賀雨杰，唐雨潤，蔣小清，郭晴艷，2*

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.西華大學(xué) 食品微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039）

中國白酒是一種傳統(tǒng)的酒精飲料，擁有2 000多年歷史，也是世界六大蒸餾酒之一[1]。根據(jù)白酒的主要香氣特征，可以將其劃分為12種香型，其中濃香型、醬香型、清香型和米香型被廣泛認(rèn)為是四種基本香型。濃香型白酒作為四種基本香型之一，具有窖香濃郁、純正和諧、香氣協(xié)調(diào)、回味悠長的典型特征，其銷售份額約占中國白酒總產(chǎn)量或市場份額的70%，深受廣大飲酒者的喜愛[2]。濃香型白酒是以谷物為原料，以濃香型大曲為糖化劑，在窖池內(nèi)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、固態(tài)蒸餾、陳釀、勾兌等工序制得的白酒[3]。其原名為瀘香型白酒，是根據(jù)著名濃香型白酒品牌“瀘州老窖”的特點(diǎn)命名的，從20世紀(jì)80年代才開始被稱為濃香型白酒。根據(jù)地區(qū)和白酒風(fēng)格，濃香型白酒可以分為不同流派，包括四川流派、江淮流派和北方流派。四川流派是濃香型白酒的起源地，一半的高質(zhì)量濃香型白酒品牌都產(chǎn)自該地區(qū)[4]。其中，瀘州素有“中國酒城”之稱，是川酒四大主產(chǎn)區(qū)之一，在中國濃香型白酒產(chǎn)業(yè)中具有特殊的重要性。

濃香型白酒在開放環(huán)境中生產(chǎn)，經(jīng)不同微生物的代謝產(chǎn)生酒精和香氣成分。微生物在白酒風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味類型的形成中起著決定性的作用，而所有微生物都直接或間接來自于環(huán)境并構(gòu)成了由生產(chǎn)技術(shù)和環(huán)境生態(tài)調(diào)節(jié)的發(fā)酵微環(huán)境[5-7]。白酒發(fā)酵微環(huán)境是白酒發(fā)酵環(huán)境的重要組成部分，也是影響白酒質(zhì)量安全和風(fēng)味特征的重要因素[8]。發(fā)酵微環(huán)境包括糧食原料在操作過程中直接或間接接觸的所有環(huán)境，包括但不限于土壤、用水、空氣、工人等因素。研究表明，不同地區(qū)生產(chǎn)的醬香型白酒發(fā)酵谷物中的微生物群落組成有很大差異，這可能是其獨(dú)特風(fēng)味的部分原因[9-10]。HU Y L等[11]利用高通量測序技術(shù)研究了米香型白酒生產(chǎn)過程中微生物群落的變化，研究表明，各種主要微生物均來自于環(huán)境和大米原料，且溫度和總酸含量是影響微生物組成的主要物理化學(xué)因素。此外，大曲和窖泥均對(duì)發(fā)酵谷物中的原核生物群落產(chǎn)生影響，窖泥中的厭氧菌可以遷移到糟醅中，并促進(jìn)有機(jī)酸和風(fēng)味化合物的生成[12]。LIU M K等[13]通過高通量測序?qū)o州老窖使用了40年和400年的窖池中細(xì)菌群落多樣性和新穎性展開探究。結(jié)果表明，瀘州老窖窖泥中的11個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬可能在中國濃香型白酒生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，且產(chǎn)己酸菌屬（Caproiciproducens）在400年窖池中豐度顯著增加，為瀘州地區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成奠定生物基礎(chǔ)。因此，探究濃香型白酒發(fā)酵微環(huán)境與風(fēng)味的相關(guān)性是提高白酒生產(chǎn)質(zhì)量和可控性的關(guān)鍵。

本研究采用高通量測序技術(shù)分別對(duì)瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒廠來源大曲、糟醅和窖泥以及環(huán)境樣本中的微生物群落進(jìn)行檢測，進(jìn)一步利用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid-phase microextractioncomprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC×GC-MS）檢測大曲、糟醅、窖泥和原酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，基于相關(guān)性分析探究瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒微環(huán)境與特征性風(fēng)味的相關(guān)性，闡明其作用網(wǎng)絡(luò)，以期揭示瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒風(fēng)味密碼，為實(shí)現(xiàn)濃香型白酒的質(zhì)量控制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲、糟醅、窖泥和原酒樣品：取自四川省瀘州市3家濃香型白酒廠（分別編號(hào)為1、2、3），其中大曲樣品采用五點(diǎn)取樣法采集曲房內(nèi)穩(wěn)定儲(chǔ)存的大曲（D1、D2、D3）；糟醅樣品為對(duì)上、中、下3個(gè)位置的內(nèi)層和外層分別取樣，混合為1個(gè)樣品（Z1、Z2、Z3）；窖泥樣品采用五點(diǎn)取樣法分別對(duì)窖池四周和中心點(diǎn)取樣并混合為1個(gè)樣品（J1、J2、J3）；原酒樣品編號(hào)為B1、B2、B3；土壤樣品取自白酒廠內(nèi)空地，去除部分可見雜質(zhì)（RW）；水體樣品分別取自白酒廠釀造用水（FW）和瀘州內(nèi)長江（RW），各選3個(gè)取樣點(diǎn)；每個(gè)樣品采集3個(gè)平行樣品，取樣后使用無菌封口袋密封，經(jīng)干冰保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

50×三羥甲基氨基甲烷-乙酸鹽-乙二胺四乙酸緩沖液、2×San·Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混液、4SGreenPlus無毒核酸染料、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker 2 000：生工生物工程（上海）股份有限公司；2-辛醇（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；氯化鈉（分析純）：福晨化學(xué)試劑有限公司；E.Z.N.A.R土壤DNA試劑盒：美國Omega生物技術(shù)公司；革蘭氏染色液試劑盒：北京索萊寶有限公司；DB蠟質(zhì)石英毛細(xì)管柱、DB-17MS毛細(xì)管柱：安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Easycycle Gradient梯度PCR儀、BDA Box 2凝膠成像分析系統(tǒng)：德國耶拿分析儀器股份公司；DYY-8C雙定時(shí)電泳儀：北京市六一儀器廠；QP2020NX氣質(zhì)聯(lián)用儀：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；SB-5200DT超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；57330-U手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣手柄、57329-U二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carbo-xen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭：德國默克公司；WFJ7200紫外分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；PHS-320高精度智能酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司；QuantiFluorTM-ST熒光計(jì)：普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；固態(tài)熱調(diào)制器HV（c720-21005）：雪景電子科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本理化指標(biāo)測定

根據(jù)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》對(duì)樣品pH值、水分、總酸、還原糖以及淀粉含量進(jìn)行檢測。pH值：pH計(jì)測定；水分含量：直接干燥法測定；總酸：氫氧化鈉滴定法測定；還原糖：直接滴定法測定；淀粉含量：酸水解法測定。

1.3.2 高通量測序

根據(jù)E.Z.N.A.R土壤DNA試劑盒操作說明進(jìn)行微生物DNA提取，分析DNA濃度和純度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA完整性。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因序列擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系包括4 μL 5FastPfu緩沖液、2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5 mmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、0.2 μL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、0.8 μL引物338F（5 μmol/L）、0.8 μL引物806R（5 μmol/L）以及10 ng 模板DNA，并用雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至體系總體積為20 μL，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，升溫至72 ℃延伸45 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；然后在72 ℃維持10 min以進(jìn)一步延伸，最后降溫至10 ℃并人工終止程序。使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）進(jìn)行真菌ITS基因序列擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增體系包括4 μL 5FastPfu緩沖液、2 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.4μLrTaq聚合酶、0.2μLBSA、0.8μL引物ITS1F（5μmol/L）、0.8 μL引物ITS2R（5 μmol/L）以及10 ng模板DNA，并用ddH2O補(bǔ)充至體系總體積為20 μL，擴(kuò)增程序與細(xì)菌一致。進(jìn)一步利用2%瓊脂糖凝膠分離和提取擴(kuò)增產(chǎn)物，通過DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化，最后利用熒光系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，將符合要求的樣品置于-80 ℃儲(chǔ)存。

測序得到的原始數(shù)據(jù)（Raw Reads）通過Trimmomatic v0.33軟件進(jìn)行過濾處理，之后通過cutadapt 1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識(shí)別和去除，得到不包含引物序列的高質(zhì)量序列數(shù)（Clean Reads）。使用Usearch v10軟件對(duì)樣品Clean Reads進(jìn)行拼接，并根據(jù)不同區(qū)域長度范圍進(jìn)行拼接和長度過濾。去除標(biāo)簽序列以及長度小于200 dp、平均值得分低于20分或含有模糊堿基對(duì)的低質(zhì)量序列。使用QIIME2（版本2020.6）軟件對(duì)嵌合體序列進(jìn)行去噪和消除，按照97%成對(duì)同一性的閥值將優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行歸類，形成最終有效數(shù)據(jù)去除嵌合體后的序列條數(shù)（Non-chimeric Reads）。最后對(duì)來自細(xì)菌和真菌的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）代表序列使用Silva 138 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（http：//www.arb-silva.de）和Unite 8.0 ITS數(shù)據(jù)庫（http：//unite.ut.ee/）作為相應(yīng)比較數(shù)據(jù)庫，使用樸素貝葉斯分類器對(duì)特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味化合物測定

采用HS-SPME-GC×GC-MS法檢測原酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物[14]。

窖泥和糟醅樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取2.000 g樣品、1.500 g氯化鈉和5.00 mL蒸餾水，混合，然后轉(zhuǎn)移到15 mL SPME瓶中。將樣品置于30 ℃的水浴中超聲（240 W）處理30 min，加入20 μL質(zhì)量濃度為0.822 mg/mL的2-辛醇（蒸餾水溶解）作為內(nèi)標(biāo)。為使化合物充分揮發(fā)，進(jìn)一步將樣品置于60 ℃的水浴中平衡15 min，然后向該SPME瓶中插入75 μm的DVB/CAR/PDMS涂層的SPME纖維探頭，以吸收瓶中的揮發(fā)性成分，該吸附過程持續(xù)45 min。之后，將該纖維探頭插入氣相色譜儀的注入口，進(jìn)行1 min的解吸附。

原酒樣品預(yù)處理：移取5.00 mL樣品于15 mL SPME瓶中，加入3.000 g氯化鈉和5 μL 2-辛醇，混合，其他與預(yù)處理步驟同上。

GC×GC-MS條件：一維色譜柱由DB蠟質(zhì)石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）組成，二維色譜柱由DB-17MS毛細(xì)管柱（1.2 m×0.18 mm×0.18 mm）組成，應(yīng)用固態(tài)熱調(diào)制器HV（c720-21005），用高純氦氣（He）（純度≥99.999%）作為載氣，流速為1.0 mL/min。溫度程序?yàn)?0 ℃下保持2 min，之后以6 ℃/min的速度升至230 ℃，同時(shí)設(shè)置烘箱溫度為230 ℃，二維分析時(shí)間與一維柱同步，調(diào)制周期為4 s。

定性定量分析：通過比較美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜庫中參考標(biāo)準(zhǔn)的保留指數(shù)和質(zhì)譜對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定；使用內(nèi)標(biāo)法對(duì)所鑒定的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行半定量分析[15]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次（n=3）。使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，然后進(jìn)行鄧肯多重范圍檢驗(yàn)。采用Excel 2019對(duì)風(fēng)味化合物重復(fù)值進(jìn)行處理。使用OriginPro 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形處理。P值＜0.05被用來表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造微環(huán)境分析

微生物相互作用模式很大程度上取決于它們所處的環(huán)境，環(huán)境條件的變化可能導(dǎo)致群落協(xié)作或競爭性相互作用的改變，同時(shí)環(huán)境條件的變化也是微生物內(nèi)部相互作用結(jié)果的體現(xiàn)[16-17]。瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒廠來源大曲、糟醅和窖泥的理化指標(biāo)檢測結(jié)果見圖1。

圖1 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒大曲、糟醅和窖泥樣品的理化指標(biāo)檢測結(jié)果Fig.1 Physicochemical indexes determination results of strong-flavor Baijiu Daqu, Zaopei and pit mud samples in Luzhou production area

由圖1a可知，大曲樣品pH值為6.55～6.68，呈弱酸性；糟醅中pH值較低，僅為3.05～3.23，有利于耐酸性菌的篩選和后續(xù)發(fā)酵優(yōu)勢菌株的形成；窖泥樣品的pH值為5.08～5.21，位于大曲和糟醅之間。

酸度是有機(jī)酸總量的體現(xiàn)，而有機(jī)酸作為窖泥風(fēng)味分析中的主要物質(zhì)以及最終香氣呈現(xiàn)的前體物質(zhì)，是衡量窖泥品質(zhì)的重要指標(biāo)。窖泥的高酸度使產(chǎn)酸細(xì)菌在其內(nèi)部富集生長，最終成為優(yōu)勢細(xì)菌群落，為濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成做出積極貢獻(xiàn)。由圖1b可知，大曲樣品的酸度最低，為0.60～0.73 mmol/10 g；糟醅酸度為1.83～2.20 mmol/10 g；窖泥酸度明顯高于大曲和糟醅，達(dá)到6.87～7.63 mmol/10 g，大曲內(nèi)部的弱酸性條件為微生物的適應(yīng)性生長提供了良好的基礎(chǔ)。

由圖1c可知，糟醅和窖泥的還原糖含量分別為2.77～3.00 g/100 g、2.77～2.93 g/100 g，大曲中還原糖含量為4.83～6.17 g/100 g，表征大曲較高的糖化能力，可為后續(xù)發(fā)酵提供充足動(dòng)能。

由圖1d可知，糟醅中水分含量是評(píng)價(jià)環(huán)境濕度和樣品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，窖泥、大曲的水分含量分別為52.20%～58.13%、8.73%～9.37%，糟醅中水分含量較高，達(dá)到48.73%～58.67%，為微生物的生長提供充足的水分條件。

以上結(jié)果初步刻畫了瀘州產(chǎn)區(qū)釀造微環(huán)境的特點(diǎn)，其合適的pH值、酸度、還原糖以及水分含量有效推動(dòng)內(nèi)部微生物區(qū)系的構(gòu)建和穩(wěn)定繁殖，為該產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成奠定堅(jiān)實(shí)的環(huán)境基礎(chǔ)。

2.2 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造微環(huán)境微生物分析

2.2.1 細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

Chao1指數(shù)和基于豐度的覆蓋估計(jì)值（abundance-based coverage estimator，ACE）指數(shù)表征物種豐富度，而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表征物種多樣性。對(duì)瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒廠來源大曲、糟醅、窖泥樣品以及釀造水體、環(huán)境水體、廠區(qū)土壤樣品的微生物菌群進(jìn)行測序分析，其細(xì)菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果見表1。

表1 細(xì)菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Alpha diversity analysis results of bacterial community

由表1可知，土壤樣品Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別為2 662.03和2 663.34，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為10.50和1.00，均高于其他樣品，表征其細(xì)菌群落豐富度和多樣性最高。窖泥樣品Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別為501.14～512.20和509.88～515.89，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為6.01～6.47和0.93～0.98，均低于其他樣品。此外，釀造水體和環(huán)境水體樣品中細(xì)菌群落豐富度和多樣性（Chao1指數(shù)分別為1 262.55、2 352.29，ACE指數(shù)分別為1 274.27、2 358.57，Shannon指數(shù)分別為7.88、9.20，Simpson指數(shù)均為0.99）均高于大曲、糟醅和窖泥樣品，表明濃香型白酒釀造過程中細(xì)菌群落從土壤和水體向大曲、糟醅和窖泥轉(zhuǎn)移的過程中伴隨著微生物的演替，其中的優(yōu)勢細(xì)菌群落最終占據(jù)發(fā)酵微環(huán)境中的生態(tài)位，形成濃香型白酒釀造的優(yōu)勢細(xì)菌群。

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平不同樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)以及層次聚類分析熱圖見圖2。由圖2a可知，針對(duì)所有樣品，在屬水平上平均相對(duì)豐度排名前10的屬分別是醋酸乳桿菌屬（Acetilactobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、喜熱菌屬（Caloramator）、水楊酸沉積桿菌屬（Sedimentibacter）、白腐菌屬（Petrimonas）和部分未分類的梭菌目（unclassified_Clostridiales）、未分類的厚壁菌門（unclassified_Firmicutes）、未分類的瘤胃球菌科（unclassified_Ruminococcaceae）、未分類的細(xì)菌（unclassified_Bacteria）。其中，大曲中魏斯氏菌屬相對(duì)豐度最高，達(dá)52.28%。相較于四川其他產(chǎn)區(qū)，瀘州產(chǎn)區(qū)濃香大曲中魏斯氏菌屬相對(duì)豐度更高，這可能有助于解釋瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒的特征性風(fēng)味[18]。大曲、糟醅和窖泥中均檢出較高相對(duì)豐度的白腐菌屬（分別為6.71%、3.60%和22.79%）。白腐菌屬是一種來源于環(huán)境的嗜溫發(fā)酵細(xì)菌屬，有利于代謝活動(dòng)的推進(jìn)并創(chuàng)造適合于發(fā)酵的厭氧環(huán)境[19]，促進(jìn)窖池發(fā)酵階段合適發(fā)酵環(huán)境的形成。此外，大曲、糟醅和窖泥中均檢測到高豐度的乳桿菌屬，分別為6.06%、63.09%和13.51%。研究表明，大曲發(fā)酵早期的高酸高溫環(huán)境主要是由乳桿菌屬的代謝活動(dòng)引起的，有助于大曲微生物群落的自我凈化和優(yōu)勢微生物群的形成和穩(wěn)定[20]。在發(fā)酵后期，糟醅中乳酸菌大量富集并代謝產(chǎn)生乳酸，進(jìn)一步代謝可產(chǎn)生乳酸菌素、有機(jī)酸等抗菌物質(zhì)，有助于釀造微環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)后續(xù)風(fēng)味物質(zhì)的形成與累積至關(guān)重要。

圖2 基于屬水平不同樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)（a）及層次聚類分析熱圖（b）Fig.2 Bacterial community structure of different samples based on genus level(a)and heat map for hierarchical cluster analysis(b)

在此基礎(chǔ)上，針對(duì)12個(gè)樣本中檢測到的所有細(xì)菌屬進(jìn)行物種豐度聚類分析，結(jié)果見圖2b。由圖2b可知，大曲樣品分別與糟醅、窖泥、土壤和釀造用水聚類，表明土壤和水體中微生物向大曲、大曲中微生物向糟醅和窖泥的轉(zhuǎn)移。此外，窖泥樣本先與糟醅發(fā)生聚類，之后與大曲聚類，最后與水體和土壤聚類，表明在濃香型白酒釀造過程中，土壤和水體中的微生物通過制曲過程向大曲內(nèi)部遷移，進(jìn)一步經(jīng)堆積發(fā)酵轉(zhuǎn)移至糟醅內(nèi)部，最后經(jīng)窖池內(nèi)發(fā)酵向窖泥內(nèi)遷移，并在該演替過程中逐漸形成特征性優(yōu)勢細(xì)菌群落。

由此可知，在瀘州產(chǎn)區(qū)特征性生態(tài)環(huán)境作用下，形成了瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性的釀造微環(huán)境，并長時(shí)間的演替形成穩(wěn)定的優(yōu)勢細(xì)菌群落，在濃香型白酒釀造過程中相互作用，最終有效推動(dòng)該產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成。

2.2.3 真菌群落Alpha多樣性分析

瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒廠來源大曲、糟醅、窖泥樣品以及釀造水體、環(huán)境水體、廠區(qū)土壤樣品中真菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果見表2。由表2可知，土壤樣品Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別為664.13和664.87，均高于其他樣品，表征其具有最高的物種豐富度，窖泥樣品次之（Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別為510.44～525.87和522.78～536.67）。此外，大曲樣品Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為7.33～7.80和0.99，為所有樣品中最高，表明其物種多樣性最高，土壤樣品次之（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為7.43和0.98）。由此可知，大曲制作過程中的半開放環(huán)境使來自環(huán)境、原料等的各種真菌在其內(nèi)部富集，為濃香型白酒的釀造提供生物基礎(chǔ)。

表2 真菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of fungal community

2.2.4 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平不同樣品的真菌菌群結(jié)構(gòu)以及層次聚類熱圖見圖3。由圖3a可知，針對(duì)所有樣品，在屬水平上平均相對(duì)豐度排名前10的屬分別是嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）、根毛霉屬（Rhizomucor）、哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）、籃狀菌屬（Talaromyces）、嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces）未分類真菌（unclassified_Fungi）以及未分類菌屬（unidentified）。

圖3 基于屬水平不同樣品的真菌菌群結(jié)構(gòu)（a）及層次聚類分析熱圖（b）Fig.3 Fungal community structure of different samples based on genus level(a)and heat map for hierarchical cluster analysis(b)

所有樣品中均檢出嗜熱子囊菌屬，且在大曲、窖泥和糟醅中相對(duì)豐度分別達(dá)到93.64%、36.27%和28.86%。嗜熱子囊菌屬代謝產(chǎn)生的木聚糖酶可耐受濃香型白酒發(fā)酵的高溫環(huán)境并保持較高的催化效率，保證發(fā)酵過程中的高淀粉利用率，有效提高出酒品質(zhì)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，四川遂寧產(chǎn)區(qū)和瀘州產(chǎn)區(qū)大曲真菌群落中嗜熱子囊菌屬豐度存在顯著差異[18]。所有樣品中均檢出曲霉屬，在大曲、窖泥、糟醅中的相對(duì)豐度分別達(dá)到28.25%、21.59%和14.41%，其代謝產(chǎn)生的酯化酶和糖化酶可有效推動(dòng)濃香型白酒風(fēng)味前體物質(zhì)的形成。但是，與江淮產(chǎn)區(qū)大曲真菌群落相比，瀘州產(chǎn)區(qū)大曲中曲霉屬豐度較低，這可能與不同地區(qū)制曲環(huán)境溫度有關(guān)[22]。此外，糟醅中的優(yōu)勢菌屬是哈薩克斯坦酵母屬，相對(duì)豐度高達(dá)32.99%，其有利于發(fā)酵過程中乙醇的產(chǎn)生和有機(jī)酸的積累[23]。據(jù)報(bào)道，瀘州產(chǎn)區(qū)糟醅中哈薩克斯坦酵母屬豐度與水分含量顯著相關(guān)[24]，一定程度上解釋了發(fā)酵環(huán)境與微生物篩選的相關(guān)性。窖泥中的優(yōu)勢菌屬是邁耶氏酵母屬，相對(duì)豐度高達(dá)34.44%，其多來源于環(huán)境。梁歡[25]比較了瀘州產(chǎn)區(qū)和北方產(chǎn)區(qū)窖泥真菌群落，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌株存在明顯的地區(qū)差異性，其中邁耶氏酵母屬差異顯著，這可能是由于不同地區(qū)環(huán)境差異所導(dǎo)致的。

由圖3b可知，不同種類樣品聚類不明顯，大曲、糟醅和窖泥的真菌群落相似性較高，而水體和土壤樣本中真菌群落有顯著差異。由此可知，在瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造過程中，水體和土壤來源真菌向大曲、糟醅和窖泥中遷移并經(jīng)長時(shí)間的演替，最終形成特征性真菌群落，且其優(yōu)勢真菌菌群在不同釀造微環(huán)境中具有相似性，表征優(yōu)勢真菌群落的穩(wěn)定性，保證了瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成。

因此，具有最高物種多樣性的大曲是瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造微環(huán)境中真菌群落富集與演替的基礎(chǔ)，并進(jìn)一步向糟醅和窖泥中遷移，對(duì)特征性真菌群落的形成和穩(wěn)定具有重要作用，進(jìn)一步保證了該產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成。

2.3 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

基于HS-SPME-GC×GC-MS對(duì)瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒廠來源大曲、窖泥、糟醅及原酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖4。由圖4可知，共檢測到182種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括68種酯類、27種醇類、23種酸類和64種其他化合物，其他化合物中包括少量酚類、醛類、酮類、吡嗪類、吲哚類和萜烯類化合物。

圖4 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒各類別揮發(fā)性風(fēng)味化合物相對(duì)含量（a）和聚類分析熱圖（b）Fig.4 Relative contents of various categories volatile flavor compounds in strong-flavor Baijiu from Luzhou producing area (a) and cluster analysis heat map (b)

由圖4a可知，不同樣本中風(fēng)味化合物類別存在顯著差異，其中酯類在窖泥中相對(duì)含量最高，達(dá)到78.63%，其次是糟醅，相對(duì)含量達(dá)到54.96%。醇類在大曲中相對(duì)含量最高，達(dá)到43.57%，而酸類在糟醅中相對(duì)含量最高，達(dá)到24.65%。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步針對(duì)不同樣品中風(fēng)味化合物進(jìn)行分層聚類分析，結(jié)果見圖4b。由圖4b可知，原酒中的主要風(fēng)味化合物是酯類和醇類，相對(duì)含量分別高達(dá)36.05%和27.45%，其中主要包括己酸乙酯（19.18%）、棕櫚酸乙酯（9.20%）、己酸己酯（2.40%）、乙醇（8.78%）、丁醇（3.68%）、己醇（2.73%）、戊醇（1.61%）等。大曲中相對(duì)含量較高的是己酸乙酯（22.12%）、己酸己酯（17.16%）、丁酸乙酯（3.53%）、1-辛烯-3-醇（13.82%）、2,3-丁二醇（6.42%）、乙醇（4.05%）等。糟醅中的主要風(fēng)味化合物是酸類和酯類物質(zhì)，其中己酸乙酯（19.16%）、棕櫚酸乙酯（9.46%）、辛酸乙酯（6.29%）、己酸己酯（5.98%）、己酸（13.21%）、戊酸（2.97%）、辛酸（2.80%）和乙酸（1.90%）相對(duì)含量較高。此外，糟醅中乳酸乙酯（0.86%）相對(duì)含量明顯提高，這可能是由于開放式發(fā)酵對(duì)乳酸的堆積引起的[26]。窖泥中以酸類和酯類為主，其中乳酸乙酯（0.08%）相對(duì)含量明顯低于糟醅，其可能與厭氧發(fā)酵微生物的優(yōu)勢生態(tài)位相關(guān)。由此可知，釀造環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化對(duì)原酒風(fēng)味的原始積累有較強(qiáng)的相關(guān)性[27]。

己酸乙酯主要由酵母對(duì)酸類和醇類物質(zhì)的酯化反應(yīng)生產(chǎn)，為濃香型白酒提供重要的窖香，是評(píng)價(jià)濃香型白酒質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一。大曲、糟醅、窖泥和原酒中己酸乙酯的相對(duì)含量分別為22.12%、19.16%、14.95%和19.18%，表征其在濃香型白酒釀造過程中發(fā)生的轉(zhuǎn)化與演替。醇類在風(fēng)味描述中多給人以復(fù)雜圓潤的香氣體驗(yàn)，被描述為具有堅(jiān)果、香蕉的香氣。瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒原酒中豐富的乙醇、丁醇、己醇、戊醇、丙醇、糠醇等醇類對(duì)其綿柔口感具有重要意義。瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒原酒中酸類的主要貢獻(xiàn)來自于己酸（12.93%）、乙酸（2.72%）、丁酸（2.04%）、戊酸（0.68%）、丙酮酸（0.57%）、辛酸（0.23%）、庚酸（0.15%）和乳酸（0.07%），對(duì)白酒風(fēng)味有明顯的調(diào)和作用，也是酯類代謝過程中重要的前體物質(zhì)。此外，原酒中還檢測出微量的醛類、吡嗪類和吲哚類化合物。微量風(fēng)味化合物在整體所占比例小，但其感官閾值高，為濃香型白酒的風(fēng)味感受提供關(guān)鍵的調(diào)和作用。

由此可知，瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造微環(huán)境中微生物群落的演替伴隨著酯類、醇類、酸類等風(fēng)味化合物的轉(zhuǎn)化。酯類是所有樣品中的首要風(fēng)味化合物，賦予濃香型白酒甜味和果味，同時(shí)弱化氨基的苦味和脂肪酸的辛辣味，對(duì)瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒的特征性風(fēng)味意義重大。其中，己酸乙酯、丁酸乙酯、油酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯等均具有重要貢獻(xiàn)。此外，己醇、丁醇、異戊醇、乙酸、己酸、丁酸等關(guān)鍵差異性風(fēng)味化合物在不同樣本中的轉(zhuǎn)化與演替共同刻畫了濃香型白酒風(fēng)味的形成過程。

2.4 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒釀造微環(huán)境-風(fēng)味相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究釀造微環(huán)境對(duì)瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒風(fēng)味的影響，分別對(duì)理化指標(biāo)、微生物屬與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見圖5。

圖5 瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與理化指標(biāo)（a）、微生物屬（b）的相關(guān)性分析結(jié)果Fig.5 Results of correlation analysis between volatile flavor compounds and physicochemical indexes (a) and microbial genera (b)

由圖5a可知，水分含量和酯類呈正相關(guān)，與酸類呈負(fù)相關(guān)。還原糖是代謝中的主要能量供給，其與酸類和醇類呈正相關(guān)，與大部分酯類呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步針對(duì)測序得到的豐度較高的細(xì)菌屬和真菌屬，通過Pearson相關(guān)系數(shù)與主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行相關(guān)性分析可知，細(xì)菌群落與風(fēng)味化合物的相關(guān)性強(qiáng)于真菌（圖5b）。其中，白腐菌屬（Petrimonas）、喜熱菌屬（Caloramator）、水楊酸沉積桿菌屬（Sedimentibacter）以及未分類的厚壁菌門（unclassified_Firmicutes）、瘤胃球菌科（unclassified_Ruminococcaceae）、未分類的梭菌目（unclassified_Clostridiales）與棕櫚酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、庚酸具有明顯的正相關(guān)關(guān)系，而與丁酸乙酯、乳酸乙酯呈負(fù)相關(guān)。醋酸乳桿菌屬（Acetilactobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）與庚醇、丙醇、乙酸、丁酸、辛酸、戊酸呈正相關(guān)，而與庚酸乙酯、辛酸乙酯呈負(fù)相關(guān)。真菌群落與關(guān)鍵酯類和酸類化合物具有相關(guān)性，其中嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、木霉屬（Trichoderma）、邁耶氏酵母屬（Meyerozyma）、根毛霉屬（Rhizomucor）與己酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯呈正相關(guān)關(guān)系，曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、籃狀菌屬（Talaromyces）與丙醇、乙酸、丁酸、辛酸、戊酸呈正相關(guān)。

由此可知，控制濃香型白酒釀造微環(huán)境理化特性有助于風(fēng)味化合物的形成與累積，其中高pH值、低水分含量有助于醇類和酸類物質(zhì)的形成，而低pH值、低酸度、高水分含量有助于酯類物質(zhì)的形成。此外，白腐菌屬、喜熱菌屬、水楊酸沉積桿菌屬以及部分未分類的厚壁菌門、瘤胃球菌科和梭菌目有助于瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒中酯類風(fēng)味化合物的形成，乙酰乳桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬、木霉屬和籃狀菌屬有助于醇類和酸類風(fēng)味化合物的形成。在合適的理化性質(zhì)與優(yōu)勢微生物群落的共同作用下，瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味得以穩(wěn)定與協(xié)調(diào)。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)和HS-SMPE-GC×GC-MS對(duì)瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒廠來源大曲、窖泥、糟醅以及原酒釀造微環(huán)境的微生物菌群結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。進(jìn)一步結(jié)合Pearson相關(guān)性分析闡明該地區(qū)濃香型白酒釀造微環(huán)境與特征性風(fēng)味的相關(guān)性。結(jié)果表明，土壤樣本中的微生物群落豐富度和多樣性均高于大曲、糟醅和窖泥樣本，表征釀造微環(huán)境中微生物群落的演替過程。魏斯氏菌屬和嗜熱子囊菌屬分別是大曲中豐度最高的細(xì)菌屬和真菌屬，同時(shí)也是瀘州產(chǎn)區(qū)大曲區(qū)別于其他產(chǎn)區(qū)大曲的主要菌屬，為瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味形成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。大曲、糟醅、窖泥和原酒中風(fēng)味化合物主要包括酯類、醇類和酸類，但不同樣本中風(fēng)味化合物含量差異顯著。Pearson相關(guān)性分析表明，釀造微環(huán)境理化性質(zhì)和微生物群落與白酒風(fēng)味形成相關(guān)，且細(xì)菌群落與揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相關(guān)性強(qiáng)于真菌群落。其中，白腐菌屬、喜熱菌屬、水楊酸沉積桿菌屬等有助于酯類風(fēng)味化合物的形成，乙酰乳桿菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬等有助于醇類和酸類風(fēng)味化合物的形成。本研究為瀘州產(chǎn)區(qū)濃香型白酒特征性風(fēng)味的形成提供了理論依據(jù)，同時(shí)為后續(xù)濃香型白酒的質(zhì)量控制與優(yōu)化提供參考。