馬涵玉，錢(qián) 琪,2,3，王鳳霞，周英森，賈振華，孫 帥，牛麗穎,2,3*

1.河北中醫(yī)藥大學(xué)，河北 石家莊 050091

2.河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091

3.中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化河北省工程研究中心，河北 石家莊 050091

4.河北省科學(xué)院，河北 石家莊 050052

金銀花又稱忍冬藤花，甘，寒，為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]。金銀花在全國(guó)各省都有分布，但主要集中于河北、河南、山東等地[2]。不同產(chǎn)地物候條件下采收的金銀花質(zhì)量存在顯著差異，其揮發(fā)性成分的種類受氣候、土壤等條件的影響[3-4]，而多種揮發(fā)性成分作用是使金銀花擁有“清香”氣和“味淡、微苦”[1]性質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，揮發(fā)性成分的差異會(huì)引起氣味和味道的變化，故對(duì)不同產(chǎn)地金銀花的氣味和味道進(jìn)行量化分析對(duì)金銀花的產(chǎn)地鑒別有重要意義。目前對(duì)不同產(chǎn)地金銀花的研究多集中于其所含化學(xué)成分種類和含量的測(cè)定[5]，而明確不同產(chǎn)地間感官特征和化學(xué)成分的差異可為金銀花的產(chǎn)地區(qū)分提供新的思路與策略。

因此本研究采用HS-GC-MS、電子鼻和電子舌技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地金銀花的揮發(fā)性成分、氣味和味道及進(jìn)行研究。通過(guò)與質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定揮發(fā)性成分，通過(guò)電子鼻和電子舌傳感器的響應(yīng)值來(lái)確定氣味和味道，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）進(jìn)行分析，尋找河北、河南、山東產(chǎn)地金銀花揮發(fā)性成分、氣味和味道的差異，以期為金銀花的產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TQ8050 NX 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（日本島津公司）；PEN3 型電子鼻系統(tǒng)（德國(guó)AIRSENSE 公司）；SA402B 型電子舌系統(tǒng)（日本Insent 公司）；BSA224S-CW 型電子分析天平（北京賽多利斯有限公司）；KQ-250 型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；TDZ5-WS 型低速離心機(jī)湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)公司（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；純化水來(lái)自UPR-II-20L 凈水系統(tǒng)（四川純技術(shù)公司）。

1.2 材料

41 批金銀花樣品取自于河南、山東、河北，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，經(jīng)河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院段吉平中藥師鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。

表1 金銀花樣品信息Table 1 Lonicerae Japonicae Flos sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 HS-GC-MS 分析

2.1.1 樣品前處理 金銀花樣本粉碎，過(guò)40 目篩，稱取1.0 g 于20 mL 螺口頂空瓶中，聚四氟乙烯隔墊密封。進(jìn)樣方式：頂空進(jìn)樣；樣品加熱溫度80 ℃；加熱時(shí)間15 min；進(jìn)樣量1 000 μL。

2.1.2 氣相色譜條件 色譜柱：SH-I-5 Sil MS 型毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口250 ℃；載氣氦氣；載氣控制方式：恒線速度控制，83.5 kPa；分流比9∶1；程序升溫初始40 ℃，維持2 min，5 ℃/min 升至220 ℃，維持1 min。

2.1.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；電離方式為電子轟擊電離源（EI），溶劑延遲時(shí)間2 min；檢測(cè)器電壓：相對(duì)于調(diào)諧結(jié)果，0.3 kV；采集時(shí)間：3～39 min；采集方式：Q3 Scan；掃描范圍m/z50～600。使用質(zhì)譜庫(kù)（NIST20）檢索，并進(jìn)行人工比對(duì)和解析，結(jié)合相似度和保留時(shí)間確定化合物。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理 HS-GC-MS 檢測(cè)結(jié)果的鑒定采用NIST20 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索（相似度≥85%）并結(jié)合參考相關(guān)文獻(xiàn)。使用MSDIAL ver.4.80 軟件進(jìn)行峰的解卷積和峰面積的歸一化。利用SIMCA 14.0 軟件對(duì)共有成分做OPLS-DA 分析篩選變量投影重要性（variable importance projection，VIP）值＞1 的潛在差異成分。

2.2 電子鼻分析

采用直接頂空進(jìn)樣法進(jìn)行測(cè)定。稱取金銀花供試品粉末1.0 g，置于100 mL 燒杯中，使藥材粉末平鋪于燒杯底部，雙層封口膜封口，室溫靜置30 min，上機(jī)測(cè)試。采樣間隔1 s，清洗60 s，零點(diǎn)調(diào)整10 s，預(yù)采樣5 s，測(cè)試120 s，進(jìn)樣體積流量300 mL/min。每批金銀花稱量3 份，平行測(cè)定3 次，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。電子鼻各傳感器詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 電子鼻傳感器陣列性能Table 2 Array performance of electronic nose sensor

2.3 電子舌分析

稱取金銀花供試品粉末1.0 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入100 mL 純凈水，超聲提取10 min 后，轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心5 min，取上清液于電子舌專用樣品杯中上機(jī)測(cè)試。將原始數(shù)據(jù)在電子舌自帶數(shù)據(jù)處理軟件中轉(zhuǎn)化為味覺(jué)值后導(dǎo)出進(jìn)行分析。電子舌各傳感器詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

表3 電子舌傳感器陣列性能Table 3 Array performance of electronic tongue sensor

2.4 不同產(chǎn)地金銀花樣品的HS-GC-MS 分析

2.4.1 總體差異分析 采用HS-GC-MS 測(cè)定3 個(gè)產(chǎn)地金銀花樣品的揮發(fā)性成分，以HB-1、HN-1、SD-1樣品為例，總離子流圖見(jiàn)圖1。如圖2 進(jìn)行PCA（PC1: 0.392，PC2: 0.175），可以看出3 個(gè)產(chǎn)地的金銀花樣品各聚為一群，河北和山東地區(qū)的金銀花揮發(fā)性成分較相似，與河南地區(qū)揮發(fā)性成分差異較大。從3 個(gè)產(chǎn)地中共鑒定出揮發(fā)性成分73 種（表4），其中共有成分26 個(gè)。

圖1 金銀花揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of Lonicerae Japonicae Flos

圖2 不同產(chǎn)地金銀花PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot of Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas

表4 不同產(chǎn)地金銀花揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果Table 4 Results of volatile components of Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas

2.4.2 差異揮發(fā)性成分篩選 將金銀花樣品所有揮發(fā)性成分整合后導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行OPLS-DA，主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率見(jiàn)表5。為了確定哪些揮發(fā)性成分的含量差異在區(qū)分不同產(chǎn)地金銀花上起了重要作用，以VIP＞1、雙尾t檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）為標(biāo)準(zhǔn)篩選河南與河北、河南與山東、河北與山東的金銀花的差異揮發(fā)性成分，對(duì)每個(gè)OPLS-DA 模型進(jìn)行了200 次置換檢驗(yàn)，結(jié)果說(shuō)明各模型穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3 和表5。

圖3 OPLS-DA 得分圖 (A) 和OPLS-DA 模型的置換檢驗(yàn)圖 (B)Fig.3 OPLS-DA score plot (A) and Permutation test plot of OPLS-DA model (B)

表5 金銀花樣品多元統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)Table 5 Multivariate statistical analysis data of Lonicerae Japonicae Flos samples

從河南與河北已鑒定的共有成分中篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的成分15 個(gè)，分別為6-甲基-1-庚醇、(E)-2-戊烯醛、己醛、戊酸甲酯、4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、庚醛、己酸甲酯、苯甲醛、辛醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、1-辛醇、壬醛、丁香醛（異構(gòu)體）、萘；從河南與山東已鑒定的共有成分中篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的成分11 個(gè)，分別為2-乙基-1-戊醇、己醛、(E)-2-己烯醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、庚醛、苯甲醛、2-戊基呋喃、辛醛、壬醛、丁香醛（異構(gòu)體）；從河北與山東已鑒定的共有成分中篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的成分13 個(gè)，分別為2-乙基-1-戊醇、6-甲基-1-庚醇、(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、己醛、戊酸甲酯、(E)-2-己烯醛、己酸甲酯、(E)-2-庚醛、2-戊基呋喃、(E,E)-2，4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、丁香醛。差異性揮發(fā)成分詳細(xì)信息見(jiàn)表6。其中3 個(gè)產(chǎn)地中含量均有顯著差異的共有差異性揮發(fā)成分有2 個(gè)，為己醛和丁香醛（異構(gòu)體）。

表6 差異揮發(fā)性成分篩選結(jié)果Table 6 Screening results of differential volatile components

2.5 電子鼻結(jié)果

對(duì)不同產(chǎn)地金銀花各樣本電子鼻傳感器響應(yīng)值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如圖4-A 進(jìn)行PCA（PC1: 0.644，PC2: 0.159）分析，河北金銀花可與山東和河南的區(qū)分開(kāi)，山東和河南大致可分開(kāi)，但是有重疊部分，說(shuō)明河北金銀花的氣味與山東與河南的不同，而山東與河南金銀花的氣味有相似之處。由雷達(dá)圖（圖4-B）可知，傳感器W5S、W1S、W1W、W2W 有明顯響應(yīng)，即來(lái)自這3 個(gè)產(chǎn)地的金銀花中含有較多的氮氧化合物、短鏈烷烴、無(wú)機(jī)硫化物、芳香成分和有機(jī)硫化物，這5 類化合物也是造成不同產(chǎn)地金銀花氣味產(chǎn)生差異的重要因素。

圖4 不同產(chǎn)地金銀花電子鼻分析Fig.4 E-nose analysis of Lonicerae Japonicae Flos of different producing areas

由圖4-C 可知，河南金銀花W5S、W1S 和W1W傳感器的響應(yīng)最高，說(shuō)明河南金銀花中含有較多的氮氧化合物、短鏈烷烴和無(wú)機(jī)硫化物；山東金銀花與河南的金銀花W2W 傳感器的響應(yīng)強(qiáng)度相似，說(shuō)明兩者中芳香成分和有機(jī)硫化物含量相似；河北因金銀花4 個(gè)傳感器的響應(yīng)均最低，說(shuō)明其氮氧化合物、短鏈烷烴、無(wú)機(jī)硫化物、芳香成分和有機(jī)硫化物含量均較少。

2.6 電子舌結(jié)果

以參比溶液的輸出為味覺(jué)零點(diǎn)又稱無(wú)味點(diǎn)，因參比溶液中含有少量的酸和鹽，故酸味和咸味的無(wú)味點(diǎn)分別為?13 和?6，其他無(wú)味點(diǎn)均為0。

如圖5-A 對(duì)不同產(chǎn)地金銀花各樣本味覺(jué)值進(jìn)行PCA（PC1: 0.468，PC2: 0.254），3 個(gè)產(chǎn)地的金銀花樣品各聚為一組，說(shuō)明電子舌可對(duì)不同產(chǎn)地金銀花進(jìn)行較好的區(qū)分且3 個(gè)產(chǎn)地金銀花的味道有明顯區(qū)別。由雷達(dá)圖（圖5-B）可知，3 個(gè)產(chǎn)地金銀花均具有明顯的苦味、澀味、鮮味和甜味，這4 種味道也是造成不同產(chǎn)地金銀花味道產(chǎn)生差異的重要原因。由分組差異柱狀圖可知（圖5-C），山東金銀花的苦味、澀味、鮮味較明顯，河南金銀花的澀味、鮮味、甜味較弱，河北金銀花的苦味較弱，山東和河北金銀花的甜味相當(dāng)。據(jù)結(jié)果推測(cè)山東金銀花各味道較明顯，滋味更濃郁豐富；河北金銀花苦味、澀味較低，甜味較高，更適口；河南金銀花的味道整體較淡。

圖5 不同產(chǎn)地金銀花電子舌分析Fig.5 E-tongue analysis of Lonicerae Japonicae Flos of different producing areas

2.7 不同產(chǎn)地金銀花樣品氣味與化學(xué)成分關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)電子鼻的結(jié)果發(fā)現(xiàn)W1C、W5S、W2S 和W1W 是響應(yīng)較強(qiáng)的傳感器。為了更好地了解電子鼻傳感器與差異揮發(fā)性成分之間的關(guān)系，使用篩選出的所有差異性揮發(fā)成分（共21 個(gè)）與電子鼻4 個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的傳感器進(jìn)行pearson 相關(guān)分析。圖中紅色越深，表明正相關(guān)越強(qiáng)，即當(dāng)這些化合物的含量增加時(shí)，相應(yīng)電子鼻傳感器的響應(yīng)更強(qiáng)，藍(lán)色越深則反之。

分析結(jié)果表明，4-己烯-1-醇乙酸酯、1-己醇、苯甲醛、辛醛、1-辛醇、壬醛、丁香醛（異構(gòu)體）、萘與W1C、W5S、W2S 和W1W 的響應(yīng)值均呈較強(qiáng)正相關(guān)。(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、戊酸甲酯、乙酸甲酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮與W1C、W5S、W2S 和W1W 的響應(yīng)值均呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)。結(jié)合電子鼻各傳感器的屬性，確定了區(qū)分41 批金銀花氣味差異的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為1-己醇、苯甲醛、辛醛、1-辛醇、壬醛、丁香醛（異構(gòu)體）、萘、(E)-2-戊烯醛、1-戊醇、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮（圖6）。

圖6 電子鼻主要響應(yīng)傳感器與差異揮發(fā)性成分的關(guān)聯(lián)性分析Fig.6 Correlation analysis of main response sensors of Enose with differential volatile components

2.8 不同產(chǎn)地金銀花味道判別分析

為實(shí)現(xiàn)對(duì)新金銀花樣本產(chǎn)地的預(yù)測(cè)，使用SPSS25 對(duì)35 個(gè)金銀花樣本建立判別模型，并對(duì)HB3、HB6、HN3、HN9、SD3、SD9 號(hào)金銀花樣品的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行判別驗(yàn)證。其分類函數(shù)分別為Y1＝1.940X1＋2.326X2＋0.676X3－6.983X4＋0.894X5＋5.307X6＋0.459X7－41.033，Y2＝?1.443X1＋1.157X2＋1.447X3－4.367X4＋0.990X5＋1.214X6＋1.193X7－18.940。判別結(jié)果顯示（表7），其對(duì)河北、河南、山東金銀花能進(jìn)行有效的判別，判別識(shí)別率為100%。

表7 不同產(chǎn)地金銀花分類結(jié)果Table 7 Classification results of different Lonicerae Japonicae Flos from different producing areas samples

3 討論

中藥材的品質(zhì)與產(chǎn)地密切相關(guān)，金銀花獨(dú)特的“氣”和“味”是其重要特征，對(duì)藥材的辨識(shí)具有重要的參考價(jià)值，且金銀花中含有的多種揮發(fā)類成分，是其具有抗菌功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[6]?；诖?，本文嘗試從揮發(fā)性成分、氣味和味道多個(gè)角度結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，探討不同產(chǎn)地的金銀花的差異。

通過(guò)HS-GC-MS 分析、OPLS-DA 和單因素方差分析篩選出己醛和丁香醛（異構(gòu)體）為3 個(gè)產(chǎn)地共有的差異揮發(fā)性成分，醛類一般具有青香、果香和甜香，可對(duì)總體特征風(fēng)味起產(chǎn)生影響[7]，而己醛和丁香醛均有怡人的果香[8-9]。甜味屬里甜香、花香、果香的增強(qiáng)，可起到掩蓋和弱化苦味的效果[14]。因此可以通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)評(píng)估己醛和丁香醛是否可以作為評(píng)價(jià)金銀花風(fēng)味和質(zhì)量的指標(biāo)性成分。與傳統(tǒng)的人工鼻聞和口嘗的評(píng)價(jià)方式相比，電子鼻和電子舌具有重復(fù)性好、數(shù)據(jù)電子化、便于描述等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)氣味和味道進(jìn)行科學(xué)定量的評(píng)價(jià)[10-11]，近年來(lái)已被應(yīng)用于多種中藥的研究。研究結(jié)果顯示電子鼻和電子舌均能對(duì)不同產(chǎn)地的金銀花進(jìn)行良好的區(qū)分，說(shuō)明產(chǎn)地的不同會(huì)使金銀花樣品風(fēng)味產(chǎn)生較大差異。在未來(lái)，智能感官技術(shù)在中藥研究方面的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛和全面。

本研究采用HS-GC-MS、電子鼻和電子舌技術(shù)結(jié)合PCA 及OPLS-DA 對(duì)不同產(chǎn)地金銀花的揮發(fā)性成分、氣味和味道差異進(jìn)行研究，為金銀花產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考，對(duì)規(guī)范金銀花市場(chǎng)具有一定指導(dǎo)意義。但對(duì)以上差異形成的具體原因，本文未深入探究，后期可對(duì)不同產(chǎn)地金銀花間的差異與產(chǎn)地環(huán)境的相關(guān)性展開(kāi)深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突