrate antigen-199,CA-199)及癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)。莊琰等[21]基于中國GBC患者的研究也顯示,使用血清miRNA-29c-3p水平作為無創(chuàng)指標(biāo)診斷GBC的AUC可達(dá)71.7%,診斷靈敏度和特異度分別為82.4%和64.5%。此外,使用血清miRNA-29c-3p聯(lián)合多層螺旋CT及血清lnc RNA TUG1用于診斷GBC的AUC可達(dá)85.5%,診斷靈敏度及特異度分別為78.4%及90.8%,提示miRNA-29c-3p聯(lián)合影像學(xué)等指標(biāo)用于GBC的早期臨床診斷具有較高的價(jià)值。上述研究結(jié)果提示血清特異性miRNA作為無創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo)診斷GBC具有一定的臨床價(jià)值,但是目前的研究證據(jù)仍不夠充分,還需要更多深入的前瞻性研究對(duì)miRNA的臨床診斷價(jià)值進(jìn)行驗(yàn)證,包括嘗試建立包含miRNA的聯(lián)合診斷模型等來改進(jìn)對(duì)GBC的診斷。

特異性miRNA不僅在用于GBC的診斷上具有潛在的臨床價(jià)值,對(duì)于GBC的預(yù)后評(píng)估也體現(xiàn)了一定價(jià)值,在這方面也積累了大量的研究證據(jù)。Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn),GBC腫瘤組織中的miRNA-139-5p表達(dá)顯著降低,且低miRNA-139-5p表達(dá)與不良預(yù)后存在顯著的相關(guān)性。同時(shí)機(jī)制研究也顯示,丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)是miRNA-139-5p調(diào)控的直接作用靶點(diǎn),miRNA-139-5p能夠抑制PKM2表達(dá),從而影響GBC細(xì)胞的能量代謝能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),增強(qiáng)miRNA-139-5p表達(dá)可顯著抑制GBC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。Lv等[23]開展的臨床研究納入了159名GBC患者,收集了患者的腫瘤組織及匹配的癌旁組織,并檢測(cè)了組織中的miRNA-146-5p表達(dá)程度。結(jié)果顯示,GBC腫瘤組織中的miRNA-146-5p表達(dá)程度顯著降低,且miRNA-146-5p表達(dá)與TNM分期(P=0.009)、肝臟轉(zhuǎn)移(P=0.001)及腫瘤低分化(P=0.001)存在相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析顯示,高表達(dá)miRNA-146-5p的GBC患者總體生存期高于miRNA-146b-5p低表達(dá)患者(P=0.0005),且低miRNA-146b-5p表達(dá)是GBC患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn),GBC腫瘤組織中的miRNA-204表達(dá)較健康對(duì)照組顯著降低,且低miRNA-204表達(dá)程度與高臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及低分化存在正相關(guān)。機(jī)制分析顯示,miRNA-204主要通過直接靶向抑制Notch2的表達(dá),從而參與對(duì)GBC腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡功能的調(diào)控。同時(shí)基于患者隨訪(3年)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),低miRNA-204是患者臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=2.35,P<0.01)。徐順林等[25]研究也發(fā)現(xiàn),GBC患者存在血清miRNA-187表達(dá)升高及miRNA-143表達(dá)的顯著降低,miRNA-187及miRNA-143表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期存在相關(guān)性。單因素分析顯示,高miRNA-187表達(dá)或低miRNA-143表達(dá)的GBC患者3年OS更低。多因素Logistic回歸分析顯示,TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)(OR=3.529,P=0.029)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=4.208,P=0.001),高miRNA-187表達(dá)(OR=3.626,P=0.013)、低miRNA-143表達(dá)(OR=3.758,P=0.004)是影響GBC患者3年OS的獨(dú)立影響因素。上述研究結(jié)果均顯示了使用特異性miRNA來作為GBC患者的臨床預(yù)后指標(biāo)具有重要的臨床價(jià)值。

三、靶向miRNA的治療GBC的臨床價(jià)值

由于GBC患者在確診時(shí)通常分期較晚,喪失了根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì),臨床預(yù)后通常較差。目前對(duì)于早期GBC的治療主要推薦外科根治性手術(shù),而對(duì)于中晚期GBC患者,包括放化療在內(nèi)的治療方法均不能獲得滿意的療效,中晚期GBC患者通常在較短時(shí)間病死[26]。臨床上也一直在探索針對(duì)GBC患者的更為安全有效的特異性藥物?；谔禺愋詍iRNA在GBC的發(fā)生與致病中的重要作用,也有大量研究嘗試靶向特異miRNA的方式來治療GBC,也取得了一些重要的研究進(jìn)展。然而,這些方法目前仍只是停留在細(xì)胞及動(dòng)物模型層面,距離臨床實(shí)際應(yīng)用尚有問題需要克服。

其一,研究數(shù)據(jù)也顯示,直接通過調(diào)控特異性miRNA的表達(dá)水平來發(fā)揮對(duì)腫瘤的抑制作用存在可能。Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn),GBC患者的腫瘤組織及模型動(dòng)物中均存在miRNA-195-5p表達(dá)的顯著降低。熒光素酶分析顯示,miRNA-195-5p能夠靶向抑制GBC細(xì)胞中的FOSL1表達(dá),而FOSL1是參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的重要功能蛋白,其能夠通過激活下游的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控。研究者還發(fā)現(xiàn),通過基因轉(zhuǎn)染來增強(qiáng)miRNA-195-5p的表達(dá)能夠顯著抑制GBC細(xì)胞的增殖及侵襲能力,從而發(fā)揮對(duì)腫瘤的抑制作用,這也提示miRNA-195-5p可能作為治療GBC的重要靶點(diǎn)。Yan等[28]研究也發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照相比,GBC腫瘤干細(xì)胞中miRNA-4461表達(dá)顯著降低,增強(qiáng)細(xì)胞模型中的miRNA-4461的表達(dá)可限制抑制GBC細(xì)胞的增殖,同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。功能分析顯示,miRNA-4461主要靶向抑制EGFR的表達(dá),從而影響下游的AKT活性,來發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。Li等[29]研究發(fā)現(xiàn),GBC腫瘤組織中的miRNA-188-5p表達(dá)顯著降低,且miRNA-188-5p下降程度與更大的腫瘤體積、更多的淋巴結(jié)及廣泛遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。同時(shí)miRNA-188-5p高表達(dá)患者的OS比miRNA-188-5p低表達(dá)患者更長。增強(qiáng)miRNA-188-5p的表達(dá)可抑制GBC腫瘤細(xì)胞的增殖能力,并減弱腫瘤侵襲能力。機(jī)制分析顯示,miRNA-188-5p能夠調(diào)控GBC中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路及p-38/JNK信號(hào)通路功能,從而實(shí)現(xiàn)上述作用。

其二,特異性miRNA也可能作為輔助治療方法來改善常規(guī)化療的療效。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn),GBC細(xì)胞模型(GGC-SD和SGC-996細(xì)胞株)中存在miRNA-335表達(dá)的顯著降低,且miRNA-335降低程度與腫瘤體積及臨床分期密切相關(guān)。通過轉(zhuǎn)染miRNA-335微粒來增強(qiáng)GBC模型細(xì)胞對(duì)5-氟氟嘧啶的敏感度,并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。機(jī)制分析也顯示miRNA-335主要通過抑制MEF2D基因的表達(dá),從而影響腫瘤細(xì)胞周期中G1/G0期。Gong等[31]研究發(fā)現(xiàn),與匹配的癌旁組織相比,GBC患者原位腫瘤組織中的miRNA-1231表達(dá)顯著降低,且miRNA-1231表達(dá)越低、腫瘤體積越大、分期越晚,總體預(yù)后更差。熒光素酶分析顯示FOXC2是miRNA-1231的靶向調(diào)控基因?；诩?xì)胞模型的研究顯示,通過增強(qiáng)miRNA-1231表達(dá),可抑制FOXC2的轉(zhuǎn)錄,從而減弱GBC的增殖,并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。此外,研究還發(fā)現(xiàn),升高miRNA-1231的表達(dá)還可增強(qiáng)GBC腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物多西他賽的敏感度,增強(qiáng)藥物療效。Yang等[32]研究發(fā)現(xiàn),GBC模型細(xì)胞中miRNA-193a-3p表達(dá)顯著降低,通過增強(qiáng)miRNA-193a-3p表達(dá)可減弱GBC腫瘤細(xì)胞的增殖能力,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究者在移植瘤小鼠模型中還發(fā)現(xiàn),增加miRNA-193a-3p表達(dá)可以增強(qiáng)GBC腫瘤對(duì)曲美替尼治療敏感度,增強(qiáng)藥物療效。機(jī)制分析顯示,miRNA-193a-3p主要通過靶向調(diào)控基因KRAS的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)上述功能。上述研究結(jié)果也初步顯示,特異性miRNA在用于改善GBC患者對(duì)化療藥物敏感性方面具有潛在的臨床價(jià)值。

四、問題及展望

綜上所述,特異性miRNA在GBC的致病及進(jìn)展中發(fā)揮著十分重要的調(diào)控功能。同時(shí)作為檢測(cè)較為便捷的無創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo),特異性miRNA在用于GBC的早期診斷及預(yù)后評(píng)估方面也積累了一定的證據(jù),顯示出了較高的價(jià)值。靶向特異性miRNA用于GBC治療的研究目前仍停留在細(xì)胞及動(dòng)物模型階段,距離臨床實(shí)際應(yīng)用仍有巨大的差距。下一步仍需深入探討miRNA參與調(diào)控GBC發(fā)生及發(fā)展的具體生物學(xué)機(jī)制,從而為篩選臨床診斷評(píng)估指標(biāo)及探索更為安全有效的分子靶向治療方法提供參考,使更多的GBC患者從中獲益。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。