鐘俊宇，李濤，鄭隆清，尹福泉

廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東湛江524088

玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）是一種有毒的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。污染動(dòng)物飼料的霉菌毒素可對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性作用，并轉(zhuǎn)移到動(dòng)物產(chǎn)品中，危害動(dòng)物與人類健康[1]?？蒲袡C(jī)構(gòu)在全國(guó)范圍內(nèi)所采集的840 余份飼料原料和飼料樣品經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),我國(guó)的飼料原料和飼料均受到不同程度的污染[2]。根據(jù)Holanda 等報(bào)告，美國(guó)每年因?yàn)閯?dòng)物攝入飼料被ZEA 污染而導(dǎo)致農(nóng)業(yè)虧損將近數(shù)十億美元[3]。ZEA嚴(yán)重?fù)p害動(dòng)物的肝功能和結(jié)構(gòu)[4]，對(duì)小腸的發(fā)育和吸收能力造成不利影響[5]，破壞大腸的防御機(jī)制[6]和污染盲腸微生物群[7]。由于ZEA 具有雌激素的作用，臨床表現(xiàn)為雌激素過多，導(dǎo)致母豬外陰發(fā)紅、充血和水腫，子宮增大，卵巢上形成囊腫和乳腺增大[8]。

ZEA 的脫毒方法主要包括物理、化學(xué)和微生物脫毒方法。物理法、化學(xué)法儀器設(shè)施花費(fèi)較大，必須考慮營(yíng)養(yǎng)元素?fù)p失、藥物殘留和消化性降低等因素[9]。微生物法因具有高度特異性、有效性以及代謝產(chǎn)物無毒性的優(yōu)點(diǎn)，在ZEA 脫毒中具有較大的應(yīng)用潛力[10]。雷元培[11]篩選的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ANSB01G 對(duì)ZEA 降解率高達(dá)88.65%，較好地減輕了ZEA 對(duì)青年母豬的危害。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)和角蛋白酶組合的益生菌，被動(dòng)物采食后，在動(dòng)物的胃腸道內(nèi)產(chǎn)生淀粉酶，可以促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收；同時(shí)，它所分泌的酶類對(duì)霉菌毒素具有較好的降解作用[12]。但益生菌對(duì)緩解育肥母豬ZEA 中毒癥狀是否有效果目前還不清楚，為進(jìn)一步明確益生菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用效果，本文采用自制的益生菌添加于飼料基礎(chǔ)配方中，對(duì)比分析不同試驗(yàn)組育肥母豬的生產(chǎn)性能、血清學(xué)指標(biāo)和肝臟中殘留ZEA 量，研究微生物脫毒方法的實(shí)際應(yīng)用效果，為擴(kuò)大益生菌的應(yīng)用及飼料ZEA污染的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用菌種

自制益生菌（地衣芽孢桿菌≥2.0×106CFU/g，角蛋白酶酶活≥100 U/g）由廣東海洋大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)分子研究室配制。

1.2 儀器設(shè)備

電子分析天平（舜宇恒平儀器），高速冷凍離心機(jī)（廣州吉迪儀器），生化培養(yǎng)箱（上海合恒儀器），氣浴振蕩器(常州潤(rùn)華電器)，實(shí)驗(yàn)室凈化工作臺(tái)（東莞佰鴻凈化設(shè)備BH-1000），迷你混合儀（拓赫MIXVR），磁力攪拌器（上海梅穎浦MYP11-2），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊BGZ-70），酶標(biāo)儀（HBS-1096A），分光光度計(jì)(南京菲勒儀器)，冰箱（海爾），三角瓶和培養(yǎng)皿等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)日糧

選用平均體質(zhì)量(36.17±2.24) kg的育肥母豬18頭，隨機(jī)分成3 組，每組6 個(gè)重復(fù)，各組間體質(zhì)量無較大差異（P>0.05）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組A 和2 個(gè)處理組（B和C），具體見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

其中，正常飼料所添加的ZEA 均為實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一采購(gòu)。A組飼料中，黃曲霉素、赤毒素和烷基苯酚均未檢出。B 組和C 組飼料中ZEA 含量為300 μg/kg，黃曲霉毒素、赤毒素和烷基苯酚均未檢出。

試驗(yàn)飼料按照美國(guó)國(guó)家科學(xué)研究委員會(huì)NRC[13]推薦配備?；A(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表2 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

每天打掃豬圈，分別在 10:00 和 16:00 飼喂，飼養(yǎng)期間，豬自由采食和飲水。

1.5 生產(chǎn)性能的測(cè)定

試驗(yàn)0、3、10、17 和24 d，每天早上母豬進(jìn)食前稱取每頭豬空腹體質(zhì)量，進(jìn)食后記錄每頭豬的采食量并觀察母豬精神與健康狀況。測(cè)定3組母豬的生長(zhǎng)性能指標(biāo)：平均日增質(zhì)量（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。隨時(shí)觀察豬只的活動(dòng)情況及進(jìn)食飲水狀況。

1.6 陰戶面積測(cè)定與計(jì)算

試驗(yàn)采用雷元培[11]的方法進(jìn)行計(jì)算，測(cè)定豬的陰戶面積（S，mm2）。

S=（π×a×b）/4，

式中，a為陰戶橫截面的長(zhǎng)度，mm；b為陰戶豎截面的長(zhǎng)度，mm。

母豬陰戶形狀如橢圓形，如圖1 所示。根據(jù)各組母豬陰戶面積大小評(píng)價(jià)陰戶是否正常與恢復(fù)情況。

圖1 豬外陰大小

1.7 屠宰試驗(yàn)

屠宰試驗(yàn)分別從3 個(gè)試驗(yàn)組中各選擇3 頭豬進(jìn)行屠宰。宰后分離出心臟、肝臟等組織器官并稱質(zhì)量。放入-20 ℃冰箱冷藏，為后續(xù)器官指數(shù)的計(jì)算與肝臟的殘留ZEA 做準(zhǔn)備。屠宰前對(duì)豬耳朵背部進(jìn)行靜脈采血，分離出血清，放入冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 器官指數(shù)的測(cè)定

器官指數(shù)=臟器鮮質(zhì)量/體質(zhì)量×100。

1.9 血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

在飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，采取育肥母豬前腔靜脈血液3 mL 于促凝管中，待吸出血清，分別測(cè)定促卵泡激素(FSH)、促黃體素(LH)、雌二醇(E2)和催乳素（PRL）含量，均采用定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。試劑盒選購(gòu)自南京建成生物工程研究所，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說明方法進(jìn)行。

1.10 肝臟中殘留ZEA的測(cè)定

將肝臟組織研磨取樣1.0 g，與5 mL 70%甲醇溶液進(jìn)行混合，放置于振蕩器中，進(jìn)行離心操作，取上清液并添加去離子水1 mL，以上步驟均按照Z(yǔ)EA測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0 對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)和血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用GLM 過程進(jìn)行方差分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同ZEA 含量飼料對(duì)育肥母豬生長(zhǎng)性能的影響

如表3 所示，24 d 的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，3 組豬的平均日增質(zhì)量、平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率差異較?。≒>0.05）。結(jié)果顯示當(dāng)飼料中ZEA 含量為300 μg/kg時(shí)對(duì)育肥母豬生長(zhǎng)性能沒有明顯影響。

2.2 益生菌對(duì)飼喂ZEA 污染日糧育肥母豬陰戶面積和器官指數(shù)的影響

由圖2 可見，喂養(yǎng)母豬前3 d 內(nèi)，3 組的育肥母豬陰戶面積沒有明顯差異（P＞0.05），處于正常狀態(tài)。試驗(yàn)進(jìn)行到第10 天時(shí)，3 組的陰戶面積差異顯著（P<0.05），與對(duì)照組A 組相比，B 組陰戶面積明顯增大，并伴隨著紅腫和炎癥癥狀。試驗(yàn)到第17 天，C 組中育肥母豬的陰戶面積逐漸恢復(fù)正常，而B 組育肥母豬的陰戶面積依然較大，且陰戶發(fā)炎發(fā)腫癥狀持續(xù)惡化。試驗(yàn)至24 d 時(shí)，3 組的陰戶面積仍然差異顯著（P<0.05），但C 組的母豬陰戶恢復(fù)至健康水平。

圖2 益生菌對(duì)母豬陰戶面積的影響

由表4 可知，3 組育肥母豬的心臟、肝臟、脾臟和腎臟器官指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），但是生殖器官指數(shù)差異顯著（P<0.05）。因?yàn)轱暳现泻幸嫔固幚斫MC 的生殖器官指數(shù)降低，改善了育肥母豬陰戶的癥狀，恢復(fù)至健康水平。

表4 益生菌對(duì)母豬器官指數(shù)的影響

2.3 血清學(xué)指標(biāo)分析

由表5 可知，3 組雜交育肥母豬血清中，促卵泡激素、促黃體素和雌二醇水平?jīng)]有顯著差異（P>0.05）。而B 組血清中催乳素水平差異顯著（P<0.05），由于C 組添加益生菌，可以維持血清中催乳素（PRL）值處于正常水平。

表5 益生菌對(duì)母豬血清學(xué)指標(biāo)的影響

2.4 肝臟中ZEA殘留量的分析

由于動(dòng)物機(jī)體自身對(duì)毒素的排解以及本試驗(yàn)加入ZEA 為300 μg/kg，ZEA 相對(duì)水平較低。經(jīng)過對(duì)肝臟中ZEA 殘留的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組均沒有檢測(cè)到ZEA的殘留。

3 討論

3.1 生長(zhǎng)性能及飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的變化

在飼料中添加ZEA 300.00 μg/kg 飼喂后，對(duì)育肥母豬的生長(zhǎng)發(fā)育沒有產(chǎn)生不利影響，與其他研究者結(jié)果相似。Liu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在母豬日糧內(nèi)分別添加86.19、300 μg/kg ZEA，結(jié)果顯示當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行到15 d 時(shí)，母豬的會(huì)陰部面積明顯增大，沒有對(duì)母豬的平均日增質(zhì)量（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）產(chǎn)生影響。Jiang等[15]在斷奶仔豬日糧中添加1 000 μg/kg ZEA 飼喂后，仔豬的生長(zhǎng)性能沒有明顯差異。并且Oliver等[16]研究發(fā)現(xiàn)青年母豬日糧中添加2 mg/kg ZEA 飼料后，各組母豬的生長(zhǎng)性能也沒有明顯差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼料中無論是否添加ZEA，皆對(duì)育肥母豬的日增質(zhì)量、日采食量、飼料轉(zhuǎn)化率的消化性能沒有明顯影響，原因可能是本試驗(yàn)飼料中添加ZEA 的濃度沒有過量，尚未對(duì)豬的生產(chǎn)性能造成不良影響。

3.2 母豬外陰面積與器官的指數(shù)變化

ZEA 是一種雌激素類真菌毒素，主要作用于雌性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，也對(duì)雄性動(dòng)物有一定程度影響。Jiang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中分別添加不同濃度的ZEA 純品，飼喂一段時(shí)間后，仔豬會(huì)出現(xiàn)明顯的陰戶腫大、發(fā)炎的癥狀，隨著ZEA 使用濃度增加，陰戶紅腫也會(huì)越加嚴(yán)重。據(jù)Andretta 等[17]研究，在28 d 飼養(yǎng)期內(nèi)，添加2 mg/kg 玉米赤霉烯酮的母豬的最終外陰體積比對(duì)照組大820%(P<0.05)，但沒有對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能造成影響。Teixeira 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，青春期前母豬飼喂含0.75 mg/kg ZEA 的日糧連續(xù)21 d，生殖道質(zhì)量、外陰面積、子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞高度及子宮黏膜高度均顯著增加(P<0.05）并出現(xiàn)外陰戶紅腫現(xiàn)象。Jiang 等[15]也發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬被飼喂含有1.1 mg/kg ZEA 的日糧后，經(jīng)20 d 飼喂，外陰戶面積與對(duì)照組相比有著較大差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B 組、C 組飼料中添加ZEA 300 μg/kg 飼喂后導(dǎo)致了母豬的陰戶面積增大，同時(shí)伴有發(fā)炎腫脹等癥狀。而在添加益生菌的C 組中，可以明顯改善母豬陰戶發(fā)炎、發(fā)腫的癥狀，減少陰戶面積的增加，使其恢復(fù)至健康狀態(tài)。

3.3 肝臟組織器官中ZEA殘留量的變化

王定發(fā)[19]在母豬日糧中分別添加500、2 000 μg/kg 的ZEA 日糧，其肝臟ZEA 殘留量分別為26.31、291.14 和1 352.06 μg/kg。隨著飼料中ZEA含量的增加，檢測(cè)到肝臟中ZEA 的殘留量增加明顯（P<0.05），但本試驗(yàn)卻在肝臟中沒有檢出ZEA，這可能是因?yàn)轱暳现衂EA的含量不高，本試驗(yàn)中ZEA最高為300 μg/kg，比王定發(fā)[19]添加ZEA 的最低濃度還要低。

3.4 血清學(xué)指標(biāo)的變化

由于ZEA 在結(jié)構(gòu)上與雌激素相似，與雌激素受體在母豬體內(nèi)結(jié)合后，可使雌激素發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生類雌激素相關(guān)作用，出現(xiàn)雌激素綜合癥狀。根據(jù)Zielonka 等[20]研究，2 種劑量ZEA（20 和40 μg/kg）均能夠使雌二醇和睪酮含量超出生理水平，并且高劑量ZEA 更易引起內(nèi)分泌紊亂。據(jù)王定發(fā)[19]報(bào)道，日糧中添加ZEA 能使仔豬血清指標(biāo)中的雌二醇和促黃體素與正常對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異（P<0.05），但是對(duì)促卵泡激素水平?jīng)]有顯著影響。同時(shí)，Jiang 等[15]報(bào)道，斷奶仔豬采食含有ZEA 飼料后，血清中雌二醇含量顯著降低（P<0.05）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，處理組B 采食含ZEA 的飼料會(huì)使血清中催乳素升高，但是對(duì)血清中其他指標(biāo)沒有顯著影響。而處理組C在飼料中添加益生菌后，血清中催乳素可恢復(fù)至健康水平。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加300 μg/kg ZEA后，育肥母豬在10 d 內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)陰戶面積增大現(xiàn)象。在飼料中添加0.2%益生菌后可以有效減輕母豬的外陰紅腫與陰戶面積增大現(xiàn)象，使母豬的生長(zhǎng)性能接近正常對(duì)照組水平，維持母豬血清中雌激素水平正常，對(duì)采食含有玉米赤霉烯酮日糧的育肥母豬有治療效果。