杜 斌，汪 肖，張 敏，李瑜楠，鄧昌瓊，林 棟

（貴陽學院 食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005）

薏仁米（Coix chinensisTod）是禾本科植物薏仁干燥成熟的種仁，又稱苡仁米、薏米等，其具有營養(yǎng)、保健、美容等多種功效，一直被用作營養(yǎng)膳食補充劑[1]。貴州省黔西南州興仁縣是我國薏仁米主要產區(qū)之一，有“中國薏仁米之鄉(xiāng)”之稱[2]。薏仁米糠是薏仁米在加工過程中經(jīng)脫皮和胚加工制成的副產物，富含蛋白、米糠油、多糖、植酸鈣等多種營養(yǎng)成分，具有很大的開發(fā)潛力[3]。由于生產企業(yè)生產設備落后，技術不完善，缺乏精深加工等原因，目前，薏仁米加工大多屬于粗放型，產生的大量米糠被直接用作飼料，綜合利用不充分，造成極大浪費。

多肽是通過肽鍵連接α-氨基酸形成的化合物，其一般由不超過100個氨基酸組成。植物多肽是在特定條件下植物蛋白質水解形成的小分子多肽[4]，其具有原始蛋白質和氨基酸所沒有的特定生物功能，如抗氧化、抗過敏、抗糖尿病、抗癌等[5-11]。劉威等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過堿性蛋白酶水解核桃蛋白制備的多肽具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基和羥基自由基的能力；周亭屹等[13]通過生物酶解花椰菜莖葉蛋白的粗提物得到花椰菜多肽，并從中篩選出具有輔助降血脂效果的分離組分G15-Ⅱ，其能夠降低大鼠血液中的總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDLC）水平；王凱凱[14]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆中的多肽可以促進巨噬細胞的增殖，增加巨噬細胞的活性，并促進其免疫效應。由于植物多肽對人類疾病的預防和控制更安全、更溫和，且食用安全性高，現(xiàn)已成為醫(yī)學和食品領域研究的焦點[15]。

目前，對薏仁米糠的研究還處于起步階段，主要圍繞薏仁米糠油脂[16]、蛋白[17]和多肽[18]等方面開展研究，其中薏仁米糠多肽的制備主要通過酶法水解薏米糠蛋白制備[19]，對微生物發(fā)酵生產薏仁米糠多肽的研究還鮮見報道。采用微生物發(fā)酵法生產薏仁米多肽不僅可以利用其在培養(yǎng)過程中產生的各種蛋白酶水解蛋白來獲得功能更多的小肽[20-21]，而且還能大大降低生產成本，適于工業(yè)化生產。因此，本研究采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵生產薏仁米糠多肽，以水解度為評價指標，通過單因素試驗及正交試驗對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，并對其抗氧化特性進行研究，為薏仁米糠的深度開發(fā)和提高薏仁米糠資源的利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮薏仁米糠：貴州泛亞實業(yè)（集團）有限公司，經(jīng)石油醚脫脂處理后，粉碎過20目篩，-18 ℃保存?zhèn)溆?；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：武漢唯美生物有限公司；DPPH、ABTS（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；維生素C（vitamin C，VC）（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH為7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中添加20 g瓊脂。

1.2 儀器與設備

BM2000生物顯微鏡：上海班特儀器有限公司；BT585酸度計、AT21型電子天平：上海良平儀器有限公司；B-206恒溫水浴鍋：上海印溪儀器儀表有限公司；UV-2700紫外分光光度計：上海精科實業(yè)有限公司；ZD-85恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；TGL-16A離心機、YXQ-LS-50SII高壓蒸汽滅菌鍋：深圳市康初源有限公司；DH4000II恒溫培養(yǎng)箱：武義海納電器有限公司；101-1電熱恒溫干燥箱：上海路達實驗儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 薏仁米糠的發(fā)酵

將枯草芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基，37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h后，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h作為種子液，備用。準確稱取5 g脫脂薏仁米糠，加入100 mL蒸餾水，按5%接種枯草芽孢桿菌種子液后，37 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵24 h。

1.3.2 水解度的測定

參照羅斌等[21]的方法，采用三硝基苯磺酸（trinitrobenzene-sulfonic acid，TNBS）法測定游離氨基酸含量，并計算水解度（degree of hydrolysis，DH），其計算公式如下：

式中：Lt表示發(fā)酵一段時間后發(fā)酵液中的游離氨基含量，mg/mL；L0表示發(fā)酵前溶液中的游離氨基含量，mg/mL；Lmax表示米糠中蛋白完全水解后溶液的游離氨基含量，mg/mL。

1.3.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵薏仁米糠條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

以水解度為評價指標，采用單因素輪換法依次考察發(fā)酵時間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）、發(fā)酵溫度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、初始pH值（5、6、7、8、9）對水解度的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以水解度為評價指標，以發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、初始pH值（D）為評價指標，設計4因素3水平的L9（34）正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵薏仁米糠條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation condition optimization of adlay bran by Bacillus subtilis

1.3.4 薏仁米糠多肽的制備

將發(fā)酵液在4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min，上清液用0.45 μm濾膜過濾后，再經(jīng)真空濃縮以及冷凍干燥即得到薏仁米糠多肽粉末。

1.3.5 抗氧化活性測定

用蒸餾水將薏米糠多肽制備成不同質量濃度的樣液，測定抗氧化活性。DPPH自由基參照YOU Q等[22]的方法，ABTS自由基清除率的測定參照董燁等[23]的方法，羥基自由基清除率的測定參照魏明等[20]的方法，還原力的測定參照廖盧艷等[24]的方法。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進行處理，使用GraphPad Prism 8作圖，結果以“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵薏仁米糠條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響

發(fā)酵時間對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響見圖1。由圖1可知，發(fā)酵8 h后，隨著發(fā)酵時間的增加，薏仁米糠水解度逐漸上升，在發(fā)酵24 h時，水解度達到20.15%，當發(fā)酵時間＞24 h后，隨著發(fā)酵時間的延長，水解度沒有明顯的變化。分析原因可能是由于在發(fā)酵前期菌種處于適應環(huán)境階段，生長緩慢，酶產量較低，因此發(fā)酵液中的蛋白質底物水解度較低；當菌種進入對數(shù)生長期后，生長代謝旺盛，蛋白質底物的水解度隨著胞外酶分泌量的加大逐步升高；穩(wěn)定期以后菌種生長逐漸平穩(wěn)，產酶量飽和，蛋白質底物的水解度也達到最大值，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質逐漸耗盡，并且代謝廢物開始累積，導致溶氧量不足而影響酶的合成，因此發(fā)酵后期水解度趨于平緩[25]。綜上，選擇培養(yǎng)24 h為發(fā)酵的最佳時間。

圖1 發(fā)酵時間對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the hydrolysis degree of adlay bran fermentation broth

2.1.2 枯草芽孢桿菌接種量對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響

枯草芽孢桿菌接種量對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響見圖2。由圖2可知，隨著接種量的增大，水解度逐漸增加，當接種量達到5%時，水解度達到19.86%，繼續(xù)增加接種量水解度無明顯變化。究其原因這可能是，當接種量較低時，發(fā)酵液中菌種含量較低，產生的胞外酶也較少，不足以分解發(fā)酵液中的蛋白質底物；而接種量過高，又使發(fā)酵前期菌體生長以及營養(yǎng)消耗過快，導致后期營養(yǎng)不足進而引起菌體自溶[26]。因此，當接種量相對薏仁米糠達到飽和后，繼續(xù)增加接種量就無法達到增加體系水解度的效果。因此，選擇接種量5%較為適宜。

圖2 枯草芽孢桿菌接種量對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響Fig.2 Effect of inoculum on the hydrolysis degree of adlay bran fermentation broth

2.1.3 發(fā)酵溫度對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響

發(fā)酵溫度對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響見圖3。由圖3可知，發(fā)酵液的水解度在31～37 ℃范圍內隨著發(fā)酵溫度的升高而逐漸增加，當發(fā)酵溫度為37 ℃時，水解度達到最大值，為20.21%。而當發(fā)酵溫度高于37 ℃后，發(fā)酵液的水解度開始下降。究其原因可能是發(fā)酵溫度為37 ℃時，菌種的生長速度較快，并且分泌大量蛋白酶，因而發(fā)酵液中蛋白質底物水解度最大；而發(fā)酵溫度高于或低于37 ℃都會造成微生物生長受阻，代謝速率降低，從而影響發(fā)酵效果[27]。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the hydrolysis degree of adlay bran fermentation broth

2.1.4 初始pH對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵基質初始pH值不但影響菌種對環(huán)境的適應速度、生長繁殖速度，還對菌種的產蛋白酶能力也有一定的影響[28-29]。初始pH對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響見圖4。由圖4可知，隨著初始pH的增加，薏仁米糠發(fā)酵液的水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當初始pH為7時，水解度達到最大，為19.90%。這可能與微生物的最適生長pH以及蛋白酶酶解的最適pH有關，當偏離最適pH時，不利于菌體生長以及胞外酶的產生，進而影響發(fā)酵效果，使發(fā)酵液中的蛋白質底物水解度下降[29]。因此，選擇最佳初始pH值為7。

圖4 初始pH值對薏仁米糠發(fā)酵液水解度的影響Fig.4 Effect of initial pH on the hydrolysis degree of adlay bran fermentation broth

2.2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵薏仁米糠條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以發(fā)酵液水解度為評價指標，以發(fā)酵時間（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、初始pH值（D）為評價指標，采用正交助手設計4因素3水平的正交試驗，試驗結果與分析見表2。

表2 枯草芽孢桿菌發(fā)酵薏仁米糠條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation condition optimization of adlay bran by Bacillus subtilis

由表2可知，影響發(fā)酵液多肽得率的各因素主次順序為B（接種量）＞C（發(fā)酵溫度）＞A（發(fā)酵時間）＞D（初始pH值），最優(yōu)組合為A2B3C3D2，即發(fā)酵時間24 h、接種量7%、發(fā)酵溫度39 ℃、初始pH值7。在此條件下進行驗證試驗，薏仁米糠發(fā)酵液水解度可達到21.33%，高于正交處理組中的最高值（20.03%），因此可以確定此條件為最優(yōu)發(fā)酵條件。

2.3 薏仁米糠多肽體外抗氧化活性測定

2.3.1 薏仁米糠多肽對DPPH自由基的清除作用

薏仁米糠多肽對DPPH自由基的清除作用見圖5。

圖5 薏仁米糠多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of peptides from adlay bran on DPPH free radical

由圖5可知，薏仁米糠多肽對DPPH自由基具有清除作用，且隨著多肽質量濃度的增加，DPPH自由清除率也逐漸增大，呈現(xiàn)出良好的量效關系，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為7.23 mg/mL，當多肽質量濃度為10 mg/mL時，DPPH自由基清除率為63.29%。雖然其清除DPPH自由基的能力弱于VC，但高于陳敏等[30]通過酶法制備的燕麥多肽的清除能力。

2.3.2 薏仁米糠多肽對羥基自由基的清除作用

薏仁米糠多肽對羥基自由基的清除作用見圖6。

圖6 薏仁米糠多肽對羥基自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of peptides from adlay bran on hydroxyl free radical

由圖6可知，薏仁米糠多肽對羥基自由基的清除作用隨著多肽質量濃度的增加而上升，表現(xiàn)出劑量相關性，其IC50值為4.47 mg/mL，當多肽質量濃度為10 mg/mL時，羥基自由基的清除率為82.37%?；钚远嚯那宄u自由基的能力主要由其暴露出來的氨基酸側鏈基團和肽序列所決定，特別是蛋氨酸和酪氨酸是提高抗氧化肽的活性以及穩(wěn)定性的重要氨基酸[31-33]。薏仁米糠多肽在一定程度上能夠抑制羥自由基，可能與發(fā)酵過程中蛋白質的水解使蛋氨酸和酪氨酸在一定程度上暴露出來有關，但產生多肽具體的結構及其抑制羥自由基的機理還需進一步研究。

2.3.3 薏仁米糠多肽對ABTS自由基的清除作用

薏仁米糠多肽對ABTS自由基的清除作用見圖7。

圖7 薏仁米糠多肽對ABTS自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of peptides from adlay bran on ABTS free radical

由圖7可知，隨著薏仁米糠多肽質量濃度的增加，其對ABTS自由基的清除作用也隨之上升，表明其質量濃度與ABTS自由基清除率呈現(xiàn)量效關系。當多肽質量濃度為10 mg/mL時，ABTS自由基清除率為84.28%，經(jīng)計算其IC50值為3.45 mg/mL。雖然其ABTS自由基清除能力弱于對照VC，但仍高于尹樂斌等[25]通過枯草芽孢桿菌發(fā)酵制得的大豆多肽的ABTS自由基清除率，這可能與多肽的氨基酸組成以及結構不同有關。有研究發(fā)現(xiàn)，多肽中酪氨酸和半胱氨酸的含量與多肽的ABTS自由基清除能力呈現(xiàn)正相關[34]，而組氨酸出現(xiàn)在肽鏈中特定位置時能夠提高其抗氧化活性[35]，推測薏仁米糠多肽具有較高的ABTS自由基清除能力可能與此有關。

2.3.4 薏仁米糠多肽對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子是一種具有高度反應性的自由基，過多的超氧陰離子可以與細胞內的蛋白質以及脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等其他分子結合并引起氧化損傷，導致如心血管疾病、癌癥、糖尿病、中風和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生和發(fā)展[36]。薏仁米糠多肽對超氧陰離子自由基的清除作用見圖8。由圖8可知，薏仁米糠多肽對O2-·的清除率隨質量濃度的增加而升高，表現(xiàn)出明顯的量效關系，當多肽質量濃度為10 mg/mL時，其對O2-·清除率為63.58%，經(jīng)計算可得IC50值為7.33 mg/mL，表明其對O2-·具有一定的清除能力，但與VC相比差距較大。這可能是由于薏仁米糠多肽中氨基酸具有的酚羥基、巰基等活性基團沒有在發(fā)酵過程中充分顯露出來，導致其與氧自由基反應不完全，故表現(xiàn)出較低的清除氧自由基率[37]。

圖8 薏仁米糠多肽對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.8 The scavenging effects of peptides from adlay bran on superoxide anion free radical

3 結論

利用枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，采用微生物發(fā)酵法制備薏仁米糠多肽，以水解度為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵薏仁米糠的最佳工藝為：發(fā)酵時間24 h，接種量7%、發(fā)酵溫度39 ℃、pH 7.0。在此條件下，薏仁米糠發(fā)酵液水解度可達到21.33%。采用最優(yōu)發(fā)酵工藝制備的薏仁米糠多肽具有較好的體外抗氧化活性，各項抗氧化指標均隨多肽質量濃度增加而增強，呈現(xiàn)出明顯的量效關系，其中對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基以及超氧陰離子的IC50值分別為7.23 mg/mL、4.47 mg/mL、3.45 mg/mL以及7.33 mg/mL。本研究為薏仁米糠的深加工和開發(fā)以及延伸薏仁米全產業(yè)鏈提供了一定的理論指導，也為薏仁米糠多肽生物活性的深入研究奠定了基礎。