孔露平,王秀男,廖 明,張學(xué)榮,周 怡,張 昊,羅小玲,3

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,2. 廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院,3. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部,廣西 南寧 530021)

肝纖維化是多種刺激誘導(dǎo)的肝臟反復(fù)損傷的一種病理再生反應(yīng)[1],其主要表征是肝臟中沉積著過量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)。ECM產(chǎn)生主要原因之一是由于肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)被大量激活分化,磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路,能通過影響HSC的增殖和凋亡來調(diào)節(jié)肝纖維化[2-4]。

細(xì)胞毒素(cadiotoxins,CTXs) 是蛇毒主要活性成分之一[5],對多種癌細(xì)胞具有選擇性抑制性[6-8]。已有學(xué)者在抗肝纖維化研究中利用CTX來誘導(dǎo)HSC凋亡[9]。本課題組前期已證明CTX-1對LX2細(xì)胞具有選擇性殺傷作用[10],本研究旨在探索CTX-1如何通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控HSC增殖與凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1人肝星狀細(xì)胞(HSC-LX2) 保存于廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。

1.1.2主要試劑與儀器 眼鏡蛇毒粗毒凍干粉,由廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院提供;DEAE-瓊脂糖凝膠 CL-6B 填料、葡聚糖凝膠 G-50 填料(上海博格隆生物技術(shù)有限公司,批號分別為2018051302、2016021902); Macro-prep High S 預(yù)裝柱(美國 BIO-RAD 公司,貨號為7324130);細(xì)胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號為C1052);AKT單克隆抗體、p-AKT 單克隆抗體(北京博奧森生物科技有限公司,貨號分別為bsm-33325M、bsm-33281M);PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002(美國Target mol公司,貨號為T15799);Beckman Coulter流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司);透射電子顯微鏡(日本日立公司);多功能酶標(biāo)儀(美國安捷倫科技有限公司); Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國 LI-COR 公司);KTATM start 色譜系統(tǒng)(美國 GE 公司)。

1.2 方法

1.2.1眼鏡蛇毒CTX-1的分離純化 稱取2 g眼鏡蛇毒粗毒凍干粉,經(jīng)溶解、離心、過濾后上樣于層析柱,經(jīng)DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B弱陰離子交換層析、葡聚糖凝膠G-50分子篩層析及 Macro-prep High S 強陽離子交換層析進(jìn)行分離、洗脫和純化。純度經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定,蛋白質(zhì)相關(guān)組分和分子量經(jīng)質(zhì)譜(NanoLC-ESI-MS/MS)進(jìn)行分析。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將HSC-LX2細(xì)胞分為控制組和實驗組兩組,實驗組給予1、2、4 mg·L-1的CTX-1,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞的周期分布特點。

1.2.3透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將HSC-LX2細(xì)胞分為控制組和實驗組,實驗組CTX-1作用濃度為2 mg·L-1,樣品經(jīng)切片、染色等步驟后于透射電子顯微鏡下,觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.4蛋白質(zhì)免疫印跡法測定不同干預(yù)時間后HSC-LX2細(xì)胞中AKT蛋白磷酸化水平的變化 用2 mg·L-1的CTX-1處理HSC-LX2,通過蛋白質(zhì)免疫印跡法測定不同處理時間(0、3、6、9、12 h)后AKT蛋白磷酸化水平的變化。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HSC-LX2細(xì)胞暴露于不同干預(yù)劑后其AKT蛋白磷酸化水平的變化 將CTX-1與抑制劑LY294002(按照控制組、2 mg·L-1CTX-1組、50 μmol·L-1抑制劑LY294002組、2 mg·L-1CTX-1+50 μmol·L-1抑制劑LY294002組分組)作用于HSC-LX2 ,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測AKT蛋白磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1 CTX-1的分離純化三步層析后,獲得電泳純的CTX-1 ,質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示其分子量為9.499 ku。

2.2 CTX-1主要阻滯HSC-LX2細(xì)胞周期的DNA合成期流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示, CTX-1干預(yù)HSC-LX2細(xì)胞24 h后,DNA合成期所占比例與控制組23.90%±1.60%相比分別遞增至30.24%±2.72%、33.12%±2.93%(P<0. 05)和40.43%±1.35%(P<0.01),同時DNA合成前期及后期顯示其百分比降低,說明CTX-1主要阻滯HSC-LX2細(xì)胞周期的DNA合成期。

2.3 CTX-1促進(jìn)HSC-LX2細(xì)胞的凋亡透射電鏡結(jié)果顯示經(jīng)CTX-1干預(yù)后的HSC-LX2細(xì)胞染色質(zhì)固縮、邊集,有明顯凋亡特征,形成凋亡小體,而控制組細(xì)胞形態(tài)均正常,無明顯凋亡征象,說明CTX-1對HSC-LX2細(xì)胞有促凋亡作用。

2.4 CTX-1抑制p-AKT蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示,與控制組相比,經(jīng)CTX-1處理不同時間后的LX2細(xì)胞中的AKT蛋白相對表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),相反,暴露6 h后,各組p-AKT的相對表達(dá)量明顯降低,且隨暴露時間(6～12 h)的推移呈下降趨勢(P<0.05),這提示CTX-1可抑制p-AKT 蛋白的表達(dá),繼而抑制 PI3K/AKT 信號通路的激活。

2.5 CTX-1 聯(lián)合 LY294002 對 p-AKT 表達(dá)的抑制作用最為明顯研究結(jié)果表明,不同抑制劑作用HSC-LX2后對AKT蛋白的相對表達(dá)量影響幅度不存在顯著性差異(P>0.05),而實驗組p-AKT蛋白的相對表達(dá)量與控制組相比則顯示明顯降低(P<0. 01),其表達(dá)水平從低到高為CTX-1+抑制劑LY294002組、抑制劑LY294002組、CTX-1組、控制組,提示CTX-1與抑制劑LY294002聯(lián)合使用時具有增強作用,對p-AKT蛋白表達(dá)的抑制作用最為顯著。

3 討論

本研究將高純度的CTX-1作用于HSC-LX2細(xì)胞,揭示了CTX-1通過阻斷細(xì)胞周期的DNA合成期及通過抑制PI3K/AKT信號通路中p-AKT蛋白的表達(dá)來調(diào)控HSC-LX2增殖與凋亡的機制。本研究首次分析了CTX-1對HSC-LX2細(xì)胞PI3K/AKT信號通路的影響,為CTX-1在肝纖維化防治中的應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。