姚雨樺，康佳木，陳小雪，薛巖松*，韓北忠

（中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

發(fā)酵食品由于原料類型、生產(chǎn)工藝和微生物組成等造就了其多樣性和獨特性。發(fā)酵微生物在利用食品原料生長、繁殖和代謝的過程中產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，賦予發(fā)酵食品獨特的風味和營養(yǎng)價值。中國有著悠久的食用發(fā)酵食品的歷史，擁有獨特的發(fā)酵食品種類，誕生了眾多諸如白酒、豆豉、豆醬、醬油、腐乳等有特色的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。在發(fā)酵過程中，蘊藏著豐富多樣的微生物群落，它們對發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值、感官體驗和品質(zhì)起到?jīng)Q定性的作用，對于保證發(fā)酵食品的品質(zhì)至關(guān)重要。發(fā)酵是一個動態(tài)變化的微生態(tài)環(huán)境體系，在發(fā)酵過程的不同階段，微生物的多樣性受到環(huán)境因素如營養(yǎng)狀態(tài)、溫度、濕度、pH等理化性質(zhì)的影響發(fā)生顯著的變化；同時也受到其他不同微生物種群間的作用，極大地影響微生物物種的生長、繁殖和演替。

噬菌體是一類可以感染細菌、放線菌、真菌和藻類等從原核生物到真核生物的所有生命形式的病毒總稱，是病毒中最為普遍和分布最廣的微生物群體[1]。噬菌體的結(jié)構(gòu)非常簡單，通常由單鏈或雙鏈核酸以及保護核酸的蛋白質(zhì)或脂蛋白衣殼組成。根據(jù)其溶原性，噬菌體又可以分為烈性噬菌體和溫和噬菌體。烈性噬菌體通過粘附將核酸注入宿主細胞內(nèi)，利用宿主提供的養(yǎng)分和能量，轉(zhuǎn)錄和翻譯自身的噬菌體結(jié)構(gòu)，最終裂解宿主完成釋放[2]。溫和噬菌體是將自己的遺傳物質(zhì)整合至宿主基因組，成為原噬菌體并處于休眠狀態(tài)，通過宿主繁殖可以將自己的遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的傳遞給后代，一般不會造成宿主的破壞。但當環(huán)境發(fā)生劇烈變化或受到應(yīng)激刺激時，前噬菌體會脫離宿主染色體，從而獨立復(fù)制轉(zhuǎn)變成烈性噬菌體[2]。

噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境中，具有調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)的作用。噬菌體與其他微生物的相互作用對微生物進化有著重要意義，其對微生物生態(tài)環(huán)境的塑造至關(guān)重要[3]。一方面，噬菌體可以直接調(diào)節(jié)細菌種群，影響宿主菌的代謝機制從而影響整個群落結(jié)構(gòu)；另一方面，噬菌體介導(dǎo)的細菌裂解可為其他微生物提供物質(zhì)基礎(chǔ)，間接支持和促進其他微生物的生長和繁殖。此外，噬菌體還可驅(qū)動細菌進化，從而提高宿主的適應(yīng)性[4-5]。發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程受到周圍環(huán)境等微生態(tài)的影響，一些自然環(huán)境中的噬菌體跟隨發(fā)酵微生物被引入發(fā)酵體系，為其繁殖和發(fā)育提供了豐富的媒介。目前，噬菌體已在多種發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程中被發(fā)現(xiàn)和分離，其宿主大多為發(fā)酵主要功能菌或腐敗菌、致病菌等。有大量的研究表明，噬菌體會對發(fā)酵過程產(chǎn)生危害[5]。發(fā)酵主要功能菌噬菌體的存在通常會抑制宿主菌的正常生長或使宿主菌大量裂解，導(dǎo)致發(fā)酵異常甚至失敗。此外，噬菌體能夠特異性裂解致病菌或產(chǎn)生不良風味的菌，對發(fā)酵產(chǎn)生有利的影響，從而達到良好的生物防治效果[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵菌噬菌體的某些序列能夠幫助宿主菌自溶，釋放胞內(nèi)酶，改善發(fā)酵食品風味[16]。此外，通過對噬菌體的不敏感宿主進行篩選，可以在一定程度上避免發(fā)酵失敗[9]，還可影響微生物群落演替，起到幫助推進發(fā)酵過程的作用[20，29]。

本文總結(jié)了目前不同類型的發(fā)酵食品中噬菌體的產(chǎn)生和功能，闡述了噬菌體在發(fā)酵生產(chǎn)中的危害、影響及應(yīng)用，討論了在發(fā)酵食品中檢測噬菌體的方法，以期更加全面了解噬菌體在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的功能和作用，為更好的控制發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 食品發(fā)酵過程中噬菌體的產(chǎn)生及功能

目前在食品發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)噬菌體的名稱、分類、宿主及功能見表1。1935年，噬菌體首次被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)е鹿I(yè)生產(chǎn)的乳制品發(fā)酵失敗[32]，此后，噬菌體在發(fā)酵香腸、發(fā)酵豆制品、泡菜等多種發(fā)酵食品中均被發(fā)現(xiàn)能夠特異性感染和裂解發(fā)酵微生物[22，33-34]，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量降低甚至發(fā)酵失敗，從而給發(fā)酵工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。在干酪的生產(chǎn)過程中，大多數(shù)分離得到的噬菌體為乳酸菌噬菌體，例如長尾病毒科（Siphoviridae）和絲桿狀病毒科（Inoviridae）噬菌體特異性感染費氏檸檬酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii），造成干酪發(fā)酵失敗[35]。在葡萄酒的生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)了15種乳酸菌噬菌體，能夠裂解蘋果酸乳酸發(fā)酵菌—酒類酒球菌（Oenococcus oeni），導(dǎo)致葡萄酒香氣、色澤異常[23]。在納豆的生產(chǎn)過程中，枯草芽孢桿菌噬菌體是導(dǎo)致γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，PGA）合成失敗的重要因素，極大的降低了納豆品質(zhì)[8]。LU Z等[19，22]對德國酸菜和黃瓜發(fā)酵過程中的微生物體系進行了研究，對其中的優(yōu)勢乳酸菌噬菌體進行了分離和篩選。類似的，PARK E J等[36]對泡菜、德國酸菜等發(fā)酵蔬菜食品進行宏病毒組學分析，發(fā)現(xiàn)噬菌體是發(fā)酵食品中病毒的主要組成群體，盡管這些研究已經(jīng)從發(fā)酵食品中分離出若干類型的噬菌體，但還未對其進行分析和注釋，特別是噬菌體在發(fā)酵過程中的作用還未明確。在我國，食品發(fā)酵工業(yè)中同樣發(fā)現(xiàn)了噬菌體[37]，尤其是乳制品生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)乳酸菌噬菌體，嚴重影響乳酸菌發(fā)酵，通常是導(dǎo)致發(fā)酵異常的主要原因。因此，有必要對發(fā)酵食品中噬菌體的組成和功能做系統(tǒng)性梳理，為發(fā)酵食品中噬菌體的控制和利用提供參考。

表1 不同發(fā)酵食品中分離得到的噬菌體種類和功能Table 1 Species and functions of phages isolated from different fermented foods

2 噬菌體對食品發(fā)酵的影響

2.1 噬菌體對乳制品發(fā)酵的影響

在噬菌體污染方面，發(fā)酵乳制品是被報道得最多的發(fā)酵食品，尤其在干酪和酸乳制品的生產(chǎn)中均發(fā)現(xiàn)了噬菌體的存在。已有的研究表明，噬菌體對乳酸菌的感染被認為是乳制品發(fā)酵失敗的最主要原因[15]，它們大量感染產(chǎn)風味的乳酸菌，導(dǎo)致風味成分減少[38]。在藍紋干酪的生產(chǎn)過程中，研究人員在發(fā)酵失敗的干酪中發(fā)現(xiàn)了腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）噬菌體，這是一種具有不可收縮尾部的長尾噬菌體[15，38]，其來源有可能是生牛乳和乳清。在酸牛乳中，同樣發(fā)現(xiàn)了長尾噬菌體科的噬菌體，對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的36個菌株造成潛在的影響[14]。研究者對工廠的環(huán)境表面和空氣進行采樣分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境空氣中是可能導(dǎo)致噬菌體污染的主要來源[39]。另一方面，乳酸菌可能攜帶原噬菌體，加工環(huán)境改變對其刺激后可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱倚允删w，最終導(dǎo)致乳酸菌大量死亡并導(dǎo)致發(fā)酵失敗[40-41]。因此，需要加強對生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)的監(jiān)控，篩查噬菌體的存在。對于乳制品中噬菌體的防治，依靠熱處理和調(diào)節(jié)鹽離子濃度等方式，能有效減滅乳酸菌噬菌體[42]，但是過高的溫度容易導(dǎo)致蛋白變性。此外，通過化學方法例如次氯酸鈉有效抑制噬菌體，然而次氯酸鈉會導(dǎo)致化學物質(zhì)殘留[43]。因此探索低毒、有效、安全的噬菌體滅活方法是發(fā)酵生產(chǎn)需要重視的關(guān)鍵技術(shù)問題。此外，通過復(fù)配多種乳酸菌進行協(xié)同發(fā)酵，避免噬菌體對單一乳酸菌造成影響從而導(dǎo)致延遲發(fā)酵或發(fā)酵失敗。通過定期更換對噬菌體不敏感的乳酸菌或?qū)ふ彝蛔兙暌彩强尚械姆椒?，但是往往這些菌株產(chǎn)酸能力較弱，很難達到發(fā)酵要求。未來，可以利用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPER associated proteins，Cas）所構(gòu)建的CRISPR/Cas系統(tǒng)等基因編輯技術(shù)實現(xiàn)工程菌的改造，通過基因編輯手段設(shè)計抗性菌株，并最大程度的保留其發(fā)酵能力。然而，噬菌體的變異和進化可以快速逃逸宿主的免疫系統(tǒng)，噬菌體的侵染與宿主菌的抵抗必然是個持續(xù)的共進化過程。

2.2 噬菌體對豆制品發(fā)酵的影響

納豆發(fā)酵主要利用納豆枯草芽孢桿菌，其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生γ-PGA，該物質(zhì)賦予納豆獨特的黏稠感。納豆生產(chǎn)中斷時，從未形成粘液的異常發(fā)酵大豆中主要分離到的噬菌體是PM1，是一種長尾病毒科噬菌體，其基因組由大約50 kb的線性雙鏈脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）組成[7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該噬菌體能產(chǎn)生PGA解聚酶，將PGA降解為雙谷氨酸和三谷氨酸，從而降低納豆的黏度[8]。另一項研究分離得到了ΦNIT1噬菌體，該噬菌體攜帶一個γ-聚谷氨酸水解酶基因（γ-PGA hydrolase gene，PghP）[9]，導(dǎo)致該噬菌體感染的枯草芽孢桿菌不能積累PGA，致使納豆發(fā)酵失敗。噬菌體對納豆的污染主要通過未加工的大豆或空氣污染帶進發(fā)酵過程[44]。進一步的調(diào)查顯示，在工廠和污水中也發(fā)現(xiàn)了噬菌體的存在[44]。因此，發(fā)酵過程環(huán)境清潔控制對發(fā)酵食品至關(guān)重要。

在韓國豆醬（Cheonggukjang）中分離得到一株枯草芽孢桿菌噬菌體BSP10。該噬菌體屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）。BSP10對韓國豆醬發(fā)酵過程中的發(fā)酵菌枯草芽孢桿菌的生長具有顯著的抑制作用。在豆醬的發(fā)酵過程中，與對照組相比，100 PFU/g 噬菌體就可以將發(fā)酵菌的數(shù)量降低2個數(shù)量級。與納豆污染類似，噬菌體感染在大豆發(fā)酵過程中極大地促進了PGA的降解，對豆醬的生產(chǎn)造成負面影響[10，45]。在日本醬油中，同樣分離得到兩種長尾噬菌體科噬菌體，它們均可以特異性侵染嗜鹽鏈球菌[12]，但是通過基因突變篩選找到了對噬菌體不敏感菌株，用于抵抗噬菌體對醬油發(fā)酵過程的危害。宏基因組分析還揭示了發(fā)酵豆制品（Kinema）中芽孢桿菌噬菌體的存在，這些噬菌體分屬于長尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和短尾噬菌體科[13]。綜上可知，發(fā)酵豆類食品中大多以芽孢桿菌噬菌體為主，這可能與其獨特的發(fā)酵類型有關(guān)，對于以霉菌為主要發(fā)酵微生物的我國傳統(tǒng)豆類發(fā)酵食品中是否存在噬菌體，還缺乏相應(yīng)的報道，噬菌體是否影響發(fā)酵菌的生長和繁殖還有待進一步確認。

2.3 噬菌體對蔬菜發(fā)酵的影響

KOT W等[46]在低鹽酸黃瓜發(fā)酵中檢測出57種噬菌體，大部分噬菌體的宿主以短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為主，首次發(fā)現(xiàn)同一噬菌體可以同時感染多個細菌菌屬。發(fā)酵過程中，共發(fā)現(xiàn)17種不同類型的噬菌體，并且噬菌體的豐度與乳酸菌的豐度呈正相關(guān)。進一步通過電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蔬菜中的噬菌體為有尾噬菌體，具有二十面體的頭部，分別屬于肌尾噬菌體科和長尾噬菌體科。此外，在發(fā)酵黃瓜的鹽漬液中分離出了烈性噬菌體Φps05，對商業(yè)發(fā)酵菌種片球菌（Pediococcussp.）LA0281產(chǎn)生特異性感染[20]。在另一項針對德國酸菜的研究中，研究人員共分離出171個噬菌體，分屬于26種不同噬菌體類型。通過測序分析發(fā)現(xiàn)這些噬菌體的宿主為明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等28種乳酸菌。同樣，這些噬菌體分屬于粘病毒科和長尾噬菌體科噬菌體[47]。有趣的是，JUNGM J等[21]通過分析不同地域的泡菜，發(fā)現(xiàn)來源地不同的泡菜中分離到的噬菌體有顯著差異，揭示泡菜中的病毒群落與地理起源的相關(guān)性，其本質(zhì)上是不同地域環(huán)境所蘊含的微生物種類和相應(yīng)噬菌體類型差異造成的，該研究有助于深入了解發(fā)酵食品的微生態(tài)系統(tǒng)，對區(qū)分不同原料來源的發(fā)酵食品提供有價值的借鑒意義。

2.4 噬菌體對酒類發(fā)酵的影響

針對葡萄酒微生物噬菌體的研究早在20世紀就已經(jīng)展開，目前從葡萄酒釀酒及環(huán)境中分離得到的噬菌體大多數(shù)是以酒類酒球菌（Oenococcus oeni）作為宿主。多數(shù)感染酒類酒球菌的噬菌體為溫和噬菌體[46]，例如Og44，phiS11和Φ10MC[24-25]。目前從葡萄酒中分離出來的大部分屬于長尾噬菌體科，該噬菌體感染可能會引起酒類酒球菌裂解，從而造成蘋果酸乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）失敗，雖然溫和噬菌體不會自發(fā)導(dǎo)致乳酸菌的裂解，但當環(huán)境發(fā)生改變，例如酒精濃度和pH發(fā)生變化，有可能誘發(fā)前噬菌體的從宿主基因組分離并轉(zhuǎn)變成烈性噬菌體，引起乳酸菌溶解[23]。但是目前還沒有直接的證據(jù)表明噬菌體會導(dǎo)致MLF失敗。但是值得注意的是，從法國的波雅克產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的紅酒中分離得到了烈性噬菌體ΦOE33PA，這種噬菌體喪失了溶原性，很有可能直接導(dǎo)致乳酸菌的大量死亡[26-28]。葡萄酒發(fā)酵過程中的噬菌體首先可能來自于葡萄的種植環(huán)境，并有可能通過環(huán)境中的溶原性細菌轉(zhuǎn)運帶入[47]。其次，在釀酒設(shè)備的表面，例如在管道、不銹鋼桶和橡木桶等都會有潛在的噬菌體存在。此外，一些商業(yè)上的發(fā)酵劑也有可能遭受噬菌體的感染，從而被引入葡萄酒發(fā)酵過程中[48]。

KANG J等[31]首次對白酒的低、中、高溫大曲進行病毒組分析，發(fā)現(xiàn)三種白酒大曲均存在噬菌體。通過病毒組學測序發(fā)現(xiàn)，這些噬菌體以乳桿菌噬菌體為主，還包括腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）噬菌體等，分別屬于類雙生病毒科，擬菌病毒科，長尾病毒科和細小病毒科噬菌體[31]。這些噬菌體的存在很有可能對白酒釀造微生物的生長和繁殖產(chǎn)生影響，從而影響發(fā)酵過程。然而，由于白酒釀造過程是混菌發(fā)酵，噬菌體對單一微生物的作用可能被其他微生物替代或者抵消，可能不會像單一菌種發(fā)酵造成劇烈影響，但噬菌體會造成某一類微生物的消亡，從而影響代謝產(chǎn)物的積累。噬菌體在白酒發(fā)酵中的功能和作用還有待進一步發(fā)掘。此外，由于氣候、土壤環(huán)境和栽培方法不同，在不同條件下生長的原料其攜帶的微生物組成和理化性質(zhì)截然不同，原料源噬菌體可能會影響白酒產(chǎn)區(qū)當?shù)匚⑸鷳B(tài)系統(tǒng)，從而直接影響到釀酒品質(zhì)。通過分析噬菌體類型、宿主和來源從而對釀酒原料進行溯源，有可能為精準控制原料品質(zhì)和保護釀酒生態(tài)提供幫助[21]。

3 噬菌體對食品發(fā)酵有害菌的抑制

食品中存在的腐敗菌如需氧型芽孢桿菌和厭氧型梭狀芽孢桿菌，具有較強的熱抵抗能力，通常是導(dǎo)致食品腐敗和變質(zhì)的主要微生物。有些腐敗菌甚至產(chǎn)生生物毒素，對食品安全造成威脅。為控制這些食源性有害微生物的生長和繁殖，研究者已經(jīng)利用噬菌體特異性清除這些有害微生物。目前，從食品生產(chǎn)到包裝，噬菌體在食品加工過程中的各個環(huán)節(jié)都有應(yīng)用。目前研究和應(yīng)用最廣泛的是針對單增生李斯特氏菌的噬菌體，已經(jīng)應(yīng)用在包括即食肉制品[49]、海鮮產(chǎn)品[50]、蔬菜水果[51]、奶制品[52-53]等食品包裝和加工中。此外，利用噬菌體雞尾酒作為食物防腐劑或制作成生物活性包裝材料噴灑在食物表面，可以控制多種病原微生物的生長，延長食品貨架期[54]。此外，這類產(chǎn)品在抑制其他食源性致病菌如大腸桿菌（Escherichia coli）O157：H7[55-56]、沙門氏菌（Salmonella）[57-58]、志賀氏菌（Shigella）[59]和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[60]等表現(xiàn)出了顯著的抑制作用。除了通過直接造成宿主的裂解和死亡，一些噬菌體通過編碼內(nèi)溶素，能夠間接地清除致病微生物及生物被膜[61]。

然而，在噬菌體的實際應(yīng)用方面，工業(yè)中常用的一些消毒劑或環(huán)境因素，如pH值、溫度等，可能會影響噬菌體的穩(wěn)定性[62]；而且，根據(jù)噬菌體—宿主進化動力學，噬菌體的存在不可避免地導(dǎo)致其宿主的進化，從而出現(xiàn)宿主產(chǎn)生抗性、基因轉(zhuǎn)移等問題[63]。這些問題可通過CRISPR/Cas工程技術(shù)、使用不同的噬菌體混劑等方法進行解決[64-65]。總的來說，考慮到潛在安全問題的可能性，在開發(fā)噬菌體制劑作為新的抗菌策略時，應(yīng)從產(chǎn)生噬菌體耐藥細菌的可能性、宿主細菌的進化、噬菌體的水平基因轉(zhuǎn)移以及噬菌體如何影響自然界中的微生物群落等多方面進行評估，驗證噬菌體的安全性和環(huán)保性[62]。

值得注意的是，一些溶原性噬菌體可能攜帶毒性基因或抗生素抗性基因，也可能通過基因突變或水平基因轉(zhuǎn)移的方式將毒性基因傳遞給宿主菌，因此，在選擇噬菌體時，需要利用裂解噬菌體而非溶原性噬菌體作為生物控制劑，并對噬菌體予以安全性評價，通過全基因組測序，對其毒力因子、毒素、抗生素耐藥性和潛在的過敏原基因進行比對，判定其是否對人體有害[66]。

一般而言，噬菌體具有自限性，隨著噬菌體對靶向微生物的作用，宿主細菌數(shù)量逐漸下降，噬菌體的數(shù)量也會逐漸下降，最終在環(huán)境中降解[67]。這種特性避免了噬菌體在環(huán)境中長期積累。此外，噬菌體在環(huán)境中大量存在，包括土壤、海洋、動植物、人體內(nèi)等，迄今為止，沒有證據(jù)表明噬菌體對人類或動物造成有害的影響[68-69]。目前，少數(shù)關(guān)于噬菌體的食品安全應(yīng)用的研究已經(jīng)考慮了如何解決殘留噬菌體活性的問題，可以通過添加“噬菌體中和劑”（引入植物提取液或熱滅活細菌）、離心、過濾等方式降低噬菌體生物防治后噬菌體殘留的問題[70]。另外，經(jīng)過高溫等處理后食品中的噬菌體可以被有效地清除和殺滅[71]，因此，經(jīng)噬菌體處理后的食物可以被認為是安全的。

目前，噬菌體作為食源性致病菌和腐敗菌的抑制劑已在歐美國家得到了廣泛的應(yīng)用[72]。然而在我國，人們對噬菌體還缺乏足夠認知，消費者對其應(yīng)用在食品中的安全性存在擔憂，限制了噬菌體在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，加強有益噬菌體的開發(fā)、安全性評價和宣傳，將有助于噬菌體在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

發(fā)酵過程中的噬菌體動力學是保證微生物良好演替的關(guān)鍵，使發(fā)酵過程中各菌群的生物量保持平衡。在酸菜發(fā)酵的生態(tài)學研究中，細菌的演替與發(fā)酵不同階段發(fā)現(xiàn)的噬菌體數(shù)量有關(guān)[22]。微生物數(shù)量在發(fā)酵第3～7天發(fā)生顯著變化，這與噬菌體的種類變化呈顯著相關(guān)性。在前3天，主要的噬菌體以明串珠菌和魏瑟拉菌噬菌體為主，而在第7天之后，則以乳桿菌噬菌體為主[22]，因此乳酸菌在發(fā)酵中的演替過程受到噬菌體的調(diào)控。由于環(huán)境中的微生物的污染，蠟樣芽孢桿菌作為一種致病菌和腐敗菌經(jīng)常出現(xiàn)在大豆發(fā)酵食品中，蠟樣芽孢桿菌噬菌體BCP1-1顯著降低大豆發(fā)酵食品中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量，而沒有影響發(fā)酵微生物枯草芽孢桿菌[11]。因此，噬菌體具有在不干擾其他共生微生物的同時，選擇性地靶向和殺死特定宿主菌的能力。這種高度特異性降低了對有益細菌或非靶向微生物造成傷害的風險，因此提高了其安全性。此外，發(fā)酵食品是良好的分離有益噬菌體的資源，通過對發(fā)酵食品中噬菌體的分離方法的建立和優(yōu)化，可以發(fā)掘出更多獨特的抗致病菌和腐敗菌的生物控制方法。

噬菌體除了可以調(diào)控宿主微生物的數(shù)量，還可以降低乳酸菌在發(fā)酵食品中釋放的有毒代謝產(chǎn)物。噬菌體Q69可以有效減少酪胺在干酪中的積累[16]。類似的，在干酪模擬生產(chǎn)中，研究者發(fā)現(xiàn)肌尾噬菌體科的糞腸球菌噬菌體156可以降低干酪中生物胺的含量[17]。此外，原噬菌體造成的乳酸菌裂解可以釋放其中的胞內(nèi)酶，促進干酪風味物質(zhì)產(chǎn)生[18]。在葡萄酒釀造過程中，一些葡萄酒腐敗細菌如醋酸桿菌和葡萄糖酸桿菌可以將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸，它們的存在會產(chǎn)生不愉悅的風味物質(zhì)[73-74]，對葡萄酒質(zhì)量產(chǎn)生危害。研究人員發(fā)現(xiàn)了一種可以感染蠟狀葡糖桿菌（Gluconobacter cerinus）的噬菌體，該噬菌體具有無尾二十面體頭部的復(fù)層噬菌體科噬菌體，該噬菌體的存在有效降低了葡萄酒中醋酸的含量[29]，這項研究結(jié)果為葡萄酒發(fā)酵管理提供了指導(dǎo)依據(jù)。此外，DEASY T等[30]分離出了感染短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的噬菌體SA-C12 并鑒定了其形態(tài)學特征。通過啤酒釀酒試驗，該噬菌體在啤酒環(huán)境中穩(wěn)定存在，并顯著減少啤酒中的腐敗菌的數(shù)量。綜上，發(fā)酵過程中的噬菌體并非均導(dǎo)致發(fā)酵異常，只有深入了解噬菌體的功能和特性，才有助于控制有害噬菌體并維持有益噬菌體，提高發(fā)酵性能。

4 發(fā)酵食品中噬菌體的檢測方法

如圖1所示，目前噬菌體的檢測方法多采用直接法和間接法進行研究。直接法多利用雙層平板法對噬菌體進行培養(yǎng)，適用于對烈性噬菌體的直接觀察和計數(shù)，但對于一些溫和噬菌體無法進行判斷和分析。此外可以通過采用超速離心的方法，直接分離出噬菌體并用透射電子顯微鏡或掃描透射電子顯微鏡進行形態(tài)觀察[75-76]，或通過流式細胞術(shù)[77]、納米顆粒跟蹤[78]、落射熒光顯微鏡和原子力顯微鏡[79]等方法進行計數(shù)。但是，對有些不可培養(yǎng)微生物的噬菌體無法進行有效的分離。隨著研究技術(shù)的發(fā)展與進步，噬菌體的研究同時結(jié)合表型觀測與基因組分析技術(shù)，充分了解不同食品發(fā)酵體系中的噬菌體組成和分布特征。目前，隨著測序技術(shù)的興起和迭代，宏基因組測序分析技術(shù)也逐漸被用于噬菌體分析。宏基因組測序無需進行病毒分離，可通過直接提取環(huán)境樣品中全部微生物的基因組并進行高通量測序以反映樣品所有的遺傳信息[36]。研究人員利用Illumina的二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)分析了Kinema中的噬菌體[13]，比較了中國和韓國泡菜的乳酸菌群落和噬菌體群落，發(fā)現(xiàn)利用噬菌體比細菌可以更好的區(qū)分發(fā)酵食品的地域來源[21]。該方法可以宏觀地反映環(huán)境中所有微生物的信息，并且解決了絕大部分微生物難以培養(yǎng)從而無法識別的問題，因此在發(fā)酵食品微生物學研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著對噬菌體宏基因組測序的研究越來越深入以及測序技術(shù)的進步，利用宏病毒組測序技術(shù)可以進一步有針對性的對病毒乃至噬菌體進行提純和分析，對發(fā)酵食品樣品中病毒富集并提取DNA樣本[36]，之后進行文庫構(gòu)建進行測序分析。對干酪表面樣品病毒濃縮之前添加過濾步驟，采用密度梯度超速離心替代純化所得到的濃縮產(chǎn)物可被用于更好地解析病毒在干酪微生物生態(tài)系統(tǒng)中的重要性。通過宏病毒組學實現(xiàn)了在白酒大曲中對噬菌體種類的分析，并對噬菌體的宿主做了注釋和預(yù)測[31]。但該方法對食品基質(zhì)的保存、取樣方法、噬菌體分離和核酸物質(zhì)提取具有較高的要求，會直接影響提取噬菌體的質(zhì)量和豐度。因此，在復(fù)雜食品基質(zhì)體系中探索并優(yōu)化提取噬菌體基因組的方法是決定測序結(jié)果準確性的關(guān)鍵，針對發(fā)酵食品中噬菌體組的特異性提取方法將有待進一步被優(yōu)化。

圖1 發(fā)酵食品中噬菌體的檢測方法Fig.1 Detection methods of phages in fermented foods

5 總結(jié)與展望

由于噬菌體不直接參與發(fā)酵，其在發(fā)酵食品中的作用經(jīng)常被忽視，但它通過調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)，間接影響發(fā)酵微生物的增殖和演替。通過了解噬菌體在發(fā)酵體系中的功能，才能更好的控制和利用噬菌體，進而控制發(fā)酵過程。盡管利用下一代測序技術(shù)為研究發(fā)酵食品中的噬菌體帶來了便利，但目前該方法仍受限于噬菌體基因庫的不完善，因此需要進一步完善噬菌體基因組的提取方法和噬菌體基因庫的構(gòu)建，利用更先進的方法研究噬菌體在發(fā)酵微生物群落中的關(guān)鍵作用，將為發(fā)酵食品的標準化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。