鄧述歡，黃少媛，張棟武

（1·佛山市順德區(qū)樂從醫(yī)院，廣東 佛山 528315；2·佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院，廣東 佛山 528500）

富血小板血漿（Platelet-Rich Plasma，PRP）是一種通過離心自體外周血獲得的血小板濃縮物[1]。研究已證實(shí) PRP 激活后，血小板中的 α 顆?？舍尫臥DGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多種生長因子[2-3]。PRP具有促進(jìn)組織修復(fù)的作用，且來源于自體，具有無排斥反應(yīng)和來源便捷等優(yōu)勢，臨床上已廣泛用于骨不連、慢性肌腱損傷、慢性創(chuàng)面、關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病的治療[4-7]。目前，臨床上使用的 PRP 制備套裝主要采用二次離心法和一次離心法。血小板回收率是用于比較制備方法優(yōu)劣的指標(biāo)，有學(xué)者[8]用血小板回收率對(duì)4 種不同參數(shù)的PRP 制備方法進(jìn)行了比較，分析方法的優(yōu)劣，并提出了改良方法。傳統(tǒng)的血小板回收率計(jì)算公式為：血小板回收率=（PRP 體積×PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；用此方法計(jì)算的血小板回收率均較低，在 46·9%左右[9-12]。此方法計(jì)算血小板回收率受較多因素的影響，特別是受人為因素的影響較大,進(jìn)而影響PRP在臨床中的治療效果，使得PRP 在臨床治療中的推廣受限[13-15]。在制備PRP 時(shí)因血小板在中高速離心后多聚集在管底部，且有聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，操作者通常用吸管吹打數(shù)次后取100 μL 移于PVC 管用于計(jì)數(shù)，吹打次數(shù)不夠，血小板未充分懸浮，可導(dǎo)致計(jì)數(shù)偏低。其次因?yàn)镻RP 的血小板濃度是基數(shù)血小板的數(shù)倍，而儀器計(jì)數(shù)有線性范圍，有學(xué)者通過對(duì)某款儀器進(jìn)行性能分析發(fā)現(xiàn)，其線性范圍為( 0 ～977)×109/L, 而PRP的血小板濃度常有超過這一范圍的情況，所以易導(dǎo)致誤差。本研究通過對(duì)貧血小板血漿（Platelet-Poor Plasma,PPP）的血小板計(jì)數(shù)，用差值計(jì)數(shù)法得到PRP的真實(shí)濃度，再用血小板回收率的計(jì)算公式計(jì)算回收率。該方法不受上述因素影響，準(zhǔn)確度可提高。研究表明，PPP 計(jì)數(shù)法的回收率明顯高于PRP 計(jì)數(shù)法的回收率，且其方法簡單不需要額外的儀器，只要有血球分析儀的實(shí)驗(yàn)室都可開展，是值得推廣的方法。

1 材料與方法

1·1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇標(biāo)準(zhǔn)

取 68 例成年健康志愿者的外周血（6 支 9mL/例）。其中男39 例，女29 例；年齡18 ～68 歲，平均42·6 歲。研究納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中華人民共和國獻(xiàn)血法》和中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《獻(xiàn)血體格檢查標(biāo)準(zhǔn)》相關(guān)要求的健康人群，血紅蛋白：男性≥120 g/L，女性≥ 110 g/L；血小板計(jì)數(shù)≥100×109/L［正常值（100 ～300）×109/L］。（2）采血前7 d 內(nèi)未服用影響血小板功能和凝血系統(tǒng)的藥物。（3）無臨床可見的肝腎功能性疾病、傳染性疾病、相關(guān)血液疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病及感染等，依從性好且愿意配合進(jìn)行相關(guān)檢測及隨訪，資料齊全。 研究排除標(biāo)準(zhǔn)：在納入標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上將依從性差，或有其他不適宜做此項(xiàng)研究之基礎(chǔ)疾病如血小板減少等的患者、資料不全或失聯(lián)者均排除在本次研究項(xiàng)目之外。本研究之目的、預(yù)期結(jié)果及潛在風(fēng)險(xiǎn)經(jīng)過本單位道德倫理委員會(huì)討論認(rèn)定符合道德倫理標(biāo)準(zhǔn)要求（樂從醫(yī)倫字20220124）。

1·2 主要試劑與儀器

枸櫞酸鈉抗凝管（廣州陽普醫(yī)療器械有限公司，10 mL/支）；一次性使用采血針（廣州陽普醫(yī)療器械有限公司）；生物安全柜（山東濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、離心機(jī)（山東百歐醫(yī)療科技有限公司，TDL-500C 型）、全自動(dòng)血液分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BC5390CRP）。

1·3 PRP 制備方法

方法：（1）用9 mL 的枸櫞酸鈉一次性采血管抽血6 支（用于制備PRP），用2 mL 的枸櫞酸鈉一次性采血管抽血1 支（用于PLT 計(jì)數(shù)）。（2）將6 支血樣放入離心機(jī)第一次離心（參數(shù)160g、20 min，升9 降9），離心后取血漿放入潔凈離心管，對(duì)收取的離心管內(nèi)血漿（PPP 血漿）進(jìn)行充分混勻，并記錄體積，取100 μL 混勻的血漿放入PVC 管進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。（3）對(duì)混勻的血漿進(jìn)行第二次離心（離心參數(shù)：460g、15 min，升9 降9）。（4）第二次離心后，留下管底的2 mL富血小板血漿（PRP管），用吸管把上層的泛血小板血漿吸到另一支一次性離心管（PPP 管）中。充分混勻PRP 管并取100 μL 置于PVC 管中進(jìn)行PLT 計(jì)數(shù)，得到數(shù)據(jù)組（PRP 血漿直接PLT 計(jì)數(shù)組）；充分混勻PPP管并取100 μL置于PVC管中進(jìn)行PLT計(jì)數(shù)，得到數(shù)據(jù)組（PPP 血漿PLT 計(jì)數(shù)組）。

1·4 數(shù)據(jù)收集及計(jì)算血小板回收率

用兩組數(shù)據(jù)及相應(yīng)的方法計(jì)算其相應(yīng)的血小板回收率。分別為傳統(tǒng)方法計(jì)算的血小板回收率（公式1）：血小板回收率=（PRP 體積×PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；改良法計(jì)算的血小板回收率（公式2）∶血小板回收率=(第一次離心后的血漿血小板計(jì)數(shù)×第一次離心后血漿的體積-PPP 的血小板計(jì)數(shù)×PPP 的體積)/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%。

1·5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)所有結(jié)果采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

用PRP 直接計(jì)數(shù)的血小板回收率，平均回收率為66·8%，最高回收率為95·7%，最低回收率為21·5%；PPP 直接計(jì)數(shù)的血小板回收率，平均回收率為75·9%，最高回收率為98·8%，最低回收率為35·7%。PPP 直接計(jì)數(shù)的血小板回收率顯著高于PRP 直接計(jì)數(shù)的血小板回收率，P＜0·05。見圖1。

圖1 血小板回收率比較

3 討論

PRP是一種自身血液經(jīng)過離心去除紅細(xì)胞而得來的濃縮血小板血漿，盡管被醫(yī)療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但不少文獻(xiàn)認(rèn)為PRP 在某些領(lǐng)域并不適用。目前，PRP 在慢性腱鞘炎、骨關(guān)節(jié)炎治療、醫(yī)美領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在整形外科領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸被重視，但是應(yīng)用效果卻不盡相同，爭議眾多，其根本原因在于PRP 制作最終質(zhì)量不同[2,6,10]。看似是簡單的制作流程，但由于缺乏普遍認(rèn)可的PRP 制作質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，多種因素（尤其是制作人操作水平、離心次數(shù)、離心機(jī)參數(shù)等因素）均可造成血小板回收率的較大差異，導(dǎo)致成品PRP 質(zhì)量參差不齊，進(jìn)而導(dǎo)致應(yīng)用效果及臨床作用不盡相同。PRP 作為一種高濃度血小板濃縮物被應(yīng)用于臨床由來已久，尤其是在慢性損傷修復(fù)、運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)、燒燙傷創(chuàng)面修復(fù)方面功效明顯；因血小板中富含生長因子、細(xì)胞因子和抗菌肽等多種生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、基質(zhì)合成、組織再生與修復(fù)等作用，而被臨床所重視，因此近來在臨床多個(gè)領(lǐng)域被廣為推崇，但由于PRP 制備方法受到人員素質(zhì)、設(shè)備性能、計(jì)算方式等諸多因素制約，導(dǎo)致PRP 質(zhì)量參差不齊，隨著行內(nèi)專家共識(shí)指導(dǎo)性文件[1]的出現(xiàn)，這一現(xiàn)象得到改觀。由于PRP 制備方法大多以一次離心法、二次離心法及三次離心法等手工法為主，導(dǎo)致血小板回收率參差不齊（從21·5%～98·8%不等），但二次離心法或三次離心法血小板回收率顯著高于一次離心法，Harriso 等[5]通過對(duì)6 種離心所得的PRP 分析發(fā)現(xiàn)，血小板回收率差異較大，其總體回收率介于（53±18）%至（72±13）%之間，血小板計(jì)數(shù)值介于（568～1062）×109/L之間，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞比容等有形成分也各不相同，提示不同離心力參數(shù)制備的PRP 質(zhì)量差異較大；有學(xué)者[7-10]采用不同離心參數(shù)及全血規(guī)格制備了PRP，比較了血小板回收率和純度，結(jié)果表明：三次離心法制備的PRP 純度較高，但血小板回收率偏低，不適合用于醫(yī)美或其他慢性修復(fù)，只適合制備冰凍血小板等。還有研究發(fā)現(xiàn)[11-13]：采用不同離心力參數(shù)離心法（先1000 g 離心10 min，再1500 g 離心15 min）制備所得的 PRP 血小板回收率最高，值得推廣；但有學(xué)者提出了不同看法[14-16]，認(rèn)為這種方法跟分步離心法并無不同，且血小板回收率未見提升。

為提高PRP 制作水平，獲得穩(wěn)定的、純度較高的、血小板回收率符合要求的PRP，在總結(jié)各類普遍使用的PRP 制作方法之基礎(chǔ)上，本文作者采用二次離心法制備PRP，通過先制備PPP，而后再將PPP 第二次離心取得PRP，結(jié)果顯示：血小板回收率顯著高于一次離心獲得的PRP，血小板回收率符合要求，取得滿意效果；PRP 含有數(shù)倍于血小板生理濃度的血小板濃縮物，研究認(rèn)為，PRP 中的血小板計(jì)數(shù)達(dá)到全血3 ～6 倍以上才能起到治療作用[16-17]。有學(xué)者在研究后認(rèn)為，衡量PRP 成品質(zhì)量的指標(biāo)主要是血小板富集系數(shù)和回收率[18-20]。所以在實(shí)際工作中如何把回收率計(jì)算準(zhǔn)確是亟待解決的問題。直接行PLT 計(jì)數(shù)的影響因素較多，具體包括：操作人員在工作中的操作會(huì)影響PLT 的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度，如操作人員吹打的時(shí)間和力度不同；因PRP 中PLT 的濃度不同，PLT離心會(huì)聚成塊狀，同樣的力度吹打，血小板散開的程度不同，吹打后涂片用顯微鏡觀察通常會(huì)有肉眼無法觀察到的小凝塊；血細(xì)胞分析儀的分析原理主要是電容型、電阻抗型、激光型、光電型、聯(lián)合檢測型、干式離心分層型和無創(chuàng)型，不管是哪一種類型都無法區(qū)分聚集的血小板小塊，再者血細(xì)胞分析儀的檢測能力都有一個(gè)線性范圍，超過線性范圍的PLT 濃度的標(biāo)品就會(huì)失真。本研究采用分步離心法先取得PPP，再將PPP 離心取得PRP，較好地解決了血小板回收率不足等問題，值得臨床推廣。

現(xiàn)在一般的血細(xì)胞分析儀的PLT 計(jì)數(shù)線性范圍在（0 ～1000）×109/L，采用PRP 制品直接行PLT 計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性值得懷疑。用傳統(tǒng)的血小板回收率的計(jì)算公式算出的回收率其準(zhǔn)確性必然大打折扣。血小板數(shù)值直接與臨床治療效果相關(guān)聯(lián)[4,8-9,16]，因此，制備出高質(zhì)量的PRP 意義重大。但是，制備PRP 受諸多因素制約，如環(huán)境溫度、操作者技術(shù)水平、離心次數(shù)等等，所以，PRP 制備好后的PLT 計(jì)數(shù)就顯得非常重要；本研究用改良方法計(jì)算的血小板回收率，其公式用到的兩個(gè)PLT 計(jì)數(shù)都不會(huì)超出線性范圍，計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性是有保障的，第一次離心的計(jì)數(shù)，因是低速離心，取血漿的PLT 計(jì)數(shù)通常是原血血小板計(jì)數(shù)的一倍左右，涂片鏡檢也沒發(fā)現(xiàn)有聚集現(xiàn)象。PPP 的血小板計(jì)數(shù)通常在100×109/L 左右,在儀器的線性范圍內(nèi),其計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性也有保障。所以改良法血小板回收率計(jì)算公式的各變量都能準(zhǔn)確測得，其計(jì)算所得的回收率是準(zhǔn)確可靠的。從上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，改良法計(jì)算的回收率的平均值是84%，而傳統(tǒng)法計(jì)算的回收率平均值是72%，高出12%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0·05）。改良法回收率的計(jì)算不需要測PRP 的血小板計(jì)數(shù)，所以在制作PRP 時(shí)就不用取部分PRP 血漿用來計(jì)數(shù)，從而減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)，提高了PRP 血漿質(zhì)量，尤其在侵入性方式使用PRP 的醫(yī)美領(lǐng)域或慢性損傷性修復(fù)領(lǐng)域，防止污染PRP 進(jìn)入人體是影響修復(fù)是否達(dá)到預(yù)期的關(guān)鍵因素[17-20]，值得臨床重視。

綜上所述，本研究采用的改良法制備的PRP 成品，血小板回收率比傳統(tǒng)法明顯更優(yōu)，血液其他有形成分計(jì)數(shù)與傳統(tǒng)方法比較未見明顯差異，且減少了PRP 被污染的風(fēng)險(xiǎn)，血小板計(jì)數(shù)值符合醫(yī)美、慢性炎癥修復(fù)之臨床應(yīng)用要求，值得推廣。本研究存在的不足之處在于：試驗(yàn)樣本量不足，導(dǎo)致PRP 質(zhì)量評(píng)價(jià)缺乏大數(shù)據(jù)支撐。關(guān)于PRP 制備方法、離心參數(shù)、質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系文件的建立，依然需要臨床同行繼續(xù)努力，這也是本研究組成員今后努力之方向。