郭佳慧，豐 鋒，向星星，干雨露，韓維棟

（廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

桃金娘［Rhodomyrtus tomentosa（Ait.） Hassk.］，桃金娘科（Myrtaceae）桃金娘屬［Rhodomyrtus（DC.） Rchb.］植物，為多年生落葉小灌木，又名山稔子、崗稔、多蓮等，多生長(zhǎng)于我國(guó)兩廣的紅壤丘陵地帶，是酸土指示植物［1］。桃金娘是分布于我國(guó)的桃金娘屬的唯一種［2］，其花色絢麗多彩，可應(yīng)用于園林景觀和土壤生態(tài)修復(fù)［3］，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含豐富的多糖和花色素苷，具極高抗氧化活性［4］，有一定藥用保健價(jià)值。目前，關(guān)于桃金娘的研究主要集中在藥用價(jià)值分析、加工利用、生態(tài)特性等方面［4］。

桃金娘的繁殖一般采用實(shí)生繁殖和扦插繁殖［5］。實(shí)生繁殖難以保持優(yōu)良種性，扦插繁殖生根率較低，推測(cè)原因是桃金娘本身單寧含量較高［6］。

花藥培養(yǎng)技術(shù)可使小孢子產(chǎn)生單倍體［7-8］，能快速獲得某一性狀純合體，豐富親本種質(zhì)資源，加快育種進(jìn)程，提高育種效率，縮短育種年限［9-10］，在一些作物和果樹(shù)上已有成功應(yīng)用［11-12］?；ㄋ幣囵B(yǎng)在植物育種方面至關(guān)重要，研究誘導(dǎo)桃金娘花藥胚性愈傷組織的培養(yǎng)條件，建立桃金娘花藥愈傷組織培養(yǎng)體系，為桃金娘組培快繁體系的建立提供理論基礎(chǔ)。本研究以桃金娘花藥為材料，探究不同小孢子發(fā)育時(shí)期、花蕾大小、不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合和不同時(shí)間低溫預(yù)處理對(duì)于花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響，篩選出適合桃金娘花藥愈傷組織誘導(dǎo)的花藥發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基以及低溫預(yù)處理最佳時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

以廣東海洋大學(xué)園林基地長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯、無(wú)病蟲(chóng)害的桃金娘外植體為實(shí)驗(yàn)材料，于晴朗天氣上午（8：00 ~ 10：00）用鑷子采集健壯植株的不同大小花蕾放入自封口塑料袋內(nèi)，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室備用。每一個(gè)發(fā)育時(shí)期取花蕾20個(gè)，重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 花蕾形態(tài)特征觀察與測(cè)量

用游標(biāo)卡尺測(cè)量桃金娘花蕾縱徑、橫徑，觀察花蕾外部形態(tài)并描繪特征，用鑷子剝離萼片與花瓣，觀察花藥顏色與氣味。

1.2.2 小孢子發(fā)育細(xì)胞學(xué)觀察

用卡諾式固定液固定大小不一的花蕾24 h，轉(zhuǎn)入70%酒精中，于4℃冰箱保存。用鑷子取出保存液中的花蕾，剝?nèi)セㄝ嗯c花瓣，取出花藥均勻涂抹于載玻片，用鑷子輕碾花藥，以便花粉細(xì)胞流出，醋酸洋紅染色后在400× 光學(xué)顯微鏡（瑞顯光學(xué)RXBH200M）下觀察各個(gè)發(fā)育時(shí)期的小孢子結(jié)構(gòu)并拍攝小孢子不同發(fā)育時(shí)期照片［10］。

1.2.3 低溫預(yù)處理

將在晴朗早晨（8：00 ~ 10：00）采集的處于單核期且發(fā)育良好的花蕾帶回實(shí)驗(yàn)室，用保鮮袋保存于4℃冰箱，低溫預(yù)處理0、12、24、48、72 h，備用。

1.2.4 花藥愈傷組織誘導(dǎo)

培養(yǎng)基為MS，添加蔗糖30 g/L，pH 5.8，采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究2，4-D（1.0、2.0、3.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）組合對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響。每瓶接種20 枚花藥，每處理共接種30 瓶，重復(fù)3 次。在25 ± 1℃下暗培養(yǎng)14 d 后，光照強(qiáng)度2 000 Lx，12 h/d 下培養(yǎng)。3 d 觀察一次，35 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2017 進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)與分析，再用SPSS 26.0 通過(guò)Duncan 分析法對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃金娘小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征的關(guān)系

觀察桃金娘不同大小花蕾（圖1）小孢子發(fā)育時(shí)期發(fā)現(xiàn)，桃金娘花粉母細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂產(chǎn)生四分小孢子，進(jìn)入四分體時(shí)期。不同發(fā)育時(shí)期的小孢子在形態(tài)上有較大差異，在光學(xué)顯微鏡下觀察同一平面一般只能看到3 個(gè)小孢子（圖2-A）。隨后四分孢子分開(kāi)，進(jìn)入單核期（圖2-B），直到細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)液泡，將細(xì)胞核從中心擠壓到靠近細(xì)胞壁，此時(shí)細(xì)胞處于單核靠邊期（圖2-C）。隨后花粉細(xì)胞進(jìn)行第一次有絲分裂，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)入雙核期（圖2-D）。

圖1 處于不同發(fā)育時(shí)期的桃金娘花蕾Fig. 1 Buds in R. tomentosa at different development periods

圖2 桃金娘不同發(fā)育時(shí)期的小孢子Fig. 2 Microspores of R. tomentosa at different developmental stages

由表1 可知，桃金娘小孢子不同發(fā)育時(shí)期與花蕾橫縱徑大小密切相關(guān)。桃金娘小孢子從四分體時(shí)期向雙核期的發(fā)育過(guò)程中，其花蕾的橫徑、縱徑呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，花蕾橫縱徑比值也基本呈上升趨勢(shì)?；ɡ贆M徑、縱徑大小在桃金娘的不同發(fā)育階段都有顯著差異，并與小孢子發(fā)育時(shí)期呈正相關(guān)。桃金娘小孢子處于單核靠邊期時(shí)，花蕾橫徑為7.877 ±0.374 mm，縱徑為7.167 ± 0.340 mm，花瓣比花萼稍長(zhǎng)。桃金娘小孢子不同發(fā)育時(shí)期花蕾大小不同，且外部形態(tài)不甚相似，說(shuō)明桃金娘小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)密切相關(guān)。從四分體時(shí)期到雙核期，花蕾逐漸膨大，花瓣逐漸露出花萼，花藥顏色由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，直至最后成熟花粉粒時(shí)花藥顏色為深黃色并伴隨濃烈芳香氣味。故花蕾橫縱徑大小和花藥顏色可以作為判斷小孢子發(fā)育時(shí)期的指標(biāo)。小孢子處于單核靠邊期時(shí)，花藥顏色為黃色，此時(shí)期的花藥適宜用于愈傷組織誘導(dǎo)。

表1 桃金娘小孢子發(fā)育時(shí)期花蕾形態(tài)特征Tab. 1 Morphological characteristics of flower buds during microspore development in R.tomentosa

2.2 4℃低溫預(yù)處理時(shí)間對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，4℃條件下低溫預(yù)處理不同時(shí)間對(duì)桃金娘花藥愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著影響，桃金娘花藥經(jīng)過(guò)4℃低溫分別預(yù)處理0、12、24、48、72 h 后，花藥均能形成愈傷組織。預(yù)處理24 h 的效果最好，極顯著高于未經(jīng)低溫處理（對(duì)照）下的7.11%，35 d 后愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)23.78%。

表2 低溫預(yù)處理對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab. 2 Effects of different pretreatments time on callus induction

2.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種28 d，桃金娘花藥開(kāi)始膨大，35 d時(shí)可見(jiàn)純白色或米黃色團(tuán)狀愈傷組織，第4 次繼代至分化培養(yǎng)基中可見(jiàn)綠色胚狀體（圖3）。極差分析見(jiàn)表3，不同水平2，4-D 之間的極差最大，是影響桃金娘愈傷組織誘導(dǎo)的主導(dǎo)因子，6-BA 和NAA 是次要因子，2，4-D 2.0 mg/L處理下愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于其他處理。方差分析表明，2，4-D 處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），6-BA和NAA處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）（F2，4-D= 27.513，F(xiàn)6-BA=4.286， FNAA= 4.435），不同處理組合之間愈傷組織誘導(dǎo)率Duncan 多重比較的結(jié)果（表3）表明，組合MS +2.0 mg/L 2，4-D + 1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的誘導(dǎo)率最高（30.82%）。

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)桃金娘花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab. 3 Effects of plant growth regulator combinations on R. tomentosa callus induction

表4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)桃金娘花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響的多重差異比較Tab. 4 Comparison of multiple differences in the effects of plant growth regulator combinations on the induction of R. tomentosa callus tissue

圖3 桃金娘花藥愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程Fig. 3 R. tomentosa callus growth process

3 討論與結(jié)論

McCormick［13］研究認(rèn)為，植物小孢子發(fā)育從母細(xì)胞開(kāi)始到成熟花粉結(jié)束，分為母細(xì)胞、四分體、單核花粉、成熟花粉4 個(gè)時(shí)期。其中，在四分體時(shí)期，一些植物的4 個(gè)細(xì)胞核并不一定處于同一平面，而是以三維立體的形式出現(xiàn)。在百合科（Liliaceae）植物開(kāi)口箭［Rohdea chinensis（Baker） N. Tanaka］、山麥冬［Liriope spicata（Thunb.） Lour.］中發(fā)現(xiàn)其四分體全部為左右對(duì)稱(chēng)型［14-15］；而東方百合（Lilium OrientalHybrids）四分體則是左右對(duì)稱(chēng)型和四面體型同時(shí)存在［16］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，桃金娘2 種類(lèi)型的四分體都存在，其中四面體型占多數(shù)，偶見(jiàn)左右對(duì)稱(chēng)型。

四分體時(shí)期是減數(shù)分裂的一個(gè)階段，此時(shí)花藥發(fā)育時(shí)期過(guò)早，小孢子尚未形成，幾乎不能成胚［17］；當(dāng)小孢子發(fā)育成成熟花粉粒時(shí)的發(fā)育時(shí)期過(guò)晚，小孢子不具備脫分化能力［18］。因此，花藥培養(yǎng)需要合適的小孢子發(fā)育時(shí)期，選擇適宜的花粉發(fā)育時(shí)期對(duì)花藥誘導(dǎo)形成愈傷組織進(jìn)行組培至關(guān)重要。不同植物的小孢子最適培養(yǎng)時(shí)期不同。謝淼等［19］對(duì)黃瓜（Cucumis sativusL.）花器形態(tài)發(fā)生、小孢子發(fā)育與花藥培養(yǎng)進(jìn)行研究的結(jié)果表明，孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾形態(tài)特征、花藥顏色具有相關(guān)性，黃瓜花藥培養(yǎng)中小孢子最佳培養(yǎng)時(shí)期為單核中后期。詹艷等［20］以10 個(gè)不同基因型黃瓜為試材進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，對(duì)成胚條件的系統(tǒng)研究結(jié)果表明基因型和小孢子發(fā)育時(shí)期是限制黃瓜游離小孢子成胚的關(guān)鍵因子，其中單核靠邊期是進(jìn)行黃瓜游離小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期。Takahata和Keller［21］研究認(rèn)為，甘藍(lán)（Brassica oleraceavar.capitataLinnaeus）小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期是單核靠邊期至雙核期。楊廷紅等［22］研究認(rèn)為，單核靠邊期是進(jìn)行湖北海棠［Malus hupehensis（Pamp.） Rehd.］游離小孢子培養(yǎng)的最佳時(shí)期。一般認(rèn)為，單核靠邊期的小孢子離體培養(yǎng)成功率最高［23-25］，試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

在小孢子或花藥培養(yǎng)時(shí)，常采用鏡檢方式確定發(fā)育時(shí)期，但該方式導(dǎo)致培養(yǎng)效率較低、過(guò)程繁瑣。在對(duì)金蓮花［26］（Trollius chinensisBunge）和黃花苜蓿［27］（Medicago falcataL.）等多種植物的研究中均發(fā)現(xiàn)，小孢子發(fā)育時(shí)期和花蕾外部形態(tài)密切相關(guān)；但對(duì)于不同的植物，處于相同發(fā)育時(shí)期的小孢子對(duì)應(yīng)的花蕾及花藥外部形態(tài)指標(biāo)值不同，在菜心［11］（Brassica rapa syn. Campestris ssp. Chinensisvar.UtilisTsen et LEE.）中單核靠邊期小孢子對(duì)應(yīng)的花蕾縱徑為3.03 ~ 3.39 mm；而本研究通過(guò)對(duì)桃金娘花粉細(xì)胞染色，觀察發(fā)現(xiàn)桃金娘小孢子發(fā)育時(shí)期經(jīng)歷四分體時(shí)期、單核中期、單核靠邊期及雙核期，最終發(fā)育成成熟花粉粒，且小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外部形態(tài)、花藥顏色密切相關(guān)。桃金娘小孢子處于單核靠邊期時(shí)，花蕾橫徑為7.877 ± 0.374 mm，縱徑為7.167 ± 0.340 mm，玫紅色花瓣露出花萼，花藥黃色。因此，取材時(shí)可根據(jù)桃金娘花蕾形態(tài)、花藥顏色等外形指標(biāo)來(lái)判斷小孢子發(fā)育時(shí)期，快速找到需要的時(shí)期，無(wú)需鏡檢，有利于提高小孢子培養(yǎng)效率。

小孢子培養(yǎng)受小孢子發(fā)育時(shí)期、基因型、處理方式、培養(yǎng)基成分等多種因素的影響［28-29］，通過(guò)低溫處理花藥可抑制形成紡錘絲的酶活性，從而快速得到單倍體。花藥培養(yǎng)中利用低溫處理花蕾，極大提高了花藥培養(yǎng)效率，且在多種植物上得到證實(shí)［30-32］。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)低溫預(yù)處理桃金娘花藥，可以顯著提高花藥愈傷組織發(fā)生率，與前人研究結(jié)果一致。花藥愈傷組織的形成受多種因素影響，其中激素種類(lèi)和濃度至關(guān)重要。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在花藥啟動(dòng)培養(yǎng)過(guò)程中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-D 起主導(dǎo)作用［33-34］，本實(shí)驗(yàn)與前人研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)以桃金娘花藥為材料，分析了4℃低溫預(yù)處理和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)桃金娘花藥愈傷組織發(fā)生率的影響，研究結(jié)果表明：低溫處理24 h，桃金娘花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高。2.0 mg/L 2，4-D對(duì)桃金娘花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響極顯著，組合MS+ 2.0 mg/L 2，4-D + 1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的誘導(dǎo)率最高。