胡曉鈺，蔡毓文，葉富貴，邵志敏，胡偉剛，余科達(dá)

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

乳腺癌如今已超越肺癌成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1］。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的數(shù)據(jù)，其發(fā)病率仍在以每年約0.5%的速率增長［2］。不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長因子受體2的乳腺癌為三陰性乳腺癌，占所有乳腺癌的10%～20%，是乳腺癌中預(yù)后最差的類型［3］?，F(xiàn)階段對于乳腺癌臨床上首選治療為手術(shù)治療，但對于中晚期患者而言，單獨(dú)行乳腺癌根治術(shù)效果并不理想，因此為確保病灶清除率，多對乳腺癌術(shù)后患者進(jìn)行放療，以延緩癌癥進(jìn)展［4］。

乳腺癌易感基因1（BRCA1）與乳腺癌易感基因2（BRCA2）的致病突變是乳腺癌與卵巢癌的高危因素［5-6］。中國人群中BRCA總陽性突變率為5%［4］。BRCA1和BRCA2基因的編碼產(chǎn)物在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用，即確保細(xì)胞的遺傳完整性不會因染色體DNA的意外丟失、復(fù)制或重排而受損［7］。有鑒于此，我們推測BRCA1/2基因突變在使腫瘤對放療的敏感性增加的同時也可導(dǎo)致機(jī)體對放射線的脆弱度增加，從而誘發(fā)第二原發(fā)腫瘤［8］。本研究旨在探索BRCA1/2基因胚系突變?nèi)幮匀橄侔┗颊咝g(shù)后接受放射治療是否為發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險因素。

1 資料和方法

1.1 研究對象

基于復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院三陰性乳腺癌隊(duì)列開展回顧性研究［3］，為2007年1月1日—2014年12月31日于復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：① 診斷為單側(cè)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的女性三陰性乳腺癌患者；② 基于免疫組織化學(xué)與原位雜交的方法對雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）以及人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）進(jìn)行評估。由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科的2位專家進(jìn)行評估，三陰性乳腺癌定義為ER、PR及HER2陰性。其中ER與PR陰性定義為免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果小于1%的腫瘤細(xì)胞染色陽性；HER2陰性定義為免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果為0或1 + 、或免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果為2 + 且原位雜交結(jié)果為陰性；③ 確診時未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④ 可獲得足夠的冷凍組織用于后續(xù)研究。乳腺原位癌以及炎性乳腺癌患者被排除在外。本研究所有樣本的獲得與使用均得到復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（050432-4-2108），且所有患者均簽署知情同意書。患者的臨床信息包括：手術(shù)時年齡（age_at_surgery，連續(xù)變量）、月經(jīng)狀態(tài)（menopause，分類變量）、腫瘤級別（grade，連續(xù)變量）、腫瘤大?。╯ize_cm，連續(xù)變量）、陽性淋巴結(jié)數(shù)目（LN_positive，連續(xù)變量）、是否接受化療（chemotherapy，分類變量）、手術(shù)方式（surgery，分類變量）、復(fù)旦方案分子分型（mRNA_subtype，分類變量）以及是否接受放療（radiotherapy，分類變量）。

1.2 基因檢測

從組織和匹配的白細(xì)胞樣本中制備合格的基因組DNA，用于全外顯子組測序。基于Qubit熒光分光光度計(jì)定量的DNA樣本（300 ng/樣本）首先在生物攝取器 + 超聲系統(tǒng)（Diage-node,Liege,Belgium）上破碎。破碎后的DNA使用Agilent SureSelectXT Library Prep 試劑盒（美國Agilent公司）進(jìn)行末端修復(fù)、A尾和適配器的連接。隨后，使用Agilent SureSelect Human All Exon V6（美國Agilent公司）探針捕獲準(zhǔn)備好的DNA（750 ng），并用索引引物對捕獲的文庫進(jìn)行擴(kuò)增。通過帶有DNA芯片的Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent公司）進(jìn)行質(zhì)量控制。用Qubit 3.0熒光分光光度計(jì)（美國斯巴德市英杰公司）定量分析后，在Illumina HiSeq測序平臺（美國Illumina公司）上對文庫進(jìn)行測序。對于組織來源的文庫，單通道上裝載12個樣本；對于血液來源的文庫，單通道上裝載20個樣本。

1.3 第二原發(fā)腫瘤

本研究所關(guān)注的第二原發(fā)腫瘤包括：同側(cè)及對側(cè)乳房第二原發(fā)腫瘤（對接受保乳手術(shù)患者而言，排除真性復(fù)發(fā)，但仍納入其他象限發(fā)生的乳房內(nèi)第二原發(fā)腫瘤），以及其他第二原發(fā)腫瘤（即除乳腺癌之外的任何部位的原發(fā)癌種）。末次隨訪時間為2023年2月17日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

⑴ 在非BRCA1/2胚系突變患者中，通過多元logistic回歸分析評估以下因素是否影響第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生：年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤級別、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)數(shù)目、是否化療、手術(shù)方式、分子分型（復(fù)旦四分型）、以及是否接受術(shù)后放療。模型構(gòu)建代碼主體如下：“glm(Recurrence～Age_at_surgery + Menopause + Grade + Size_cm + LN_positive + Chemotherapy + Surgery + mRNA_Subtype + Radiotherapy”

⑵ 在BRCA1/2胚系突變患者中，通過多元logistic回歸分析評估以下因素是否影響第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生：年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤級別、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)數(shù)目、手術(shù)方式、分子分型（復(fù)旦四分型）、以及是否接受術(shù)后放療。模型構(gòu)建代碼主體如下：“glm(Recurrence～Age_at_surgery + Menopause + Grade + Size_cm +LN_positive + Surgery + mRNA_Subtype +Radiotherapy)”

⑶ 對上述兩分析結(jié)果進(jìn)行交互作用分析，以判斷BRCA1/2胚系突變與術(shù)后放療是否對第二原發(fā)腫瘤有著交互作用。應(yīng)用interactionR包進(jìn)行交互作用分析。首先應(yīng)用如下代碼構(gòu)建模型“glm(Recurrence～Age_at_surgery + Menopause +Grade + Size_cm + LN_positive + Chemotherapy + S urgery + mRNA_Subtype +BRCA1.2.MUT.201607 18*Radiotherapy,family=binomial (link='logit') ,data=clinical1)”,隨后應(yīng)用interactionR進(jìn)行交互作用分析，參數(shù)設(shè)置如下: ci.type="mover",ci.level=0.95。相乘交互作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)ORA*B=OR11/(OR10*OR01)。

本研究除特殊說明外，均采用雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)且檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。所有分析均使用R語言進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象基本信息

本研究共納入292例具備BRCA1/2突變信息的女性三陰性乳腺癌患者，中位年齡52歲，94例患者術(shù)后接受放療。隨訪患者中共有7例發(fā)生了第二原發(fā)腫瘤事件（表1），其中同側(cè)乳房內(nèi)第二原發(fā)腫瘤1例，對側(cè)乳房內(nèi)第二原發(fā)腫瘤3例，其他部位第二原發(fā)腫瘤3例。

表1 研究對象基線特征Tab.1 Baseline characteristics of enrolled patients

2.2 非BRCA1/2胚系突變?nèi)巳憾嘣猯ogistic回歸

非BRCA1/2胚系突變患者共261例。多元logistic回歸分析結(jié)果顯示，患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤級別、腫瘤大小、陽性淋巴結(jié)數(shù)目、是否化療、手術(shù)方式、分子分型（復(fù)旦四分型）以及是否放療對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生均無顯著影響（表2）。

表2 BRCA1/2 非胚系突變?nèi)幮匀橄侔┗颊咧杏绊懙诙l(fā)腫瘤的多元logistic回歸分析Tab.2 Multivariate logistic regression analysis of second primary cancer in triple-negative breast cancer patients without BRCA1/2 germline mutation

2.3 BRCA1/2胚系突變?nèi)巳憾嘣猯ogistic回歸

BRCA1/2胚系突變患者共31例，多元logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤級別、腫瘤大小和手術(shù)方式等因素對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生均無顯著影響。陽性淋巴結(jié)數(shù)目［比值比（odds ratio，OR）=0.852，95% CI：0.784～0.926，P=0.007］與腔面雄激素受體（luminal androgen receptor，LAR）亞型 ［相對于基底樣免疫抑制（basal-like and immune-suppressed，BLIS）亞型，OR=0.390，95% CI: 0.285～0.534，P＜0.001］可顯著降低第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險。接受術(shù)后放療（相對于未接受術(shù)后放療：OR=2.479，95%CI：1.971～3.118，P＜0.001）以及免疫調(diào)節(jié)型（immunomodulatory，IM）亞型 ［相對于BLIS亞型），OR=1.211，95% CI：1.023～1.433，P＜0.001］可顯著增加第二原發(fā)腫瘤風(fēng)險（表3）。

表3 BRCA1/2胚系突變?nèi)幮匀橄侔┗颊咧杏绊懙诙l(fā)腫瘤的多元logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of second primary cancer in triple-negative breast cancer patients with BRCA1/2 germline mutation

2.4 交互作用

BRCA1/2胚系突變與放療對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生無顯著的交互作用（OR=9.71，95% CI：0.32～295.25；P=0.193，表4）。

表4 三陰性乳腺癌患者中，BRCA1/2突變及是否放療影響第二原發(fā)腫瘤的交互作用Tab.4 Interaction impact of BRCA1/2 germline mutation and postoperative radiation on the incidence of second primary cancer

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，BRCA1/2胚系突變患者術(shù)后接受放療可顯著地增加罹患第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險，而對于非BRCA1/2胚系突變患者術(shù)后放療不存在該效應(yīng)。BRCA1/2胚系突變與放療不存在顯著的交互作用。

BRCA1和BRCA2基因的編碼產(chǎn)物在維持基因組的穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。我們推測BRCA1和BRCA2基因突變可增加患者基因組對放射治療的脆弱度，從而提高放療后發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險。既往同類型的研究主要關(guān)注BRCA1和BRCA2基因突變對放療敏感性的影響，所關(guān)注的事件主要為放療后緩解率，且不同研究得出的結(jié)論并不一致：丁高峰等［9］回顧性分析了156例收治于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的患者，發(fā)現(xiàn)BRCA1基因突變陽性率與放療的高敏感性相關(guān)；而李賀等［10］分析112例收治于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院的非小細(xì)胞癌患者則發(fā)現(xiàn)癌組織的BRCA1基因突變陽性率越高，對放療的敏感性越差。本研究主要觀察BRCA1和BRCA2胚系突變對患者全身的影響，即放療后身體任何部位發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險。既往研究大部分未區(qū)分原發(fā)腫瘤與第二原發(fā)腫瘤。Seynaeve等［11］發(fā)現(xiàn)，與散發(fā)性乳腺癌病例相比，遺傳性病例發(fā)生同側(cè)乳腺癌的風(fēng)險在隨訪5年后顯著增高，且這些同側(cè)乳腺癌與原發(fā)腫瘤不在同一象限，提示為第二原發(fā)腫瘤。Bernstein等［12］進(jìn)行了一項(xiàng)巢式病例對照研究，結(jié)果顯示，BRCA1/2突變攜帶者接受放療并沒有增加罹患對側(cè)乳腺癌的風(fēng)險。然而，另一項(xiàng)研究數(shù)據(jù)卻提示有以下DNA損傷修復(fù)基因（BRCA1、BRCA2、CHEK2或ATM）之一突變的攜帶者與未攜帶者相比，患對側(cè)乳腺癌的風(fēng)險顯著增高［13］。這一差異可能是由入組人群特征的差異導(dǎo)致的。

本研究探討了BRCA1/2胚系突變與放療對發(fā)生第二原發(fā)腫瘤的交互作用，結(jié)果顯示，單從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果而言，與未接受放療者相比，BRCA1/2基因胚系突變患者術(shù)后接受放療可增加罹患第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險，但BRCA1/2胚系突變與放療對第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生并顯著的交叉作用，因而BRCA1/2胚系突變患者術(shù)后接受放療可能并不會增加罹患第二原發(fā)腫瘤的風(fēng)險。但值得注意的是，本研究中第二原發(fā)腫瘤事件數(shù)較少，可能降低了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析效能。本研究結(jié)論還有待更進(jìn)一步的前瞻性隊(duì)列臨床驗(yàn)證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：胡曉鈺、蔡毓文、葉富貴：文獻(xiàn)調(diào)研與整理；分析解釋數(shù)據(jù)；起草、修訂論文。邵志敏、胡偉剛、余科達(dá)：提出研究方向；對文章知識性內(nèi)容作批評性審閱；書寫論文。