李曉宇，梁麗娜，高云，陳強(qiáng)，李佳豪，郭惠怡

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京 100040；2.中國中醫(yī)藥循證醫(yī)學(xué)中心眼科疾病項(xiàng)目組，北京 100040）

年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）是一種隨年齡增加而發(fā)病率上升并導(dǎo)致患者中心視力下降的疾病，臨床上分為“干性”和“濕性”兩種類型，其中濕性AMD 又稱作新生血管性AMD（nAMD），其主要病理特征是脈絡(luò)膜新生血管（CNV）[1]。由于新生血管的結(jié)構(gòu)與功能不健全，導(dǎo)致局部滲出、出血反復(fù)發(fā)作，繼而發(fā)生纖維化改變，最終導(dǎo)致瘢痕形成[2]?？寡軆?nèi)皮生長因子（VEGF）藥物是治療nAMD 的主流療法，可有效促進(jìn)CNV 的消退，但發(fā)生纖維化改變時(shí)，抗VEGF 藥物療效非常有限。有研究表明，黃斑區(qū)已出現(xiàn)纖維血管膜或盤狀瘢痕等眼底表現(xiàn)的患者，抗VEGF 藥物對視力提升幾乎沒有任何幫助[3]。明睛顆粒即涼血化瘀方，是國醫(yī)大師唐由之根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)針對nAMD 所創(chuàng)立，方中以蒲黃為君藥，配合二至丸、黃芪、枸杞子、丹參等藥物組成，以達(dá)滋陰養(yǎng)血、涼血化瘀之功效[4]。明睛顆粒前期臨床研究結(jié)果顯示：單純應(yīng)用涼血化瘀方治療nAMD，視力有一定程度的提升，視網(wǎng)膜中央厚度（CRT）降低，可穩(wěn)定眼底出血、滲出情況，是一種安全有效的治療方法[5-6]；明睛顆粒聯(lián)合抗VEGF 藥物治療，較單純應(yīng)用抗VEGF 藥物治療，視力、CRT、眼底出血滲出面積均見到顯著差異（P＜0.05）[7]。由以上臨床研究可以看出，明睛顆粒對nAMD 有一定療效，與抗VEGF 聯(lián)合治療效果更為顯著。聯(lián)合用藥是否可以抑制nAMD 纖維化過程，減少纖維血管膜生成，突破單純抗VEGF 治療的瓶頸是研究重點(diǎn)。據(jù)此，采用兩階段激光法誘導(dǎo)nAMD 纖維血管膜BN 大鼠模型，觀察明睛顆粒與抗VEGF 藥物聯(lián)合治療對病變以及纖維化相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步探討明睛顆粒的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級雄性BN 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量（160～180）g，購于北京維通利華公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006，使用許可證號：SYXK（京）2019-0049，常規(guī)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天，經(jīng)眼前節(jié)及眼底檢查無眼部病變可納入實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。飼養(yǎng)溫度18～25 ℃，濕度40%～70%，暴露于12 h 光/暗循環(huán)，自由飲食、水。

1.2 主要試劑與儀器 復(fù)方托吡卡胺滴眼液購自參天制藥（中國）有限公司（生產(chǎn)批號：MP2222）；10%熒光素鈉注射液購自Alcon 公司（生產(chǎn)批號：J0VJ5）；Davidson’s fixative 購自Phygene Biotechnology Co.Ltd 公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號：20220310）；AF488 偶聯(lián)同工凝集素B4 購自美國thermo fisher 公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號：2409033）；鹽酸氯胺酮注射液購自浙江九旭藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)批號：H20223609）；鹽酸賽拉嗪注射液購自敦化市圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司（生產(chǎn)批號：20211001）；兔抗Collagen 1 抗體購自美國Abcam 公司（生產(chǎn)批號：ab270993）；兔抗Fibronectin抗體購自美國Abcam 公司（生產(chǎn)批號：268020）；兔抗α-SMA 抗體購自美國Abcam 公司（生產(chǎn)批號：ab280888）；兔抗TGF-β1 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號：21898）；熒光二抗羊抗兔594 購自美國Abcam 公司（生產(chǎn)批號：ab150077）；DAPI 抗體購自武漢博士德生物工程有限公司（生產(chǎn)批號：AR1176）；RNeasy plus Universal Mini kits 購自德國QIAGEN 公司（生產(chǎn)批號：73404）；iScript cDNA Synthesis Kit 購自美國Bio-Rad 公司（生產(chǎn)批號：1708891）；iTaq Universal SYBR Green Supermix購自美國Bio-Rad 公司（生產(chǎn)批號：1725121）。

Novus Spectra DP 型Nd：YAG 倍頻激光治療機(jī)（美國Lumenis 公司）；OPTO-RIS 型視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)（英國Optoprobe Science LTD 公司）；Envisu R2210 型光學(xué)相干斷層掃描儀（德國Leica 公司）；LSM880 型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國ZEISS 公司）；7500 型RT-PCR 檢測儀（ABI 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 兩階段激光誘導(dǎo)大鼠nAMD 纖維血管膜模型建立 鹽酸氯胺酮-鹽酸賽拉嗪混合麻醉劑肌注（4 mL/kg）麻醉BN 大鼠，右眼單眼造模，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液局麻。第一階段激光：氪激光在后極部距視盤約2～3 個(gè)PD處眼底血管間光凝3、6、9 三個(gè)點(diǎn)位，設(shè)定參數(shù)：光斑直徑100 μm，曝光時(shí)間0.1 s，功率280 mW。激光聚焦后一槍擊破Bruch’s 膜，伴有氣泡產(chǎn)生為有效點(diǎn)，若無氣泡產(chǎn)生或傷及血管則為無效點(diǎn)。在第一階段激光后7 d，激光束瞄準(zhǔn)7 d 前建立的激光斑，參數(shù)設(shè)定與第一階段相同，進(jìn)行第二階段激光[8]。

2.2 分組與給藥 根據(jù)ARIFIN 提出的資源方程法進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣本量計(jì)算[9]，組間ANOVA 公式：n=DF/k+1，n 為每組動(dòng)物數(shù)量，k 為組數(shù)。取整得n=15，三組共45 只。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將45 只造模后的BN 大鼠隨機(jī)分為3 組：模型組、抗VEGF 藥物組（抗VEGF 組）、明睛顆粒聯(lián)合抗VEGF 藥物組（MJKL+抗VEGF 組）。模型組：予蒸餾水灌胃；抗VEGF 組：予玻璃體腔注射雷珠單抗注射液，鹽酸氯胺酮-鹽酸賽拉嗪混合麻醉劑肌注（4 mL/kg）麻醉大鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。一手固定大鼠頭部并用顯微鑷固定球結(jié)膜，另一手持微量注射器沿45°方向從眼球顳側(cè)角膜緣外約2 mm 處進(jìn)針，在瞳孔區(qū)看到針尖后，緩慢注射雷珠單抗5 μL/眼。注藥后等待10s 緩慢拔出針頭，以防止藥液外流。術(shù)后予左氧氟沙星眼膏涂眼。MJKL+抗VEGF 組：予玻璃體腔注射雷珠單抗注射液同上，同時(shí)予明睛顆粒灌胃，灌胃量1 g/mL/只/d。10 只正常BN 大鼠不造模，常規(guī)飼養(yǎng)作為對照。造模后1 d 開始給藥，連續(xù)給藥40 d。

2.3 眼底彩照（FP）、眼底血管熒光造影（FFA）活體觀察病變 麻醉大鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散大右眼瞳孔，使用OPTO-RIS 型視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)對大鼠眼底進(jìn)行拍照。再將光源轉(zhuǎn)換到Blue 通道，腹腔注射10%的熒光素鈉注射液0.15～0.2 mL，與顯微鏡鏡頭接觸并調(diào)至最佳拍照角度。拍照完成后用氯化鈉注射液沖洗雙眼，用氧氟沙星眼膏點(diǎn)眼以預(yù)防感染。通過Image J 對病變面積與光密度值（MD）進(jìn)行測量。

2.4 光學(xué)相干斷層掃描（OCT）活體觀察病變局部高度 打開Envisu R2210 型光學(xué)相干斷層掃描儀，將麻醉且瞳孔散大狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)鼠放于鼠臺，雙眼角膜保持濕潤，通過輕微挪動(dòng)鼠臺位置與調(diào)節(jié)旋鈕，使成像清晰。通過Bioptigen Diver 圖像處理軟件與Image J 軟件對病變高度進(jìn)行測量。

2.5 HE 染色觀察 予過量復(fù)合麻醉劑處死BN 大鼠，快速剪斷視神經(jīng)后取出眼球，固定液中固定后放于石蠟包埋盒，放入全自動(dòng)組織脫水機(jī)進(jìn)行脫水，將完成脫水的組織裝于已標(biāo)記好的包埋盒中浸入60 ℃石蠟完成包埋。將蠟塊進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，展片烤片后進(jìn)行HE 染色，室溫晾干后可光學(xué)顯微鏡下觀察各組視網(wǎng)膜病理改變。

2.6 視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）-脈絡(luò)膜-鞏膜鋪片 取材后全眼球置于4%多聚甲醛液中固定24 h 后去除眼前節(jié)，再將眼杯置于4%多聚甲醛液中固定1 h，取出眼杯并做4 個(gè)放射狀切口，用顯微鑷小心去除視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，確認(rèn)RPE-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體可完全鋪展；將脈絡(luò)膜鋪片置于裝有0.25%Triton溶液的24 孔板，加入2%BSA，加入IB4 凝集素，避光4 ℃孵育24 h。將脈絡(luò)膜鋪片鋪展于載玻片上，滴入抗熒光衰減封片劑后封上蓋玻片，4℃避光保存，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.7 免疫熒光染色分析 在（-23±2）℃下行垂直視網(wǎng)膜的8 μm 冰凍切片，室溫風(fēng)干后放于-20 ℃冰箱。從-20 ℃取出切片，置于57 ℃恒溫箱中烤片30 min。滴加1%TritonX-100 溶液，快速滴加2%BSA，加入一抗（Collagen-1，F(xiàn)ibronectin，α-SMA，TGF-β1），加入二抗，加DAPI 溶液，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況。

2.8 qRT-PCR 采用TRIzol 提取試劑盒提取每組視網(wǎng)膜組織的總RNA，并對RNA 濃度進(jìn)行測定。根據(jù)iScript cDNA Synthesis Kit 試劑盒的相關(guān)說明將RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板。由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成引物，引物序列見表1。以GAPDH 為內(nèi)參基因，擴(kuò)增完成后采用PCR 儀自動(dòng)分析軟件進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，用比較Ct 法對各組Collagen-1 mRNA，F(xiàn)ibronectin mRNA，α-SMA mRNA和TGF-β1 mRNA 的表達(dá)量進(jìn)行分析測定。

表1 Primer sequences of qRT-PCR

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與圖表制作。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料選取單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間的比較，采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；選取t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的比較。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 nAMD 纖維血管膜模型的建立 FP 結(jié)果顯示氪激光光凝致使Bruch’s 膜破裂，光凝部位呈灰白色水腫，第一階段激光光凝后，光斑處未見出血；7 d后行第二階段激光，光凝部位呈灰白色水腫，部分光斑處可見到出血。FFA 與OCT 結(jié)果顯示：第二階段激光后40 d，纖維血管膜生成。見圖1。

圖1 模型的建立

3.2 明睛顆粒聯(lián)合雷珠單抗對纖維血管膜滲漏情況的影響 模型組病變滲出面積與MD 值均較正常組顯著升高（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組滲出面積與MD 值較模型組顯著降低（P＜0.05）。MJKL+抗VEGF 組MD 值較抗VEGF 組顯著降低（P＜0.05），但滲出面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 病變滲漏情況

3.3 明睛顆粒聯(lián)合雷珠單抗對纖維血管膜病變高度的影響 模型組病變局部高度值均較正常組顯著升高（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組較模型組顯著降低（P＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組較抗VEGF 組顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 病變高度情況

3.4 明睛顆粒聯(lián)合雷珠單抗對視網(wǎng)膜病理組織改變的影響 H&E 染色結(jié)果示：正常組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整，排列清晰有序；模型組造模后40 d，光斑處視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層水腫隆起、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂、纖維血管膜形成最為明顯；抗VEGF 組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組明顯減輕；MJKL+抗VEGF 組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷程度最輕。見圖4。

3.5 明睛顆粒聯(lián)合雷珠單抗對病變面積的影響 脈絡(luò)膜鋪片結(jié)果顯示：正常組未見病變，模型組病變面積較正常組顯著增大（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組較模型組顯著減少（P＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組較抗VEGF 組顯著減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 脈絡(luò)膜鋪片顯示病變面積

3.6 明睛顆粒聯(lián)合雷珠單抗對蛋白表達(dá)的影響 Collagen-1、Fibronectin、TGF-β1 熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示：模型組均顯著高于正常組（P＜0.05）；抗VEGF組、MJKL+抗VEGF 組顯著低于模型組（P＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組較抗VEGF 組顯著降低（P＜0.05）。α-SMA 熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示：模型組顯著高于正常組（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組顯著低于模型組（P＜0.05）；但MJKL+抗VEGF 組與抗VEGF組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖6 免疫熒光顯示Collagen-1、Fibronectin、α-SMA、TGF-β1 表達(dá)

3.7 明睛顆粒聯(lián)合雷珠單抗對mRNA 相對表達(dá)量的影響 Collagen-1 mRNA、Fibronectin mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA 相對表達(dá)量結(jié)果顯示：模型組均顯著高于正常組（P＜0.05）；抗VEGF 組、MJKL+抗VEGF 組顯著低于模型組（P ＜0.05）；MJKL+抗VEGF 組顯著低于抗VEGF 組（P＜0.05）。見圖8。

圖8 qRT-PCR 顯示Collagen-1 mRNA、Fibronectin mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA 相對表達(dá)量

4 討論

新生血管的管壁結(jié)構(gòu)畸形脆弱，容易導(dǎo)致滲漏與出血，這種管壁的破壞與引發(fā)的局部炎癥可釋放基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞，從而促使新生血管內(nèi)皮束向纖維血管膜的轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)化過程被稱作“血管纖維化轉(zhuǎn)換”[10]。在血管纖維化轉(zhuǎn)換過程中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和部分巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致纖維化成分占據(jù)病變的主導(dǎo)地位。CNV 的纖維化改變雖然可以對滲出起到一定限制發(fā)展的作用，但過度纖維化最終會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜下瘢痕形成，以至于永久性的黃斑形態(tài)改變和視力喪失[11]。臨床上，nAMD 黃斑區(qū)纖維血管膜的改變表現(xiàn)為視網(wǎng)膜內(nèi)或視網(wǎng)膜下的黃白色隆起區(qū)域，邊界較為清楚，通常含有血管組織，其形成、發(fā)展過程與成纖維細(xì)胞、細(xì)胞生長因子及細(xì)胞外基質(zhì)的共同作用有關(guān)。為了剖析繼發(fā)于nAMD 的視網(wǎng)膜下纖維化的機(jī)制，首先要建立合適的動(dòng)物模型。本研究在傳統(tǒng)一次激光建立CNV 模型的基礎(chǔ)上[12]，改進(jìn)為通過兩階段的激光灼傷以誘導(dǎo)滲漏或出血，相較于傳統(tǒng)的激光造模法，兩階段激光使病灶面積更大，持續(xù)時(shí)間長，且具有高水平的纖連蛋白表達(dá)。在第二階段激光造模后40d，F(xiàn)P 可見邊界清晰的灰黃色改變，伴有出血、滲出及水腫，OCT 示中高反射，組織病理學(xué)可見纖維化改變且病變處可檢測到纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，與nAMD 纖維血管膜改變相符。該模型的建立，更加適合于研究黃斑纖維化的發(fā)病機(jī)制和評價(jià)抗nAMD 的治療藥物[10]。

隨著抗VEGF 藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，抗VEGF藥物雖然可以在短期內(nèi)快速控制并改善病情，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗VEGF 藥物治療后期可出現(xiàn)纖維化改變，嚴(yán)重影響患者視力。Heier 等[13]予nAMD 患者每月1 次玻璃體腔注射雷珠單抗，連續(xù)給藥24 月，隨訪2～6 年后發(fā)現(xiàn)，過半的患者出現(xiàn)了黃斑區(qū)纖維化。Roman 等[14]發(fā)現(xiàn)nAMD 患者接受貝伐單抗治療后發(fā)生了RPE 撕裂現(xiàn)象，認(rèn)為與血管的纖維化有關(guān)。此外，Hwang 等[15]報(bào)道了黃斑區(qū)沒有明顯出血的患者在接受抗VEGF 藥物治療后也發(fā)生了嚴(yán)重的黃斑部纖維化病變，由此說明纖維化改變并非出血引起，而應(yīng)用抗纖維化療法可能對患者后期視力有益。nAMD 纖維血管膜在中醫(yī)病名中并無記載，根據(jù)其癥狀，可歸為“視瞻昏渺”“視直如曲”“暴盲”等范疇。本病與年老體弱有關(guān)，以虛為本，因虛致病，虛實(shí)夾雜。與陽明脈衰、生化乏源，天癸竭、天真衰，筋不動(dòng)、肝氣衰等病機(jī)有關(guān)[16]。國醫(yī)大師唐由之根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為nAMD 的基本病機(jī)為肝腎陰虛為本，虛火灼絡(luò)為標(biāo)，臨床診療nAMD 應(yīng)以涼血化瘀為主要治法，創(chuàng)立涼血化瘀方（即明睛顆粒），在提升視力，改善眼底出血、滲出情況，均起到一定作用[17-18]。在抗VEGF 藥物的基礎(chǔ)上聯(lián)合明睛顆粒的治療方案，或可提升抗VEGF 藥物的療效范圍與作用時(shí)間，中西醫(yī)結(jié)合治療方案或許是當(dāng)下nAMD 后期纖維化改變的突破點(diǎn)。

多種細(xì)胞因子及蛋白參與了纖維化過程，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、1 型膠原蛋白（Collagen-1）及纖維連接蛋白（FN）等[19-20]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化的作用，是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成并抑制其降解的主要介質(zhì)，在纖維形成過程中起主導(dǎo)作用。TGF-β1 是纖維化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以激活下游的Smad 信號，從而促進(jìn)新生血管生成、成纖維細(xì)胞增生、肌成纖維細(xì)胞分化、基質(zhì)沉積、膠原合成等病理過程，引起組織發(fā)生纖維化改變。Gian 等[21]研究發(fā)現(xiàn)nAMD 患者中TGF-β1 持續(xù)升高，表明TGF-β1 參與了nAMD，且TGF-β1 的作用與VEGFA 無關(guān)。Collagen-1（Ⅰ型膠原）是軟組織纖維化的最終效應(yīng)分子。在Col1α1-GFP 小鼠中，脈絡(luò)膜血管系統(tǒng)中的部分周細(xì)胞被GFP 標(biāo)記，用作譜系示蹤劑來研究周細(xì)胞在視網(wǎng)膜下纖維化中的作用，結(jié)果顯示將脈絡(luò)膜血管周圍生態(tài)位確定為光凝后視網(wǎng)膜下纖維化的新來源。在TGF-β1 高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，Collagen-1 基因表達(dá)上調(diào)，組織纖維化改變更為明顯。因此，通過調(diào)控TGF-β1 的表達(dá)來抑制Collagen-1 的過度形成從而減少組織纖維化形成值得進(jìn)一步探索與研究。此外，成年哺乳動(dòng)物含有大量間質(zhì)及血管周圍的成纖維細(xì)胞，它們能夠轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而表達(dá)收縮性蛋白，如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）。纖維連接蛋白（FN）廣泛存在于動(dòng)物組織和組織液中，有研究表明，纖維化組織中成纖維細(xì)胞表面FN 呈過度表達(dá)狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與單純抗VEGF 組相比，MJKL+抗VEGF 組在病變滲出強(qiáng)度、病變面積、病變高度等方面改善程度更為顯著，從形態(tài)學(xué)及組織病理學(xué)方面顯示出聯(lián)合治療的優(yōu)勢。而從纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)分析來看，MJKL+抗VEGF 組Collagen-1、Fibronectin、TGF-β1、α-SMA 因子的熒光強(qiáng)度和mRNA 相對表達(dá)量亦均低于抗VEGF 組。由此可見，明睛顆粒聯(lián)合抗VEGF 藥物，較單純應(yīng)用抗VEGF 藥物能更好地抑制實(shí)驗(yàn)性nAMD 纖維血管膜生長。此外，課題組同期進(jìn)行了明睛顆粒治療nAMD的前瞻性、隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對照、多中心的臨床研究，結(jié)果顯示在最佳矯正視力、黃斑出血面積與滲出面積中均可見到明睛顆粒聯(lián)合抗VEGF藥物組優(yōu)于單純應(yīng)用抗VEGF 組，且隨訪1 年時(shí)聯(lián)合用藥組纖維化發(fā)生率為25%，而單純應(yīng)用抗VEGF 組為31.43%，與本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上，本研究通過對兩階段激光建立實(shí)驗(yàn)性nAMD 纖維血管膜模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)明睛顆粒聯(lián)合抗VEGF 藥物較單一應(yīng)用抗VEGF 藥物，在降低TGF-β1、Collagen-1、Fibronectin、α-SMA 纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)及抑制纖維血管膜病變中顯示出更強(qiáng)的作用，提示明睛顆?？赡芡ㄟ^降低纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，對nAMD 后期纖維化改變起到一定的抑制作用。本結(jié)果為明睛顆粒在nAMD 中晚期的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，亦為中藥聯(lián)合抗VEGF 藥物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。