成程，陳向梅，馬健，張沂

柴桂解表顆粒是一種純中藥制劑，主要的功效是表里雙解、清熱解毒，由解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心（原海軍總醫(yī)院）研發(fā)，是該院非標(biāo)準(zhǔn)制劑，主要中藥成分有黃芩、麻黃、桂枝、白芍、柴胡等，臨床上用來(lái)治療急性上呼吸道感染［1］，證屬衛(wèi)分受寒，肺有蘊(yùn)熱，癥狀可見(jiàn)發(fā)熱、頭痛、咽痛、鼻塞、流涕等。該制劑已建立的質(zhì)量分析方法包括主要藥味桂枝、黃芩、麻黃和甘草的薄層鑒別，指標(biāo)成分芍藥苷的含量測(cè)定等［1-2］。為進(jìn)一步完善柴桂解表顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究參考2015 年版《中國(guó)藥典》［3］及黃芩苷相關(guān)檢測(cè)文獻(xiàn)［4-5］建立柴桂解表顆粒中黃芩苷含量的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）測(cè)定方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確，可取代黃芩薄層色譜鑒別作為柴桂解表顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。

1 材料與方法

1.1 儀器

1200 高效液相色譜儀、VWD 檢測(cè)器和HP 二維化學(xué)工作站，均為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津，型號(hào)UV-2450）；電子分析天平（上海梅特勒托利多公司，型號(hào)PL203）。

1.2 試劑

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為110715-201318，供含量測(cè)定用，含量以93.3% 計(jì)）；柴桂解表顆粒樣品由解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)研究中心（原海軍總醫(yī)院）提供（3 批次的批號(hào)分別為：20141015、20150201、20150425）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為自制超純水。

1.3 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為5 μl；柱溫：40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm［6］。

1.4 溶液制備

1.4.1 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，60 ℃減壓干燥4 h，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 ml 含黃芩苷40 μg 的溶液作為對(duì)照品。

1.4.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)備供試品溶液之前，分別對(duì)取樣量、溶劑、提取溶劑量、提取方法做選擇實(shí)驗(yàn)。測(cè)定結(jié)果確定供試品的取樣量為0.4 g時(shí)單位重量峰面積最大，見(jiàn)表1。不同溶劑提取測(cè)定結(jié)果表明70%乙醇提取效果較好，見(jiàn)表2。提取溶劑量的選擇結(jié)果表明70% 乙醇50 ml 能將有效成分提取完全，見(jiàn)表3。提取方法的選擇結(jié)果表明選用超聲20 min 的提取方法處理效果比較好且簡(jiǎn)單，見(jiàn)表4。供試品溶液制備：精密稱(chēng)定研細(xì)后的柴桂解表顆粒樣品0.4 g，置于200 ml 具塞錐形瓶中，精密加入70% 乙醇50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）20 min。放至室溫后再稱(chēng)定重量，減失的重量用70% 乙醇補(bǔ)足，搖勻后過(guò)濾，濾液即為供試品溶液。

表1 不同取樣量提取后的測(cè)定結(jié)果

表2 不同溶劑提取測(cè)定結(jié)果

表3 不同乙醇量提取后測(cè)定結(jié)果

表4 不同提取方法測(cè)定結(jié)果

1.4.3 陰性對(duì)照品溶液制備 依照柴桂解表顆粒處方中各味中藥的比例，去掉黃芩，按其工藝制成陰性制劑，按1.4.2 節(jié)的方法制備陰性對(duì)照品溶液。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性

分別取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照品溶液各5 μl 進(jìn)樣，分別進(jìn)行HPLC 分析，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。在供試品的色譜圖上，與對(duì)照品對(duì)應(yīng)的位置上有色譜峰出現(xiàn)，主峰與其他成分分離良好。陰性對(duì)照品的色譜圖中，在相應(yīng)的出峰時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，系統(tǒng)適用性良好。

圖1 黃芩苷對(duì)照品、柴桂解表顆粒供試品和陰性對(duì)照品HPLC 色譜圖

2.2 考察線(xiàn)性關(guān)系

精密稱(chēng)取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品10.95 mg，置于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成408.7 μg/ml 的溶液，作為對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、5.0 ml 置于5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液各5 μl，進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，黃芩苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=2 693x-4.98，相關(guān)系數(shù)r=1，這表明黃芩苷在0.045 87～2.293 50 μg/ml 范圍色譜峰面積和進(jìn)樣量呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取8.17 μg/ml 黃芩苷對(duì)照品溶液5 μl，進(jìn)行HPLC 測(cè)定，記錄峰面積。重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=0.3%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取20150425 批次柴桂解表顆粒樣品6 份，分別制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC 分析，記錄HPLC 峰面積。黃芩苷含量平均為4.36 mg/g，RSD=1.33%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取20150425 柴桂解表顆粒（黃芩苷含量4.36 mg/g）樣品0.16、0.20、0.24 g，每個(gè)重量各3 份，分別精密加入適量的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品。按供試品溶液的制備方法制備加樣回收測(cè)定溶液，HPLC測(cè)定其黃芩苷含量，并計(jì)算回收率，回收率為97.85%～101.68%，平均為99.6%，加樣回收良好。見(jiàn)表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 流動(dòng)相比例的選擇

流動(dòng)相選用甲醇-磷酸-水（45∶0.2∶55），甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53），甲醇-磷酸-水（49∶0.2∶51），見(jiàn)圖2～4。最終選定甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）的流動(dòng)相系統(tǒng)，可使黃芩苷達(dá)到基線(xiàn)分離。

圖2 流動(dòng)相甲醇-磷酸-水（45∶0.2∶55）

圖3 流動(dòng)相甲醇-磷酸-水（47∶0.2∶53）

圖4 流動(dòng)相甲醇-磷酸-水（49∶0.2∶51）

2.7 樣品測(cè)定

不同色譜柱的比較，選用了2 種色譜柱進(jìn)行比較：Discovery C18Cat#：504971 HPLC Column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）和 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm），見(jiàn)圖5、6。由圖可見(jiàn)C18色譜柱均能很好地使黃芩苷達(dá)到基線(xiàn)分離，方法學(xué)驗(yàn)證采用的是Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）色譜柱。

圖5 色譜柱Discovery C18 Cat #：504971 HPLC Column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）

分別取柴桂解表顆粒3 個(gè)批次的樣品，制備供試品溶液。取每個(gè)批次的供試品溶液5 μl 進(jìn)樣分析，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見(jiàn)表7。3 批柴桂解表顆粒中的黃芩苷含量分別為4.07、4.11、4.40 mg/g，初步制定柴桂解表顆粒質(zhì)量分析標(biāo)準(zhǔn)中的黃芩苷含量為4～4.5 mg/g。

表7 樣品中黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

黃芩是柴桂解表顆粒中的主要成分，黃芩苷也是主要功能成分之一。在前期制定柴桂解表顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中，由于提取工藝的原因，未能從黃芩中提取出黃芩苷，只能用漢黃芩素作為對(duì)照品對(duì)黃芩進(jìn)行薄層色譜鑒定［1］。本試驗(yàn)對(duì)黃芩的提取工藝進(jìn)行了研究，比較了純甲醇、80% 甲醇、純乙醇、70%乙醇、50%乙醇的提取效果，試驗(yàn)結(jié)果表明70% 乙醇提取黃芩苷的效果較好。以70% 乙醇為溶劑，提取方法分別采用加熱回流30、60、120 min，超聲20、30、60 min，結(jié)果表明選用超聲20 min 的方法提取率較高。柴桂解表顆粒樣品溶于70% 乙醇中，超聲提取20 min 后可提取出黃芩苷用于HPLC檢測(cè)。

經(jīng)過(guò)專(zhuān)屬性試驗(yàn)、線(xiàn)性關(guān)系考察、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)等方法學(xué)考察，結(jié)果顯示HPLC 用于柴桂解表顆粒中黃芩苷含量的測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便易行，可以作為柴桂解表顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)使用。