王 志，侯 強，冉 崢，楊建華*

（1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054； 2.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830017）

據世衛(wèi)組織統計，目前全世界大約有15% 的育齡夫婦患不孕不育癥，由男方原因所致的不育癥比例超過50%［1］。近年來，受環(huán)境污染、社會壓力增加等因素的影響，不育癥的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢［2］。不育癥病因復雜，目前其發(fā)病機制尚未十分明確，現代醫(yī)學對不育癥的治療主要為經驗性藥物治療、手術以及輔助生殖技術，但療效不確定，且費用昂貴［3］。

毛蕊花糖苷是列當科肉蓯蓉屬植物的活性成分中含量最高的苯乙醇苷類單體化合物［4］。2020 年版《中國藥典》 收載毛蕊花糖苷為控制肉蓯蓉藥材質量的指標成分［5］。肉蓯蓉作為歷代補腎壯陽類處方中使用頻度最高的補益藥物，具有補腎陽、益精血等功效［6］。臨床實驗表明，以肉蓯蓉為君藥的名老中醫(yī)驗方可重建生殖內分泌環(huán)境的平衡，促進精子質量的提高［7］。研究顯示，肉蓯蓉苯乙醇苷能改善大鼠生殖功能指標［8］。但目前尚未見有關毛蕊花糖苷對生殖功能改善作用的研究報道。因此，本研究擬建立腺嘌呤誘導的不育癥大鼠模型，以毛蕊花糖苷給藥干預，觀察其對不育癥大鼠生殖功能的改善效果，并初步探討可能的作用機制，以期為毛蕊花糖苷治療不育癥的臨床研究奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠40 只，體質量（250±20） g，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心［實驗動物生產許可證號SCXK （新） 2021-0003］，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心SPF 屏障環(huán)境［實驗動物使用許可證號SYXK （新） 2021-0002］，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對濕度40% ～70%，每天晝夜交替，光照時間12 h，自由進食和飲水，常規(guī)適應性飼養(yǎng)1 周。本實驗依照動物實驗替代、減少、優(yōu)化的原則進行操作，符合動物倫理原則，動物實驗倫理審批號20210301-180。

1.2 藥物 毛蕊花糖苷（湖南青純科技有限公司，純度≥98%，批號516V079）； 復方玄駒膠囊（浙江施強制藥有限公司，批號20201126）。

1.3 試劑 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） （上海麥克林生化科技股份有限公司，批號2019010）； 腺嘌呤、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號J05D10104855、2307001）； 睪酮（testosterone，T）、促黃體生成素 （luteinizing hormone，LH）、促卵泡激素 （follicle stimulating hormone，FSH） ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號 8LDB6IPQ9C、FRSF2TX2IP、YXTDI1VCB3）； 促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH） ELISA試劑盒 （美國Sigma 公司，批號WXBB7889V）；4%組織細胞固定液、微管相關蛋白輕鏈3-B（ microtubule-associatedproteinlightchain3-B，LC3B）、UNC-51 樣激酶1 （ULK1） 多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司，批號BA02198228、BA09153033、AB10234578）； SDSPAGE 凝膠制備試劑盒（北京博泰斯生物技術有限公司，批號6110207）； PVDF 膜（瑞士羅氏公司，批號69290400）； 兔抗哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR抗體 （美國CST 公司，批號2983S、5536S）；cDNA 反轉錄試劑盒、TRIzol 試劑、甲醇（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號 91258333、98597501、DU644-US）； qPCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號027E2260IA）。

1.4 儀器 全波長自動酶聯免疫反應檢驗測試儀、Sorvall ST 16R 型高速冷凍離心機、實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； DWHL678 型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司）； 光學顯微鏡（江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司）； 細胞計數板（日本島津公司）； ME215S型分析天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； 包埋機（武漢俊杰電子有限公司）； 病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）； 脫色搖床（北京六一生物科技有限公司）； 電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad 公司）； PURELAB Chorus 1 Complete 型超純水儀（英國Elga 公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組（復方玄駒膠囊） 和毛蕊花糖苷低、高劑量組（50、100 mg/kg），每組8 只，大鼠給藥量按人與大鼠體表面積等效換算［9］，空白組灌胃生理鹽水（10 mL/kg），其余各組每天灌胃150 mg/kg 腺嘌呤，連續(xù)灌胃14 d 后，用大鼠代謝籠收集尿液，并計算大鼠24 h 的進食量和尿量； 與空白組比較，模型組大鼠食量減少，尿量增加，精子計數減少，血清T 水平降低，即表示造模成功。第15 天起，陽性對照組灌胃給予100 mg/kg 復方玄駒膠囊溶液，毛蕊花糖苷低、高劑量組灌胃給予50、100 mg/kg 毛蕊花糖苷，空白組和模型組灌胃給予等量生理鹽水（10 mL/kg），連續(xù)給藥28 d。

2.2 樣本采集 末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g） 進行麻醉，腹主動脈采血，全血4 ℃放置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，留取血清，分裝后保存待檢； 取血完成后處死大鼠，迅速剖取肝臟、腎臟、睪丸和附睪組織，使用生理鹽水漂洗后稱重，計算各臟器指數。肝臟、腎臟和睪丸分成2 份，一份于4% 組織細胞固定液中固定，用于病理學染色，另一份液氮速凍后于-80 ℃保存，附睪只做精子檢查。

2.3 一般情況觀察 實驗過程中觀察各組大鼠體質量變化、飲食變化、排尿變化、活動情況及精神狀況等。

2.4 精子情況檢測

2.4.1 精子計數 將附睪置于37 ℃生理鹽水中，剪開附睪孵育5 min。精子可以通過輕輕搖晃或擠壓完全游出去，然后用普通光學顯微鏡觀察精子的活力。當附睪中的精子完全游出后，用不銹鋼細胞篩過濾，反復多次，濾液以4 000 r/min 離心5 min，留取沉淀，將沉淀加入預先準備的1 mL 精子固定液中充分攪拌?；旌虾螅眉毎嫈蛋鍖舆M行計數。

2.4.2 精子活動率 計數細胞計數板上活精子數占總精子數的百分比，即為精子活動率。

2.4.3 精子指數 精子計數除以單位睪丸質量（每100 g） 即為精子指數。

2.5 血清性激素水平檢測 從冷藏室取出各試劑盒，室溫平衡30 min，同時從-80 ℃冰箱取出血清樣本放至室溫，根據相應ELISA 試劑盒說明書檢測各組大鼠血清T、LH、FSH、GnRH水平。

2.6 各臟器組織病理學檢測 取固定的組織，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制備4 μm 切片。石蠟切片用二甲苯、無水乙醇、梯度乙醇和蒸餾水處理，然后脫蠟、水化，用蘇木精染色劑染色，1% 鹽酸-甲醇分化，流水清洗，用伊紅染液染色，梯度乙醇和二甲苯脫水后，中性膠封片，于顯微鏡下觀察，收集圖像并進行分析。其中睪丸組織切片于顯微鏡下觀察生精細胞的數量和排列情況，并采用Johnsen 評分定量判定精子發(fā)生，最高10 分，精子發(fā)生正常； 得分越低，生精細胞分化越差，生精細胞的破壞也越嚴重，評分標準見表1。每只小鼠取50 根圓形切片的輸精管進行評分，取平均值進行統計分析。

表1 Johnsen 評分標準Tab.1 Johnsen scoring criteria

2.7 RT-qPCR 法檢測睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達 取于-80 ℃保存的睪丸組織，采用TRIzol 試劑盒提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，通過熒光定量PCR 儀進行檢測，2-ΔΔCT法計算mTOR、LC3B、ULK1 mRNA相對表達。引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司設計與合成，序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

2.8 Western blot 法檢測睪丸組織mTOR、pmTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達 稱取0.05 g 睪丸組織，用冰預冷PBS 洗滌，加入200 μL 裂解液，研磨勻漿，裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，移取120 μL 蛋白上清，加入5×loading buffer，混勻后變性。蛋白樣本經電泳、轉模后封閉，加一抗mTOR （1 ∶500）、p-mTOR （1 ∶500）、LC3B （1 ∶500）、ULK1 （1 ∶500）、β-actin （1 ∶5 000） 4 ℃孵育過夜，次日加二抗（1 ∶5 000）孵育90 min，ECL 法顯色、曝光，掃描底片，采用Image J 軟件對條帶灰度值進行分析，以β-actin 為內參，計算目的蛋白相對表達。

2.9 統計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠一般情況的影響模型組大鼠食量減少，尿量增加，精神萎靡，反映遲緩，嗜睡，毛質粗糙化，色稍黃，存在弓背、豎發(fā)現象，尿量增加，墊料極度潮濕，表現不育癥陽虛癥狀； 與模型組比較，給藥組大鼠食量增加，尿量恢復正常，活躍能力增強，精神好，弓背、豎發(fā)現象及墊料潮濕程度改善。

3.2 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠臟器指數的影響與空白組比較，模型組大鼠腎臟指數升高 （P＜0.05），肝臟、睪丸及附睪臟器指數無明顯變化（P＞0.05）； 與模型組比較，陽性對照組和毛蕊花糖苷各劑量組腎臟指數降低（P＜0.05），肝臟、睪丸及附睪臟器指數均無明顯變化（P＞0.05），見圖1。

圖1 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠臟器指數的影響（±s，n＝8）Fig.1 Effects of verbascoside on organ indices levels in infertile rats （±s，n＝8）

3.3 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠精子情況的影響與空白組比較，模型組大鼠精子計數、精子活動率及精子指數均降低（P＜0.05），說明造模成功； 與模型組比較，陽性對照組和毛蕊花糖苷高劑量組精子計數、精子活動率增加（P＜0.05），精子指數無明顯變化（P＞0.05），毛蕊花糖苷低劑量組精子計數、精子活動率及精子指數均無明顯變化 （P＞0.05），見圖2。

圖2 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠精子情況的影響（±s，n＝8）Fig.2 Effects of verbascoside on sperm conditions in infertile rats （±s，n＝8）

3.4 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠血清性激素水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清T、GnRH水平降低（P＜0.05），LH、FSH 水平升高 （P＜0.05），表明模型大鼠體內性激素水平嚴重失調；與模型組比較，陽性對照組和毛蕊花糖苷各劑量組大鼠血清T 水平升高（P＜0.05），FSH 水平降低（P＜0.05），GnRH 水平無明顯變化（P＞0.05），毛蕊花糖苷高劑量組大鼠血清LH 水平降低（P＜0.05），陽性對照組和毛蕊花糖苷低劑量組大鼠血清LH 水平無明顯變化（P＞0.05），見圖3。

圖3 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠血清性激素水平的影響（±s，n＝8）Fig.3 Effects of verbascoside on serum sex hormone levels in infertile rats （±s，n＝8）

3.5 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠各臟器組織病理學的影響

3.5.1 肝臟 空白組大鼠肝臟組織結構完整，而肝細胞索以中部靜脈為主要中樞，成輻射狀地完全排出，未發(fā)現變性或壞死的細胞，且細胞器構造緊密； 與空白組比較，其余各組大鼠肝組織未表現出較為突出的異常，見圖4。

圖4 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠肝臟組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig.4 Effects of verbascoside on the liver morphology in infertile rats （HE staining，×200）

3.5.2 腎臟 空白組蠶狀腎切片大小相同，未見明顯病理改變，腎小管未見異物，管腔規(guī)則； 模型組蠶狀部分面積增大，腎小管內可見大量棕黃色結晶，腎小管上皮細胞變性、壞死、崩解，表現為病變萎縮，散在囊狀擴張成空泡，炎癥細胞浸潤，顯示腺嘌呤可誘發(fā)腎實質損害； 陽性對照組蠶狀橫截面積增大； 毛蕊花糖苷各劑量組腎小球體積變小，管狀針狀棕色晶體沉積減少，上皮細胞萎縮、間質纖維化、囊性擴張及炎細胞浸潤程度均存在不同程度減輕，見圖5。

圖5 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠腎臟組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig.5 Effects of verbascoside on the kidney morphology in infertile rats （HE staining，×200）

3.5.3 睪丸 空白組生精管基底膜完好無缺，視野中層次清晰，生精細胞層豐富，支持細胞排列緊密，管腔內可見大量生精細胞，間質細胞分布均勻； 模型組生精小管基底膜破壞嚴重，細胞層次不清，排列凌亂，可見大部分細胞脫落，細胞碎片散在管腔，管腔內生精細胞欠缺，間質細胞數量極少； 陽性對照組和毛蕊花糖苷高劑量組生精管基底膜較為完整，生精細胞層相比模型組稍多，管腔生精細胞較多，間質細胞散在排列，見圖6。Johnson評分見圖7，由此可知，與空白組比較，模型組Johnson 評分降低（P＜0.05）； 與模型組比較，陽性對照組和毛蕊花糖苷各劑量組Johnson 評分均升高（P＜0.05）。

圖6 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠睪丸組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig.6 Effects of verbascoside on the testicular morphology in infertile rats （HE staining，×200）

圖7 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠睪丸Johnsen 評分的影響（±s，n＝8）Fig.7 Effects of of verbascoside on Johnsen score for testicular biopsy in infertile rats （±s，n＝8）

3.6 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠睪丸組織mTORmRNA 表達升高（P＜0.05），LC3B、ULK1 mRNA 表達降低（P＜0.05）；與模型組相比較，陽性對照組和毛蕊花糖苷高劑量組大鼠睪丸組織mTORmRNA 表達降低 （P＜0.05），LC3B、ULK1 mRNA 表達升高（P＜0.05），毛蕊花糖苷低劑量組大鼠睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05），見圖8。

圖8 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠睪丸組織mTOR、LC3B、ULK1 mRNA 表達的影響（±s，n＝8）Fig.8 Effects of verbascoside on the testicular mRNA expressions of mTOR，LC3B and ULK1 in infertile rats （±s，n＝8）

3.7 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠睪丸組織mTOR、p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠睪丸組織mTOR 蛋白表達升高（P＜0.05），p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，陽性對照組和毛蕊花糖苷高劑量組大鼠睪丸組織mTOR 蛋白表達降低（P＜0.05），p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達升高（P＜0.05），毛蕊花糖苷低劑量組大鼠睪丸組織mTOR、p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），見圖9。

圖9 毛蕊花糖苷對不育癥大鼠睪丸組織mTOR、p-mTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達的影響（±s，n＝8）Fig.9 Effects of verbascoside on the testicular protein expressions of mTOR，p-mTOR，LC3B and ULK1 in infertile rats（±s，n＝8）

4 討論

不育癥是一種男科常見疾病，因其病因復雜，目前尚無明確的治療藥物［3］。肉蓯蓉為補腎之要藥，在不育癥的治療方面優(yōu)勢顯著，而毛蕊花糖苷作為肉蓯蓉的主要功效成分，藥理作用不明確。腺嘌呤誘導的動物模型不僅出現血清激素水平的異常，并出現睪丸的損害精子數量、活動率下降，這些特征與不育癥臨床表征相一致［10-11］。因此，本研究選用腺嘌呤誘導構建不育癥模型，通過藥效學方法評價毛蕊花糖苷對不育癥生殖功能的改善作用。

腺嘌呤經體內代謝，產生大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS），致使睪丸內環(huán)境紊亂進而對性激素等生物大分子產生毒性反應［12］。下丘腦-垂體-睪丸軸 （hypothalamic-pituitary-testicular axis，HPTA） 作為男性生殖內分泌系統的關鍵環(huán)節(jié)，其中GnRH 促進LH、FSH 分泌，LH 可促進間質細胞（leydig cells，LCs） 合成T，FSH 和T 共同促進精子生成，T 通過負反饋作用調節(jié)FSH 和LH的合成和釋放，維持激素之間的相對平衡［13］。本研究顯示，模型組大鼠T、GnRH 呈現低水平，同時LH、FSH 呈現一定程度的上升趨勢； 與模型組比較，毛蕊花糖苷可通過提高T 水平，繼而對HPTA 的激素發(fā)揮正向調節(jié)作用。

不育癥的發(fā)生發(fā)展與氧化應激密切相關，ROS引起的損傷可通過自噬途徑活化，形成自噬小體，從而導致細胞微環(huán)境異常［14］。自噬是細胞拮抗應激反應、依賴溶酶體的細胞分解代謝過程，是有機生物體對不同環(huán)境自我調節(jié)的內部機制［15］。作為合成、分泌睪酮的睪丸LCs，其基礎自噬水平較高，能夠通過自噬作用維持雄性生殖功能［16-18］。ROS 誘導LCs 自噬減弱，自噬影響睪酮合成，因此對自噬發(fā)生機制的深入研究，可能是探討調控睪酮合成非經典通路新的重要線索。mTOR 是當今公認的與不育癥相關的LCs 自噬關鍵靶標［19］。當機體或細胞能量物質充裕時，激活的mTOR 磷酸化ULK1，抑制ULK1 激酶活性，從而抑制自噬； 當能量物質缺乏時，mTOR 被磷酸化，ULK1 解除抑制，促使自噬發(fā)生［20］。實驗研究證明，mTOR 被抑制后可改變睪丸的結構形態(tài)并促進其細胞自噬的發(fā)生［21］。因此，選擇自噬通路中 mTOR、pmTOR、LC3B、ULK1 作為本研究的關鍵靶點。本實驗結果顯示，給予毛蕊花糖苷后，睪丸pmTOR、LC3B、ULK1 蛋白表達升高，mTOR 蛋白表達降低，表明毛蕊花糖苷通過影響mTOR 磷酸化水平，促進ULK1 表達，使自噬增強，進而提高睪酮合成。

本實驗以腺嘌呤誘導的不育癥大鼠為研究對象，對毛蕊花糖苷的干預作用進行考察，并初步探討毛蕊花糖苷改善生殖功能的潛在作用靶點。發(fā)現毛蕊花糖苷能夠有效地提高不育癥模型大鼠體內的精子質量，改善不育癥模型大鼠身體的一般機能狀態(tài)，對腎臟、睪丸組織結構的病理性損傷有顯著的修復作用，可調節(jié)性腺軸激素水平，發(fā)揮改善生殖功能的功效，其作用機制可能與增強正性調控自噬，調節(jié)HPTA 紊亂，改善生殖功能有關。